A Procedura piccolo volume per concentrazione virale da Water
3 febbraio 2015
È stato sviluppato un approccio per identificare le condizioni ottimali di concentrazione virale per campioni d'acqua di piccolo volume utilizzando punte di adenovirus umano. Le tecniche qui descritte sono utilizzate per identificare i parametri di concentrazione per altri bersagli virali e applicate alla sperimentazione della concentrazione virale su larga scala.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottimizzare il recupero di virus dall'acqua mediante una tecnica su piccola scala originariamente progettata per ottimizzare la concentrazione dei virus. Un filtro di cellulosa in vetro si è rivelato il miglior filtro elettropositivo per concentrare l'adenovirus dall'acqua. Per l'eluzione secondaria, una tecnica di concentrazione secondaria con celite si è dimostrata la più efficace per eluire l'adenovirus dalle superfici del filtro. La tecnica risultante consente il recupero maggiore di adenovirus dall'acqua di rubinetto, in base alla percentuale di recupero più elevata osservata tra tutte le combinazioni di filtri ed eluenti testate.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la concentrazione su larga scala per volume, è che utilizza volumi di campione più piccoli, consentendo di valutare rapidamente e facilmente una molteplicità di variabili di concentrazione.
Quando ci si prepara per questo protocollo, avere a disposizione tutte le soluzioni necessarie, inclusa la soluzione virale filtrata a 0,22 micron a una concentrazione di 10-100.000 MPN per millilitro.
Iniziare misurando un litro di acqua di rubinetto sterile. Trasferirla in un becher da due litri contenente una barretta magnetica per l'agitazione. Durante l'agitazione, aggiungere 0,7 grammi di tiosolfato di sodio e lasciare che si sciolga completamente. Successivamente, regolare il pH a un valore compreso tra 7 e 7,5 aggiungendo goccia a goccia soluzioni concentrate di acido o base a molarità uno. Poi, arricchire l'acqua con il virus. Aggiungere un millilitro completo della soluzione virale preparata. Coprire il becher con una pellicola sterile e lasciare che il virus si mescoli all'acqua per 10 minuti.
Nel frattempo, preparare il filtro Millipore. Innanzitutto, rimuoverlo dall'imballaggio e verificare che si adatti perfettamente tra la coppa superiore e la griglia inferiore. Successivamente, controllare che il materiale in sughero del filtro si adatti saldamente al bordo di un pallone con bocca laterale da un litro. Ora rimuovere la coppa superiore del filtro e, con una pinzetta, posizionare un disco filtrante elettropositivo da 47 millimetri esattamente al centro della griglia filtrante. Quindi riattaccare la coppa e fissarla ruotandola in senso antiorario.
Misurare 100 millilitri di acqua di rubinetto contaminata utilizzando un cilindro sterile. Successivamente, trasferire l'acqua nel supporto del filtro preparato sulla fiala da due litri. Il disco elettropositivo nel filtro può essere in vetro-cellulosa pieghettato o in fibra di vetro nano-alluminata. Si può utilizzare un vuoto leggero per far passare l'acqua residua attraverso il filtro.
Ora, spostare il supporto del filtro in un pallone con attacco laterale da 250 millilitri. Misurare 100 millilitri di estratto di carne e versarli lentamente sul filtro. Lasciare che l'estratto passi lentamente e utilizzare una leggera aspirazione per far passare il residuo.
Procedere quindi con una delle due opzioni secondarie di concentrazione.
Per concentrare il virus utilizzando la celite, trasferire il contenuto del flacone da 250 millilitri, che contiene il virus, su un agitatore magnetico. Utilizzando una barretta magnetica, creare un piccolo vortice. Successivamente, aggiungere 0,1 grammi di polvere di celite a 100 millilitri di estratto di carne. Lasciare disperdere la celite e prepararsi a regolare il pH della soluzione. Aggiungendo goccia a goccia acido cloridrico 0,1 molare, abbassare il pH a 4,0.
Quindi lasciare miscelare la soluzione per 10 minuti. Durante la miscelazione, fissare il filtro preliminare da 47 millilitri a un pallone da due litri. Versare ora 100 millilitri della miscela di estratto di carne e celite attraverso il filtro preliminare. Può essere utilizzato un leggero vuoto per completare l'operazione.
Successivamente, posizionare una pinza metallica per tubo all'estremità del beccuccio di un alloggiamento per filtro. Alla pinza, fissare un tubo di raccolta sterile in polipropilene da 15 millilitri e quindi rimontare il filtro sul matraccio.
Ora eluire il virus dalle particelle di Celite in cinque millilitri di PBS 1X a pH 9. Lasciare che la maggior parte del PBS defluisca per gravità nel tubo da 15 millilitri ed aspirare il residuo con una leggera aspirazione. Per concentrare il virus mediante flocculazione organica, trasferire il contenuto del matraccio da 250 millilitri contenente il virus su un agitatore magnetico. Utilizzando una barretta magnetica, creare un piccolo vortice. Regolare il pH della soluzione a 3,5 aggiungendo goccia a goccia acido cloridrico 1 M. Successivamente, lasciare agitare la miscela per mezz'ora. Trasferire quindi la soluzione in un tubo conico sterile da 250 millilitri per centrifuga. Centrifugare la soluzione a 2.500 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, prestare attenzione a non disturbare il pellet durante la manipolazione dei tubi. Decantare con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS a pH 9. Assicurarsi che il pellet sia completamente disciolto. Centrifugare quindi la risospensione a 4.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere ora il soprannatante, che contiene il virus concentrato. Il pellet può essere scartato.
Nell'ottimizzazione di questo protocollo, sono stati confrontati tre tipi di celite. La celite di dimensioni maggiori ha determinato minori rese sia per ADV 40 che per ADV 41.
L'eluzione del filtro è stata testata a un pH compreso tra 7,5 e 12 per determinare il valore più efficace per il recupero delle particelle di ADV dai filtri. Il recupero più elevato è stato ottenuto utilizzando un filtro in cellulosa-vetro abbinato all'estrazione con estratto di manzo a pH 10 e con celite. Il risultato è stato lo stesso con ADV 40 e ADV 41.
L'estrazione di carne a pH 10 si è rivelata superiore alla flocculazione organica.
Il metodo ottimizzato è stato confrontato con l'aggiunta del 25% di tripsina e con l'intintegrazione dell'estratto di carne con polifosfato di sodio allo 0,1%. Nessuno dei due trattamenti ha migliorato significativamente il recupero di ADV.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti se effettuata correttamente.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per ottimizzare il recupero di virus da campioni d'acqua di piccolo volume, concentrandosi in particolare sull'adenovirus umano. L'approccio utilizza un filtro in cellulosa di vetro e una tecnica di concentrazione secondaria per migliorare i tassi di recupero.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Virologia
- Scienze ambientali
- Qualità dell'acqua
Sfondo
- La concentrazione del virus da campioni di acqua è fondamentale per il monitoraggio ambientale.
- I metodi esistenti richiedono spesso volumi elevati di campione, limitandone l'efficienza.
- L'ottimizzazione delle tecniche di recupero può migliorare il rilevamento e l'analisi dei patogeni virali.
- Il virus adenoviro umano è utilizzato come modello per testare i metodi di concentrazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare una tecnica per identificare le condizioni ottimali di concentrazione virale.
- Valutare diverse combinazioni di filtri e di eluizione per il recupero dell'adenovirus.
- Facilitare una valutazione rapida delle variabili di concentrazione utilizzando volumi ridotti di campione.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un filtro in cellulosa di vetro per la concentrazione dell'adenovirus.
- Applicazione di una tecnica secondaria di concentrazione con luce marina per l'eluzione.
- Confronto di diverse combinazioni di filtri e di tecniche di eluzione.
- Valutazione dei tassi di recupero da campioni di acqua di rubinetto.
Risultati principali
- Il filtro in cellulosa di vetro ha dimostrato i tassi di recupero più elevati per l'adenovirus.
- La tecnica secondaria di concentrazione Sea Light ha eluito efficacemente il virus.
- Volumi campione ridotti hanno permesso una rapida valutazione di multipli parametri di concentrazione.
- Il metodo ha prestazioni superiori rispetto alle tecniche tradizionali di concentrazione su larga scala.
Conclusioni
- Questa tecnica fornisce un mezzo più efficiente per recuperare virus da campioni di acqua.
- Permette un rapido test di diverse condizioni di concentrazione.
- L'approccio può essere adattato ad altri bersagli virali oltre all'adenovirus.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'ottimizzazione del recupero virale da campioni d'acqua di piccolo volume consente un rapido screening dei parametri di concentrazione, supportando lo sviluppo precoce di saggi in virologia ambientale. Il metodo fornisce un approccio scalabile ed economico per valutare combinazioni di filtri ed eluizione, riducendo il consumo di risorse nei flussi di lavoro di rilevamento di patogeni nella fase preclinica. Identificando le condizioni ottimali per la concentrazione di adenovirus, la tecnica aumenta l'affidabilità predittiva nelle applicazioni di rilevamento a valle.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi dell'efficienza di recupero virale in diversi tipi di filtro e condizioni di eluizione, supportando la validazione degli obiettivi nella rilevazione di patogeni ambientali.
- Valore operativo: Utilizza volumi di campione ridotti (1-10 L simulati con 100 mL) per testare rapidamente molteplici variabili, accelerando la formulazione di ipotesi per l'ottimizzazione della concentrazione virale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi sul recupero (percentuale di recupero di AdV40 e AdV41) per informare la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi nelle piattaforme di rilevamento virale.
- Valore operativo: Prepara sistemi biologici validati (virus concentrato in 5-30 mL) per applicazioni successive, come saggi di infettività o analisi genomiche.
- Valore strategico: Favorisce la preparazione per lo screening consentendo un confronto rapido tra filtri elettropositivi (vetro/cellulosa contro nano-allumina/vetro) e tra tecniche secondarie di concentrazione (celite contro flocculazione organica).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Utilizza l'adenovirus umano come modello rilevante per la malattia per valutare le prestazioni dei metodi di concentrazione, sostenendo lo sviluppo traslazionale di biomarcatori per patogeni idrotrasmessi.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, fornendo il virus concentrato adatto a ulteriori caratterizzazioni.
- Valore strategico: Favorisce decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, identificando combinazioni filtro-eluzione con elevato recupero (filtro in cellulosa di vetro con estratto di manzo a pH 10 e luce marina).
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica iniziale dell'ipotesi all'identificazione del ceppo in ambito di rilevamento di patogeni ambientali, consentendo un'iterazione rapida sui parametri di concentrazione prima di passare a volumi maggiori.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo a variabili di filtrazione ed eluizione per chiarire i meccanismi di rilascio del virus dalle superfici e ottimizzare l'efficienza di recupero.
- Screening: Fornisce concentrazioni di virus pronte per il saggio (5-30 mL) con risultati quantitativi (percentuale di recupero) per confrontare condizioni diverse tra tipi di filtro e additivi per l'eluizione.
- Analisi: Consente la misurazione di variabili dipendenti (recupero virale mediante qPCR o infettività) per valutare statisticamente l'impatto di variabili indipendenti (tipo di filtro, pH dell'eluizione, dimensione delle particelle di celite).
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo adenovirus concentrati adatti per la validazione successiva in colture cellulari o modelli animali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per ottimizzare la concentrazione di virus su diversi bersagli virali oltre l'adenovirus, riducendo lo sviluppo ridondante di metodi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nei metodi di recupero dei virus riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso una valutazione sistematica dei parametri del filtro e dell'eluzione.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie a passaggi definiti (eluzione con estratto di manzo, concentrazione secondaria con sea light, aggiustamento del pH a 4,0) e punti finali quantificabili (percentuale di recupero di AdV40 e AdV41).
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di saggi di rilevamento dei patogeni identificando le condizioni ottimali (filtro in cellulosa di vetro, estratto di manzo a pH 10, sea light) con il recupero osservato più elevato.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei metodi di concentrazione per programmi di monitoraggio ambientale, riducendo i fallimenti in fasi avanzate dei flussi di lavoro di rilevamento dei patogeni.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in virologia, tecniche di filtrazione e manipolazione precisa di liquidi per le fasi di aggiunta del virus, assemblaggio dei filtri e centrifugazione.
- È dipendente da strumentazione come sistemi di filtrazione a vuoto, piastre agitatrici, pH-metri, centrifughe (in grado di raggiungere 2.500 G e 4.000 G) e tubi sterili per prelievo e raccolta.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla preparazione delle soluzioni (estratto di carne, celite, HCl, PBS) e ai controlli ambientali (centrifugazione a 4°C, condizioni sterili) per garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni di adattamento quando il metodo viene applicato a diversi tipi di virus o matrici acquose, poiché l'efficienza di recupero può variare in base alle proprietà virali (ad esempio, sierotipo di adenovirus) e alla composizione del campione (acqua di rubinetto rispetto a fonti ambientali).
- I limiti pratici includono la necessità di tecnica asettica durante la manipolazione dei virus e la possibile variabilità tra lotti di filtri, che potrebbe influenzare la coerenza dell'eluzione.
