Cell Analyzer a base di impedenza in tempo reale come strumento per delineare molecolari meccanismi coinvolti nella neurotossicità e neuroprotezione in una linea cellulare neuronale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare una tecnica basata sull'impedenza per seguire la citoprotezione in tempo reale di una linea cellulare neuronale per delineare il coinvolgimento delle vie del secondo messaggero nel processo di protezione. Ciò si ottiene coltivando prima una linea cellulare neuronale in condizioni proliferative in un analizzatore cellulare in tempo reale basato sull'impedenza. Nella seconda fase, potenzialmente rilevante.

Le seconde vie messaggere sono inibite farmacologicamente prima di sottoporre la linea cellulare a trattamenti neuroprotettivi. Successivamente, lo stato della linea cellulare neuronale viene seguito utilizzando un analizzatore cellulare in tempo reale nelle diverse condizioni sperimentali. In definitiva, l'analisi statistica può essere utilizzata per valutare il coinvolgimento in tempo reale delle vie del secondo messaggero nella citoprotezione delle cellule neuronali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi di neurotossicità degli endpoint, è che consente di valutare la protezione e la tossicità di Tito in linee cellulari neuronali in tempo reale e in condizioni di assenza di marcatura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande rapide nel campo della neurobiologia molecolare contribuendo a una valutazione più elevata del rendimento di potenziali composti neuroprotettivi in vitro e fornendo informazioni sui meccanismi molecolari coinvolti nella neuroprotezione. Ad esempio, qui, le cellule del neuroblastoma umano S-K-N-S-H vengono utilizzate con PBS, quindi tripsina nelle cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Rimuovere la tripsina per centrifugazione e quindi risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno di proliferazione. Dopo aver contato le cellule, diluire le cellule a una concentrazione di tre volte 10 al quinto di cellule per millilitro con più terreno di proliferazione, quindi equilibrare ogni pozzetto di un EPL 96 con 100 microlitri di terreno di proliferazione in una cappa di coltura tissutale a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, inserire l'EPL 96 in una stazione di analisi cellulare in tempo reale in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius e avviare il software dell'analizzatore di cellule in tempo reale.

Quindi, nella pagina di layout, selezionare i pozzetti appropriati per l'esperimento e inserire il tipo di cella, il numero di cella e i nomi e le concentrazioni dei composti chimici di interesse nelle caselle di modifica nella pagina del software di pianificazione, poiché il passaggio uno è preimpostato. Per la misurazione dello sfondo, selezionare aggiungi un passaggio e impostare il passaggio due per misurare l'indice delle celle ogni 15 minuti per 96 ore. Quindi fare clic su Avvia per avviare il passaggio uno e misurare l'impedenza di fondo del supporto.

Ora rimuovi l'EPL e aggiungi 100 microlitri della sospensione cellulare di neuroblastoma. Per ogni pozzetto sperimentale, agitare delicatamente l'EPL 96 per rivestire uniformemente i pozzetti, quindi incubare la piastra a temperatura ambiente nella cappa di coltura tissutale per consentire alle cellule di depositarsi dopo mezz'ora, caricare nuovamente l'EPL 96 nella stazione di analisi cellulare in tempo reale e iniziare la fase due. Per monitorare i valori dell'indice delle celle durante l'esperimento, visualizzare le curve delle celle nella pagina del grafico e i dati dell'indice delle celle grezze nella pagina dell'indice delle celle per 24 ore.

Dopo aver piastrato le celle, mettere in pausa l'esperimento e rimuovere la piastra dalla stazione di analisi delle celle in tempo reale. Erogare un microlitro degli inibitori di interesse appena diluiti in ciascun pozzetto, quindi, dopo aver ricaricato l'EPL 96, riprendere le misurazioni sperimentali dell'indice cellulare dopo 30 minuti, mettere nuovamente in pausa l'esperimento e rimuovere rapidamente ma con attenzione il mezzo di proliferazione da ciascun pozzetto, dirigendo il bordo della punta della pipetta verso l'angolo del pozzetto per evitare di interrompere lo strato cellulare aderente. Quindi aggiungere immediatamente 200 microlitri di terreno di deprivazione sierica a ciascun pozzetto, un microlitro dei composti neuroprotettivi di interesse appena diluiti e un microlitro degli inibitori della via del secondo messaggero di interesse ai pozzetti appropriati.

Quindi continuare con le misurazioni dell'indice cellulare ogni 15 minuti per 96 ore come precedentemente impostato per analizzare i dati, ora selezionare l'indice cellulare normalizzato e le funzioni del tempo normalizzato nella pagina del grafico per normalizzare l'indice cellulare all'ultimo punto temporale prima delle modifiche alla coltura cellulare. Per ridurre la variazione tra gli esperimenti. Evidenziare i pozzetti nella pagina del tracciato per le condizioni sperimentali di interesse e fare clic su aggiungi per tracciare le curve dell'indice delle celle normalizzate.

Quindi esporta i dati sperimentali per tutti i punti temporali dell'indice cellulare dalla pagina del software dell'indice cellulare in un file di foglio di calcolo per l'analisi statistica delle differenze nei valori dell'indice cellulare nelle diverse condizioni di trattamento in punti temporali specifici. Selezionare i valori dell'indice delle celle in corrispondenza dei rispettivi punti temporali all'interno del file del foglio di calcolo esportato. Infine, analizzare i valori dell'indice cellulare per i punti temporali selezionati con un'analisi della varianza a uno o due vie, seguita da un test post hoc Utilizzando software statistico, gli stimoli neurotossici per le cellule portano ad una diminuzione dei valori dell'indice cellulare, qui un aumento dell'indice cellulare quando le cellule S-K-N-S-H vengono coltivate nel mezzo di proliferazione e la caduta dell'indice cellulare seguita da una stabilizzazione ai nuovi livelli più bassi dopo Il passaggio delle cellule al mezzo di deprivazione sierica è mostrato in questi grafici.

Si può osservare l'effetto neuroprotettivo di due agonisti del recettore della serotonina a, cinque micromolari, DOI e 20 micromolari IDE aggiunti quando le cellule sono state alimentate con deprivazione sierica, mezzo. Una domanda importante negli studi di neuroprotezione è se un effetto sulla proliferazione cellulare contribuisca all'effetto del composto osservato sulla sopravvivenza cellulare. In questo grafico, viene mostrata la mancanza di effetto del trattamento DOI a cinque micromolari sulla proliferazione delle cellule SKNS, suggerendo che la proliferazione non contribuisce all'effetto neuroprotettivo osservato.

In questo grafico finale, si può osservare l'effetto del trattamento con 10 micromolari dell'inibitore iniziale delle tre chinasi fosfatidil-chinasi LY 2 9 4 0 0 2 sulla sopravvivenza cellulare e l'effetto neuroprotettivo del DOI sulle cellule SK NSH prive di siero. LY 2 9 4 0 0 2 ha impedito l'effetto neuroprotettivo del DOI durante la fase di deprivazione sierica, ma ha anche mostrato un effetto tossico proprio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come seguire la protezione CTO in una linea cellulare neuronale utilizzando un analizzatore cellulare in tempo reale e di delineare il coinvolgimento delle vie del secondo messaggero nella protezione.