Name: Capsulare Sierotipizzazione di Streptococcus pneumoniae Da agglutinazione al lattice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Impara la sierotipizzazione capsulare di Streptococcus pneumoniae mediante agglutinazione al lattice. Questo metodo rapido e semplice non richiede microscopio ed è ideale per laboratori diagnostici.

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Questo lavoro faceva parte del progetto PneuCarriage, finanziato dalla Fondazione Bill e Melinda Gates con il contributo del Programma di Supporto alle Infrastrutture Operative del Governo del Victoria.

1 Preparazione di in-house Reagenti lattice <ol><li> Preparazione di glicina soluzione salina tamponata (GBS) <ol><li> Aggiungere 1,5 g di glicina, 11,7 g di cloruro di sodio e 100 ml di acqua distillata ad un bicchiere di vetro da 200 ml. </li><li> Mescolare per sciogliere con un agitatore magnetico. </li><li> Trasferire la miscela di un 500 ml cilindro graduato e aggiungere acqua distillata per un totale di 200 ml. </li><li> Trasferire la soluzione torna nel becher da 200 ml, controllare il pH e regolare a 8,2 con idrossido di sodio 5 M. NOTA: L&#39;idrossido di sodio è corrosivo, indossare dispositivi di protezione individuale. </li><li> Filtro sterilizzare la soluzione con 0,22 micron filtri e diversi 60 ml siringhe in una bottiglia di vetro da 250 ml con tappo a vite preautoclaved. </li><li> Conservare a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparazione di GBS con il 0,2% di siero albumina bovina <ol><li> Aggiungere 0,2 g di albumina di siero bovino (BSA) in polvere e 100 ml di GBS per un bicchiere di vetro da 200 ml e frantumarla con un agitatore magnetico. </li><li> Filtrosterilizzare la soluzione attraverso 0.22 micron filtri utilizzando diversi 60 ml siringhe in un ml preautoclaved vite bottiglia di vetro con tappo 250. </li><li> Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione del reagente lattice <ol><li> Etichettare un 2 ml rotondo provetta per microcentrifuga fondo. NOTA: rotondo tubi fondo sono utilizzati per ridurre al minimo sedimentazione delle particelle che possono influenzare l&#39;attaccamento degli anticorpi. </li><li> Usando una pipetta P1000 con punte sterili aggiungono 975 ml di GBS nella provetta per microcentrifuga, poi aggiungere 25 ml di antisiero adeguato pneumococcica per il reagente al lattice in fase di preparazione (cioè, piscina, gruppo, tipo o fattore). Inverti cinque volte per mescolare. </li><li> Diluire particelle di polistirene 01:10 con l&#39;aggiunta di 120 ml di particelle di lattice a 1.080 ml di soluzione fisiologica sterile. NOTA: Questo può essere fatto in grandi volumi, ma deve essere fatta fresca ogni volta i reagenti al lattice sono prodotti. </li><li> Aggiungere 1,000 ml di sospensione 01:10 lattice (preparato al punto 1.3.3) per l&#39;1,000 microlitri di sospensione 01:40 antisiero (preparato al punto 1.3.2). Inverti cinque volte per mescolare. </li><li> Incubare a 37 ° C su una ruota lenta rotazione (ad esempio, 4 rpm per una ruota di diametro 38,5 centimetri) per 2 ore. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 1100 x g. Eliminare il supernatante e risospendere delicatamente il pellet in 2 ml di soluzione fisiologica sterile. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 1100 x g. Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di GBS e risospendere delicatamente il pellet. </li><li> Pipettare la sospensione di lattice in un etichettati 5 ml vite ricoperto tubo. Aggiungi un altro 1 ml di GBS. </li><li> Aggiungere 2 ml di GBS contenente 0,2% di BSA (w / v) (pH 8.2) (preparata al punto 1.2). Aggiungere 40 ml di 10% (w / v) di sodio azide come conservante. NOTA: Sodio azide è pericoloso se inalato, ed è irritante per la pelle e gli occhi. È auspicabile per l&#39;acquisto di una soluzione preparata al 10% piuttosto che la forma in polvere, in quanto questo riduce al minimo il rischio di esposizione per inalazione. Dispositivi di protezione individuale (compresi i guanti unocchiali di protezione antispruzzo d) devono essere indossati quando si maneggia questo reagente. Consultare la scheda di sicurezza per ulteriori dettagli. </li><li> Conservare i reagenti al lattice a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparazione del controllo negativo reagente al lattice <ol><li> Etichettare un 2 ml rotondo provetta per microcentrifuga fondo. NOTA: rotondo tubi fondo sono utilizzati per ridurre al minimo sedimentazione delle particelle che possono influenzare l&#39;attaccamento degli anticorpi. </li><li> Usando una pipetta P1000 con punte sterili aggiungono 975 ml di GBS nella provetta per microcentrifuga, quindi aggiungere 25 microlitri normale antisiero di coniglio. Inverti cinque volte per mescolare. </li><li> Procedere come nei punti 1.3.3 a 1.3.10 sopra </li></ol></li></ol> 2 Controllo Qualità (QC) di lattice Reagenti <ol><li> Portare reagente al lattice a RT. Immediatamente prima dell&#39;uso, mescolare delicatamente il reagente al lattice capovolgendo la provetta diverse volte. </li><li> Controllare reagente per autoagglutinazione pipettando 15 microlitri su un vetrino da microscopio in vetro e procedere come nei passi 4.7 e 4.8 qui di seguito. Non ci dovrebbe essere ungglutination delle particelle di lattice. Il reagente dovrebbe apparire bianca e liscia. </li><li> Testare il reagente contro un gruppo di basso passaggio isolati di pneumococco. Utilizzare le culture fresche coltivate preparato come al punto 3 Il pannello di isolati dovrebbe includere isolati del sierotipo &#39;obiettivo&#39; (il sierotipo specifico per il reagente in fase di test) e sierotipi &quot;non bersaglio&quot; (isolati di altri sierotipi che non dovrebbero normalmente attraversare reagire con il reagente). Includere almeno un isolato di ciascun bersaglio e non bersaglio sierotipo per ogni reagente al lattice in fase di controllo di qualità. Se vi è un solo bersaglio o non bersaglio sierotipo, prova due diversi isolati di particolare sierotipo. NOTA: Il pannello di test dovrebbe includere diversi isolati di ciascun sierotipo, alcuni dei quali sono rari in malattia invasiva e / o tipo di collezioni di colture. È preferibile includere alcuni carrozza isolati, in quanto sono spesso più impegnativo sierotipo (dati non mostrati), così testare ulteriormente la capacità of i reagenti e garantire che i reagenti sono probabili in grado di sierotipizzazione sia invasivo e isolati carrozza. </li><li> Procedere con il test di reagenti al lattice con bersaglio e non bersaglio pneumococco isolati secondo il metodo descritto nei passaggi 3 e 4. </li><li> Reagenti di controllo della qualità al momento della produzione e poi in seguito almeno annualmente. NOTA: Se un reagente non passa QC, il lotto deve essere scartato e una nuova preparazione fatta. In caso di guasto si consiglia di ripetere il controllo di qualità dei reagenti essere prodotti usando i metodi alternativi descritti in Ortika et al., 2013 8 e nella discussione di seguito. </li></ol> 3 Preparazione delle Culture pneumococco per la sierotipizzazione <ol><li> Utilizzando un&#39;ansa sterile selezionare una singola colonia del pneumococco isolare e realizzato questo su un solido non selettivo agar sangue in modo che l&#39;inoculo primario si estende per circa un terzo della superficie della piastra. Streak per singole colonie. NOTA: Piatti preparati con sangue defibrinato di cavallo o di pecora sono adatte; ma le piastre di sangue preparati con sangue umano o di sangue animale citrato non sono. </li><li> Incubare la piastra O / N a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2. </li><li> Osservare la crescita sulla piastra per la purezza e valutare che vi sia una crescita sufficiente per sierotipizzazione. NOTA: Una cultura pura dell&#39;isolato pneumococco è necessario per sierotipizzazione. Nella nostra esperienza, confluenti, o in prossimità confluenti crescita che copre circa un terzo della superficie della piastra è di solito sufficiente per completare sierotipizzazione. Come culture pneumococco possono essere soggette a autolisi, culture preparati per la sierotipizzazione devono essere testati entro 24 ore della sottocultura. Non prendere la piastra di coltura fuori dell&#39;incubatore più di 15 a 20 minuti prima sierotipizzazione inizio. </li></ol> 4. L&#39;esecuzione di agglutinazione al lattice Sierotipizzazione <ol><li> Rimuovere tutti i reagenti al lattice dal frigorifero e permettere loro di scaldare a temperatura ambiente per circacir- ca 30 min. Immediatamente prima dell&#39;uso, capovolgere delicatamente i tubi per mescolare i reagenti. </li><li> Etichettare un vetrino da microscopio. </li><li> Mettere 15 ml di reagente di controllo negativo in lattice sul vetrino da microscopio. </li><li> Utilizzando un usa e getta ciclo 1 ml sterile prendere una spazzata della cultura pneumococco in modo che il ciclo è di circa mezzo pieno. </li><li> Spalmare delicatamente l&#39;inoculo sulla superficie del vetrino vicino alla goccia di reagente di controllo negativo lattice. L&#39;inoculo dovrebbe essere visibile sul vetrino. </li><li> Mescolare velocemente e accuratamente l&#39;inoculo nel reagente di controllo negativo in lattice utilizzando il loop. Assicurarsi che la goccia non si diffonde oltre la sua dimensione iniziale. </li><li> Raccogliete la diapositiva, tenendolo ad entrambe le estremità. Rock the scorrere avanti e indietro per 1 min. Fare attenzione a mantenere il liquido si muove lentamente, e assicurare che la dimensione della goccia non aumenta. NOTA: In alternativa, utilizzare un rocker piatto. </li><li> Osservare per agglutinazione macroscopica (cioè,occhio nudo) e compensazione della sospensione contro uno sfondo nero. </li><li> Se il reagente di controllo negativo non mostra alcuna agglutinazione al lattice o di compensazione continuare testare la cultura, sostituendo i reagenti al lattice per la negativa reagente al lattice controllo nei passaggi 4,1-4,8 sopra. Un ciclo fresco deve essere utilizzato ogni volta. Procedere con il test dei reagenti al lattice che iniziano con le piscine. </li><li> Prova ciascuno dei &quot;pool&quot; reagenti al lattice in successione fino ad ottenere un test positivo. NOTA:. L&#39;ordine delle prove delle piscine può essere fatto in &quot;round&quot; per riflettere l&#39;incidenza locale di particolari sierotipi (ad esempio, testando per le tre piscine più probabili sulla prima diapositiva Se non si ottiene una reazione positiva, allora prova il prossimo tre più probabile delle restanti piscine sulla seconda slitta, e così via fino ad ottenere una reazione positiva). Questo assicura che i sierotipi più comuni sono testati prima, riducendo al minimo il tempo e reagenti necessari. </li><li>Usando la chiave del produttore antisieri determinare quali antisieri individuali sono rappresentati nella piscina positivo. </li><li> Prova ciascuno dei gruppi o tipi contenuti nella piscina positivo individualmente per determinare il &#39;gruppo&#39; o &#39;tipo&#39; come nei passaggi 4,1-4,8 sopra. </li><li> Determinare il risultato con riferimento alla chiave del produttore antisieri. Se un &#39;tipo&#39; è determinato (ad esempio, sierotipo 5), quindi nessun ulteriore test è necessario e questo risultato viene registrato. </li><li> Se un &#39;gruppo&#39; è determinato (ad esempio, gruppo 19), quindi fare riferimento alla chiave produttori per determinare i fattori da testare. Continuare il test con i singoli reagenti al lattice &#39;Factor&#39; e determinare il sierotipo finale (ad esempio, sierotipo 19B). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Agglutinazione del lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per la sierotipizzazione pneumococco. Reagenti di agglutinazione al lattice pneumococco commerciali sono disponibili, ma attualmente non permettono di distinguere tutti pneumococcica noto sierotipi 10,12. Tuttavia, i reagenti di agglutinazione al lattice possono essere facilmente prodotte in-house usando antisieri acquistato sollevata contro specifici antigeni capsulari pneumococco. Nel metodo descritto qui, gli anticorpi sono passivamente collegati a particelle di lattice per fare una serie di reagenti di agglutinazione al lattice. Una reazione positiva lattice si verifica quando gli anticorpi specifici legati alle particelle di lattice si attaccano agli antigeni sulla capsula del polisaccaride pneumococcico isolare 18,19. Le particelle di lattice allegate agli anticorpi consentire la reazione specifica antigene-anticorpo per essere visualizzato senza ingrandimento. Latex agglutinazione è un metodo adatto per i laboratori ad alto rendimento di und anche per i poveri di risorse. I principali vantaggi del metodo di agglutinazione al lattice sono che nessuna attrezzatura specializzata è necessario per eseguire il test, i reagenti hanno una durata di almeno 2 anni se conservato a 4 ° C 8, e che è poco costoso, semplice e veloce da eseguire. Sierotipizzazione un isolato da pneumococco agglutinazione al lattice impiega circa 10 minuti, e fino a quattro reagenti al lattice può essere testato in parallelo su una diapositiva. Inoltre, se la prevalenza dei sierotipi è noto per l&#39;impostazione epidemiologico rilevante, il test può essere eseguito in turni che iniziano con le piscine che contengono i sierotipi più comuni in modo simile alla prova Quellung 17. Questo approccio riduce al minimo il numero di prove necessarie per determinare il sierotipo. Il metodo è anche altamente riproducibile tra diversi operatori (dati non mostrati). Uno svantaggio di agglutinazione al lattice sierotipizzazione è che la produzione di reagenti molto tempo, prendendo circa 4 ore; anche se Reage multiplanti può essere facilmente prodotta in parallelo. Inoltre, alcuni antigeni sono comuni tra i diversi sierotipi di pneumococco, causando reazioni crociate con alcuni antisieri (ad esempio, sierotipo 29, 42 e Gruppo 35). Tuttavia, queste reazioni trasversali sono ben caratterizzati quando si utilizzano antisieri commerciali (che di solito è preabsorbed per eliminare gli anticorpi cross-reagenti più problematici) e le tabelle di reazione aggiuntivi sono forniti dal produttore, al fine di distinguere quale sierotipo è presente. Reagenti al lattice può anche attraversare reagire se gli anticorpi non sono allineati correttamente sulle particelle di lattice; questi vengono rilevati come errori di QC. Nella nostra esperienza, rigoroso controllo di qualità è fondamentale per il successo di questo metodo, anche quando antisieri disponibili in commercio vengono utilizzati per la produzione. QC richiede circa 15 minuti per ogni reagente e si basa su una serie di appropriate QC isolati come descritto sopra. Il metodo qui descritto si traduce in reagenti che danno una positiva reazione ben wisottile il periodo di prova. Nella nostra esperienza, i falsi positivi sono rari nella pratica (dati non riportati). Occasionali reazioni false negative si osservano; di solito si riferiscono a problemi noti con un particolare antisiero (ad esempio, sierogruppo 6 isolati non possono reagire con piscina B antisiero), o down regulation dell&#39;espressione capsula da parte l&#39;isolato. Utilizzando il algrorithm sierotipizzazione fornito dal produttore è anche importante, come nella maggior parte dei casi una falsa reazione positiva o negativa porterà a un risultato &#39;finale cieca&#39;. In questi casi, e quando le reazioni sono di difficile interpretazione, si consiglia di ripetere il test e / o prove con un metodo alternativo, come la reazione Quellung. Alcuni la risoluzione dei problemi è a volte necessario per rendere reagenti al lattice soddisfacenti. Nel metodo qui descritto, l&#39;anticorpo è attaccato a particelle di lattice tramite adsorbimento passivo 15,19, quindi una variabile critica è la concentrazione di anticorpo utilizzato, che determina quanto benela superficie delle particelle di lattice è coperto e il conseguente allineamento delle anticorpali siti attivi 15,20. Di conseguenza, se l&#39;anticorpo insufficiente o in eccesso è collegato alle particelle di lattice, le reazioni antigene-anticorpo non saranno ottimali, e reagenti insoddisfacenti possono essere prodotti 15,20,21. Come titoli anticorpali variano tra i diversi lotti di antisieri, un set standard di diluizioni non può produrre i reagenti che eseguono bene 8. Un utile punto di partenza è quello di utilizzare una diluizione 1:40 di antisiero, e se questo non è successo, diluire ulteriormente l&#39;antisiero. Nella nostra esperienza questa di solito si risolve il problema 8. In un piccolo numero di casi reagenti possono mostrare agglutinazione debole che non è accompagnato dalla compensazione della sospensione durante il test con l&#39;obiettivo di isolare. In questi casi la diluizione di antisiero non migliora la qualità del reagente, ma reagenti soddisfacenti possono solitamente essere prodotti omettendo la centrifugazione e lavaggio passi 8,22 </sup&gt;. Legate agli anticorpi particelle di lattice sono utilizzati comunemente in microbiologia diagnostica per la rilevazione, l&#39;identificazione o la sierotipizzazione di molti microbi diversi 15,20. Come tale, il metodo qui descritto può essere adatto per la preparazione di reagenti al lattice per altri scopi, a condizione antisieri adatto è disponibile e di adeguate procedure di controllo di qualità sono adottati.

Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nei bambini sotto l&#39;età di cinque anni, in particolare in contesti poveri di risorse 1,2 in tutto il mondo. Gamme di malattia pneumococcica da infezioni localizzate a condizioni di pericolo di vita come la polmonite, la sepsi e la meningite 1,2. Più di 90 sierotipi di pneumococco sono stati identificati sulla base di differenze nella loro polisaccaride capsulare 3. Vaccini attuali di mira il polisaccaride capsulare e forniscono protezione dalle principali sierotipi che causano malattia invasiva 4. Sierotipizzazione pneumococco isolati è importante per valutare l&#39;impatto della vaccinazione sulla carrozza e le malattie, oltre a fornire informazioni più ampie epidemiologiche 5,6. L&#39;attuale metodo di &#39;gold standard&#39; per la sierotipizzazione pneumococco è la prova Quellung, ma richiede tempo e richiede una certa abilità a perform 7. Agglutinazione al lattice è un metodo alternativo sierotipizzazione raccomandata dall&#39;Organizzazione mondiale della sanità 7. Agglutinazione del lattice è veloce e semplice da eseguire, ed è impiegato in molti laboratori in tutto il mondo 8-11. È importante sottolineare che, di agglutinazione al lattice ha mostrato un&#39;accuratezza paragonabile alla prova Quellung per la sierotipizzazione pneumococco 10,12-14. Nel complesso, questo metodo è ideale per gli ambienti poveri di risorse, nonché i laboratori ad alto rendimento. Reagenti di agglutinazione al lattice (latex &#39;reagenti&#39;) sono creati mediante l&#39;applicazione di anticorpi a particelle di lattice 15. In una reazione positiva, queste particelle etichettate agglutinano in presenza di antigene specifico. Reagenti al lattice commerciali sono disponibili per una gamma limitata di sierotipi. Reagenti al lattice possono anche essere preparati in casa utilizzando antisieri disponibili in commercio 10. Miscele di antisieri (&#39;pool&#39;), così come antisieri specifici per s pneumococcoerogroups (ad esempio, gruppo 19), i singoli sierotipi (ad esempio, sierotipo 5), e di antigeni specifici («fattori», ad es., fattore 19c riconoscendo sierotipo 19A) per definire ulteriormente i sierotipi all&#39;interno dei gruppi sono disponibili 16. Questo manoscritto descrive le principali fasi della produzione di reagenti al lattice utilizzano attaccamento passivo commercialmente disponibile antisieri di particelle di lattice. Il controllo di qualità (QC) aspetti di questo metodo sono descritti, e un protocollo per l&#39;utilizzo di reagenti al lattice per la sierotipizzazione pneumococco è incluso.

<table><tbody><tr><td>Microparticelle a base di polistirene, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>O altri volumi secondo necessità</td></tr><tr><td>Siero di coniglio normale</td><td>Anticorpi Australia&nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>O altri volumi secondo necessità, portare a RT prima dell'uso</td></tr><tr><td>Pneumococco (Neufeld) antisieri</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Vari</td><td>Portare a RT prima dell'uso <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Portare a rRT prima dell'uso</td></tr><tr><td>Soluzione di sodio azide al 10% (v/v)&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>Attenzione: pericoloso se inalato; irritante per la pelle e gli occhi</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Fondo rotondo</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Anelli di inoculazione monouso calibrati 1 &; l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Attenzione: altamente corrosivo</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per agar di sangue di cavallo (HBA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Portare a RT prima dell'uso <a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td></tr><tr><td>Ruota rotante</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo con tappo a vite a fondo piatto in polistirene, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>60 ml siringhe senza aghi</td><td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP unità filtro siringa, 0,22 &micro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Brochure su Neufeld antisieri</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Chiave per determinare i sierotipi <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>Chiave per il siero del fattore pneumococcico</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>Per determinare il sierotipo all'interno di Groups <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>*sono disponibili fonti alternative per la maggior parte dei materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capsulare sierotipizzazione di<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; da agglutinazione al lattice

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

I reagenti per agglutinazione al lattice sono ampiamente utilizzati nella diagnosi microbica, nell'identificazione e nella sierotipizzazione. Lo Streptococcus pneumoniae (lo pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. I vaccini attuali prendono di mira la capsula pneumococcica e ci sono oltre 90 sierotipi capsulari. La sierotipizzazione degli isolati pneumococcici è quindi importante per valutare l'impatto dei programmi di vaccinazione e per scopi epidemiologici. L'Organizzazione Mondiale della Sanità ha raccomandato l'agglutinazione al lattice come metodo alternativo al test di Quellung "gold standard" per la sierotipizzazione degli pneumococchi. L'agglutinazione al lattice è un metodo relativamente semplice, rapido ed economico; ed è quindi adatto sia per ambienti poveri di risorse che per laboratori con carichi di lavoro ad alto volume. I reagenti per l'agglutinazione del lattice possono essere preparati internamente utilizzando anticorpi di origine commerciale che si legano passivamente alle particelle di lattice. Questo manoscritto descrive un metodo di produzione e controllo di qualità dei reagenti per l'agglutinazione del lattice e descrive in dettaglio un approccio di test sequenziale che è efficace in termini di tempo e costi. 
Questo metodo di produzione e controllo qualità può essere adatto anche per altri scopi di test.

Una reazione positiva si verifica quando lattice anticorpo specifico tipo allegata alla particella di lattice si lega alla capsula del pneumococco, e agglutinazione delle particelle anticorpo marcato Segue 15. Figura 1A mostra una reazione positiva che si caratterizza per agglutinazione visibile e compensazione dello sfondo sospensione. Una reazione negativa è caratterizzata dalla sospensione reagente al lattice restante liscio e bianco (Figura 1B). I reagenti sono ottimizzati in modo che una reazione positiva deve osservare prima della fine dell&#39;intervallo di tempo di un minuto (generalmente rilevabili in circa 20 sec). Noi non consigliamo di leggere le reazioni dopo l&#39;intervallo di tempo 1 min. Molto raramente, reazioni mostrano agglutinazione debole intorno al bordo della goccia che non sia accompagnato dalla compensazione della sospensione sfondo, o apparire &#39;filante&#39; senza sfondo clearing (dati non riportati). Questi sono più come<html> reazioni negative ly. In questi casi, si consiglia di ripetere le prove e / o ulteriori indagini utilizzando un altro metodo sierotipizzazione (per esempio la reazione Quellung 17). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Le reazioni di agglutinazione al lattice positive e negative. Preparazioni dei pneumococcica isolare mescolati con il reagente di agglutinazione al lattice che mostra una reazione positiva (A) o una reazione negativa (B). Agglutinazione accompagnato dalla compensazione dello sfondo si vede nella reazione positiva (A) .C&#39;è nessuna agglutinazione visibile con il reagente di controllo negativo lattice o in una reazione test negativo (B). Fotografie 8 utilizzati con il permesso.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Test di agglutinazione al lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per sierotipizzazione Streptococcus pneumoniae, ed è anche stato ampiamente applicato in microbiologia diagnostica. Questo manoscritto descrive la produzione interna dei reagenti di agglutinazione al lattice, procedure di controllo della qualità e l&#39;applicazione di questa tecnica per sierotipizzazione pneumococco.

Capsulare Sierotipizzazione di<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Da agglutinazione al lattice

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sierotipizzare isolati di Streptococcus pneumoniae utilizzando antisieri legati a particelle di lattice. Il primo passo del sierotipaggio S consiste nel testare un isolato pneumococcico contro il reagente di controllo negativo al lattice. Il secondo passo della procedura prevede di testare l'isolato pneumococcico con i reagenti in pool di lattice finché non viene osservata una reazione positiva.Il terzo passaggio consiste nel testare l'isolato con i gruppi e i tipi presenti nel pool positivo, utilizzando la chiave fornita dal produttore degli antisieri per selezionare i reagenti appropriati da utilizzare. L'ultimo passaggio prevede il test dell'isolato con tutti i reagenti al lattice necessari, seguito dall'interpretazione dei risultati mediante la chiave del produttore degli antisieri per determinare il sierotipo finale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come il test que, è che non richiede l'uso del microscopio ed è relativamente semplice e rapida da eseguire.Dimostrerà questa procedura Belinda, assistente di ricerca del nostro laboratorio. Etichettare innanzitutto un tubo microcentrifuga da due millilitri. Sceglierne uno con fondo rotondo per aiutare a prevenire il deposito di particelle durante la fase di legame dell'anticorpo.Utilizzando una pipetta da 1000 microlitri, aggiungere 975 microlitri di soluzione salina tampone al glicine nel tubo. Quindi aggiungere 25 microlitri dell'antisiero antipneumococcico necessario per il reagente al lattice che viene preparato. Capovolgere il tubo cinque volte per mescolare; successivamente diluire 120 microlitri di particelle di lattice di polistirene in 1080 microlitri di soluzione salina fisiologica sterile.Rovesciare questo cinque volte per miscelare 1000 microlitri della sospensione di lattice nella soluzione di antisiero da 1000 microlitri. Rovesciare cinque volte per miscelare, quindi trasferire in un incubatore a 37 gradi Celsius e posizionare su una ruota che ruota lentamente. Lasciare incubare la miscela per due ore; al termine dell'incubazione, centrifugare le particelle a 1.100 × g per 15 minuti.Rimuovere il soprannatante con una pipetta da 1000 microlitri. Scartare il soprannatante e risospendere il pellet in due millilitri di soluzione salina sterile. Centrifugare nuovamente la miscela, scartare il soprannatante e risospendere il pellet lavato in un millilitro di soluzione salina tampone glicina.Trasferire la sospensione in un tubo con tappo a vite da cinque millilitri e aggiungere un ulteriore millilitro di soluzione salina tampone glicina. Aggiungere ora due millilitri di soluzione salina tampone glicina contenente lo 0,2% di BSA. Quindi aggiungere 40 microlitri di azide di sodio al 10%.Come conservante, assicurarsi di seguire la scheda dati del materiale. Precauzioni di sicurezza nell'uso dell'azoturo di sodio. Successivamente, consultare la chiave fornita dal produttore dell'anticorpo per determinare gli isolati di controllo qualità appropriati da testare rispetto al reagente.Quindi testare il reagente utilizzando questi isolati di sierotipo controllo positivo e negativo. I test di controllo qualità sono molto importanti. Il processo garantisce che sia stato prodotto un reagente che reagisce correttamente, un passaggio di controllo essenziale. Conservare i reagenti che hanno superato il controllo qualità a quattro gradi Celsius.Iniziare preparando le colture. Utilizzando un’ansa sterile, selezionare una singola colonia e inoculare un terzo di una piastra di agar sangue non selettivo. Successivamente, effettuare lo striato della piastra per ottenere colonie singole.Incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, prima dell'inizio di SYP, rimuovere i reagenti in lattice dal frigorifero e lasciarli raggiungere la temperatura ambiente.Rimuovere la piastra dall'incubatore. La coltura deve essere pura e la crescita deve essere confluenza o quasi confluenza. Su oltre un terzo della piastra, capovolgere più volte il reagente in lattice del controllo negativo.Rimuovere 15 microlitri e pipettarli su un vetrino etichettato. Quindi, utilizzando un’ansa sterile da un microlitro, prelevare un campione dalla coltura fino a quando la parte centrale dell’ansa risulti circa mezza piena. Spalmare delicatamente il contenuto dell’ansa caricata sul vetrino, vicino alla goccia del reagente di controllo negativo.L'inoculo dovrebbe essere visibile sul vetro. Quindi, utilizzando l'ansa, mescolare l'inoculo nella goccia del reagente in lattice. Evitare di spalmare la goccia sulla lametta.Sollevare entrambe le estremit&agrave; del vetrino e agitarlo delicatamente avanti e indietro. Mantenere il liquido in lenta rotazione e cercare di evitare che la goccia si espanda sul vetrino. Continuare ad agitare il vetrino per un minuto, quindi leggere il risultato.I risultati sono rossi su uno sfondo scuro. La goccia del reagente di controllo negativo non deve cambiare, senza alcuna agglutinazione o schiarimento. Una volta stabilito che non vi è alcuna reazione con il reagente di controllo negativo, iniziare a testare ciascuno dei reagenti al lattice del pool finché non si ottiene una reazione positiva.Utilizzare la stessa procedura e un nuovo loop sterile per ogni reagente. Di solito vengono testati tre pool su ogni vetrino. Agitare delicatamente il vetrino per un minuto prima di valutare la reazione.Una reazione positiva al lattice si verifica quando anticorpi specifici legati alle particelle di lattice si uniscono alla capsula dello pneumococco e segue una glutenazione delle particelle marcate. Questo fenomeno è generalmente accompagnato da una certa schiarita della sospensione di fondo. Una reazione negativa è caratterizzata dalla sospensione del reagente al lattice che rimane liscia e bianca, senza agglutinazione né schiarita.Occasionalmente, alcune reazioni probabilmente negative mostrano un'agglutinazione più debole lungo il bordo della goccia, senza un concomitante schiarimento della sospensione di fondo. Altre reazioni probabilmente negative appaiono filamentose, senza alcuno schiarimento di fondo in entrambi questi due casi ambigui. Ripetere il test oppure provare un diverso metodo di stereotipizzazione.Una volta ottenuta una reazione positiva, utilizzare la chiave del produttore per determinare quali gruppi o tipi sono presenti nella miscela del pool. Successivamente, testare i gruppi o i tipi che compongono questo pool con l'isolato fino a osservare una reazione positiva. Se un tipo viene identificato, non è necessario effettuare ulteriori test.Tuttavia, se viene identificato un gruppo, consultare la chiave del produttore per determinare quali fattori devono essere testati al fine di identificare il sierotipo. Una volta ottenuti i risultati dei test dei fattori, consultare nuovamente la chiave per determinare il sierotipo finale. Una volta padroneggiata, questa semplice e poco costosa tecnica può essere utilizzata per il sierotipaggio.Un isolato pneumococcico viene ottenuto in 10 minuti se la procedura viene eseguita correttamente. Stiamo conducendo questa procedura. È importante ricordare di utilizzare anelli sterili e punte di pipetta fresche per ciascuno dei test, in modo da non causare contaminazioni incrociate né nei test né nei reagenti.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere un'idea chiara di come preparare e utilizzare reagenti in lattice per la sierotipizzazione. Il pneumococco.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un metodo efficace per valutare l'esposizione superficiale di proteine ​​leptospiral è descritto. Il metodo è specificamente progettato per evitare l'interruzione della membrana esterna delle cellule fragili leptospiral. Questa tecnica richiede l'impiego di diversi controlli negativi per valutare l'integrità della membrana esterna e la specificità della reazione anticorpale.

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Questo video dimostra un test di aderenza all'opsono per esaminare l'interazione tra batteri opsonizzati e cellule immunitarie. I batteri marcati in fluorescenza, trattati con siero di prova contenente anticorpi anti-capsula, vengono incubati con macrofagi. Dopo aver colorato i macrofagi con la fluorescenza, i batteri attaccati sulla superficie dei macrofagi vengono osservati al microscopio per la visualizzazione.

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Sperimentale trasporto pneumococcica umana offre un modello naturale di trasporto e un possibile modello per l'uso nello sviluppo dei vaccini. Questa tecnica è utile ancora complessa e comporta un rischio clinico introducendo un agente patogeno in un essere umano. Abbiamo sviluppato un protocollo dettagliato.

Sperimentale trasporto pneumococco umano

La reazione Quellung è la tecnica gold standard per sierotipizzazione Streptococcus pneumoniae. Questa tecnica utilizza un microscopio e specifico antisieri pneumococco ed è comunemente usato in riferimento e laboratori di ricerca in tutto il mondo.

Capsulare Sierotipizzazione di<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilizzo della reazione Quellung

Lo Streptococcus pneumoniae forma lesioni microscopiche discrete non purulente nel cuore. Viene delineato il protocollo per un modello murino di formazione di microlesioni cardiache. Vengono fornite istruzioni sulla visualizzazione delle microlesioni mediante microscopia, sulla discriminazione tra microlesioni precoci e tardive e sui metodi per rilevare il rimodellamento cardiaco nei cuori degli animali convalescenti.

Visualizzazione<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Entro cardiache microlesioni e successive rimodellamento cardiaco

Questo test di uccisione anticorpli viene utilizzato per confrontare la capacità delle cellule fagocitiche immuni di rispondere e uccidere i batteri basati su diversi trattamenti e/o condizioni. Classicamente, questo test serve come il gold standard per valutare le funzioni effettrici degli anticorpi alzati contro un batterio come opsonina.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

L'espansione del codice genetico viene applicata per l'introduzione di un amminoacido innaturale che porta un gruppo funzionale biorthogonale su una proteina portante in un sito definito. La funzione biorthogonale viene ulteriormente utilizzata per l'accoppiamento site-selective di un antigene di carboidrati per fornire un vaccino glicoconi coniugato omogeneo.

Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dall'incorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale

Il saggio opsono-aderenza è un metodo alternativo al saggio di uccisione opsono-fagocitica per valutare le funzioni opsoniche degli anticorpi nello sviluppo del vaccino.

Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati

Qui, descriviamo un sierotipo 1 di S. pneumoniae ceppo 519/43 che può essere geneticamente modificato utilizzando la sua capacità di acquisire naturalmente DNA e un plasmide suicida. Come prova di principio, è stato creato un mutante isogeno nel gene della pneumolisina (compensato).

Costruzione di mutanti nel sierotipo 1 Streptococcus pneumoniae ceppo 519/43

Nell'infezione da Mycoplasma pneumoniae, i test sierologici possono generare buoni risultati, ma con bassa specificità a causa della reazione crociata immunologica. L'ELISA interno per la cattura dell'antigene, descritto in questo articolo, garantisce un'elevata specificità delle specie e ha dimostrato di essere un test di screening affidabile per una diagnosi accurata di M. pneumoniae.

Saggio immunoassorbente legato all'enzima di cattura dell'antigene per la rilevazione specifica di Mycoplasma pneumoniae

Un sistema di analisi del flusso di fluorescenza a doppio reporter a tre canali è stato utilizzato per sviluppare un test immunologico multiplex basato su microsfere che valuta simultaneamente i campioni di siero per IgG e IgM suscitati contro più antigeni di diverse specie di Borrelia che causano la borreliosi di Lyme in Europa e Nord America.

Rilevamento simultaneo di diverse classi di anticorpi in un test sierologico multiplexato

Impara la sierotipizzazione capsulare di Streptococcus pneumoniae mediante agglutinazione al lattice. Questo metodo rapido e semplice non richiede microscopio ed è ideale per laboratori diagnostici.

Capsulare Sierotipizzazione di

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