Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api
July 21st, 2014
Registrazioni simultanee extracellulari lungo termine provenienti da due diversi neuropiles cerebrali o due diversi tratti anatomici sono stati stabiliti nelle api. Queste registrazioni permettono lo studio di aspetti temporali del trattamento neuronale attraverso diverse aree cerebrali del singolo neurone, così come a livello di complesso in un animale comportarsi.
L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il rivestimento olfattivo e la formazione della memoria utilizzando l'accesso a lungo termine a due fasi di elaborazione neuronale indipendenti all'interno di api mellifere che si comportano. Ciò si ottiene assemblando prima elettrodi multicanale a basso costo da micro fili di rame isolati e supporti su misura. Il passo successivo è quello di preparare un'ape vivente rimuovendo una sezione della sua capsula cranica per inserire due elettrodi trattati con un colorante fluorescente nel cervello esposto.
Il terzo passo consiste nel registrare le due pillole o tratti neuro indipendenti nel percorso olfattivo, stimolando con odori floreali e feromoni. Successivamente, dopo aver sezionato il cervello, un diverso tracciante fluorescente viene iniettato nel lobo dell'antenna per riempire i neuroni bersaglio. Le tracce di riempimento e i tracciati degli elettrodi vengono quindi visualizzati per produrre una ricostruzione tridimensionale dell'architettura neuronale.
In definitiva, le relazioni nel rivestimento degli odori tra le due popolazioni di neuroni a diversi livelli di elaborazione, come il lobo dell'antenna e il corpo del fungo, possono essere meglio comprese utilizzando queste tecniche. Quindi i principali vantaggi di questa tecnica dei metodi esistenti sono che i nostri elettrodi multicanale sono molto piccoli e possono essere utilizzati in combinazione, il che significa che possiamo registrare contemporaneamente in diverse aree del cervello dopo essere stati ancorati. I fili flessibili consentono un richiamo stabile per diverse ore negli animali che si comportano.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuropatologia, come capire come gli animali ricevono, percepiscono e infine calcolano le fabbriche di olf nella vita dal loro ambiente. Questa tecnica di doppia registrazione può fornire informazioni sul meccanismo alla base della codifica degli odori e delle reti neuronali in generale. Può anche essere applicato ad altri organismi modello negli invertebrati o nell'affezione e nella neurobiologia.
In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è necessario molto allenamento per identificare i neuroni delle api utilizzando solo punti di riferimento morfologici come il lobo interno o il lobo verticale del corpo del fungo. Per questo protocollo, costruire un adattatore per elettrodi per adattarsi a una scheda di interfaccia per elettrodi standard. Per prima cosa saldare tre brevi pezzi di fili isolati a un connettore a 18 pin.
Quindi tagliare un pezzo di lastra di plexiglass e inserire una scanalatura poco profonda lungo il lato più lungo. Quindi, avvitare le alette di saldatura nella piastra di plexiglass e incollare la piastra sulla parte superiore del connettore. Quindi collegare la base alle alette utilizzando i tre fili corti.
Quindi posizionare un capillare di vetro nella scanalatura della lastra di plexiglass. Il capillare dovrebbe essere in grado di scorrere ed essere fissato da una vite Utilizzando un perno minuzioso, estendere il capillare di vetro verso l'esterno di circa cinque millimetri. Il capillare e il perno verranno utilizzati per sostenere e stabilizzare i microfili dell'elettrodo.
Quindi, posiziona tre microfili. Con l'aiuto di nastro adesivo per un migliore accesso, il capillare di vetro può essere rimosso utilizzando una colla per ago da saldatura a 12 volt. I fili insieme alla cera dentale LMP non incollano l'ultimo terzo dei fili.
Ora collega questo gruppo di microfili multicanale all'adattatore dell'elettrodo. Posizionare il capillare di vetro esteso parallelamente ai microfili. Fissare questo attacco con cera dentale lungo il capillare di vetro sovrapposto e il perno minuzioso.
Quindi tagliare i fili dell'elettrodo lasciando due o tre centimetri che si estendono dal perno minuzioso e due o tre centimetri che si estendono dall'estremità dell'elettrodo. Quindi, fissare il capillare nell'adattatore dell'elettrodo e utilizzare una vite per stabilizzare tutto in posizione. A 360 gradi Celsius.
Saldare le estremità dei fili perpendicolarmente alle alette. Quindi verificare che ci sia un contatto elettrico sufficientemente forte controllando che la loro impedenza sia di circa 300 kilo ohm a un kilohertz. Collegare ora i canali del secondo adattatore per elettrodi all'elettrodo master e saldare gli elettrodi di riferimento e muscolari alla base degli elettrodi master.
Infine, montare l'elettrodo master sulla scheda di interfaccia dello stadio principale. Fissare il secondo elettrodo su un adattatore separato dopo aver ottenuto che le api mellifere ne raffreddino uno sul ghiaccio fino a quando non è immobilizzato. Quindi, fissa l'ape in un supporto in plexiglass standard con la testa esposta.
Applicare la cera dentale riscaldata alla base degli occhi e alla giunzione tra la testa e il torace, fissando così la testa. Continuare a utilizzare la cera per immobilizzare l'occhio scapo delle antenne sulla capsula della testa. Evita di applicare la cera sul fagel, che deve essere rivolto in avanti.
Il Pro Bois deve essere esente da urti. Controlla che possa muoversi. Ora radere la capsula della testa per migliorare l'accessibilità.
Quindi nutri l'ape con tutto il 30% di saccarosio che consumerà. Ciò garantisce una buona preparazione, vitalità e idratazione dei tessuti. Ora usando un micro bisturi, taglia verticalmente lungo il bordo dell'occhio e orizzontalmente sopra le basi dell'antenna.
Continuare a tagliare sotto l'occhio della cellula O e rimuovere la cuticola allentata. Le ghiandole ipofaringee devono essere spostate di lato, così come la trachea. In questo modo si libererà il percorso per l'inserimento dell'elettrodo.
Iniziare con l'inserimento dell'elettrodo di riferimento, un filo d'argento da 35 micron. Per prima cosa, fai un piccolo taglio nell'occhio composto omolaterale. Quindi infilare l'elettrodo attraverso di esso.
Quindi, inserire il secondo filo nella regione di proiezione muscolare sotto l'occhio laterale della cellula O. Per visualizzare successivamente le posizioni degli elettrodi, immergere gli elettrodi in una soluzione di cloruro di potassio 0,5 molare e Alexa Hydrocyte 4 88 al 5% per tre minuti. Successivamente, utilizzando micro manipolatori, posizionare i due elettrodi nel cervello.
Orientarsi identificando il lobo dell'antenna e il lobo verticale del corpo del fungo. Qui un elettrodo si trova nel tratto del lobo dell'antenna laterale profondo 180 micron e l'altro nel tratto del lobo dell'antenna mediale. Inserito a circa 300 micron di profondità.
Completare il posizionamento degli elettrodi ancorandoli utilizzando due componenti. Il silicio copre l'intero spazio sopra il cervello, il che impedirà anche ai tessuti di seccarsi. Quindi procedere con le registrazioni per estrarre l'attività unitaria dal segnale extracellulare registrato.
Utilizzare il software di smistamento delle punte disponibile. Utilizzare i canali differenziati degli elettrodi. Applica simultaneamente le tecniche di corrispondenza dei modelli su tutti e tre i canali degli elettrodi per rilevare diverse combinazioni di forme d'onda che tengono conto degli eventi di picco singolo.
E infine, il controllo per una corretta separazione dell'unità. Utilizzando l'analisi delle componenti principali sugli eventi di picco singolo dei tre canali elettrodici differenziati registrati. Dopo aver effettuato le registrazioni, rimuovere con cura il silicone e gli elettrodi dall'ape.
Quindi, sciacquare il cervello con una soluzione di suoneria per api e rimuovere le ghiandole e la trachea. Quindi, utilizzando una micropipetta, iniettare nel lobo dell'antenna, il 5% di micro rubino disciolto in un molare di acetato di potassio. Questo fornirà un'etichetta anterograda alle tracce del lobo.
Da qui in poi, esegui tutti i passaggi nella massima oscurità. Sciacquare nuovamente il cervello con le suonerie per api, tre volte, e lasciare incubare il colorante per 30-45 minuti. Immobilizzare l'ape facendola raffreddare in frigorifero.
Quindi isola il cervello. Fissare il cervello in para aldeide al 4% in PBS 0,1 molari durante la notte a quattro gradi Celsius e con una leggera agitazione. Dopo aver riempito i neuroni di proiezione nel lobo dell'antenna con un tracciante a micro rubino, è stata assemblata una vista di proiezione di questi neuroni da sezioni ortogonali lungo l'asse Z.
Il colorante Alexa Hydrocyte 4 88 sui due elettrodi mostra il loro inserimento al tratto del lobo dell'antenna mediale e nel tratto del lobo dell'antenna laterale. Una ricostruzione 3D delle cellule bersaglio colorate e dei siti di inserimento degli elettrodi è stata utilizzata per realizzare uno schema delle due traiettorie dei tratti del lobo dell'antenna, la registrazione simultanea dai due tratti del lobo dell'antenna mentre stimolava l'ape con diverse concentrazioni di odore, è stata utilizzata per studiare l'elaborazione temporale. L'attività è stata valutata nelle successive fasi di elaborazione.
L'analisi dei principali componenti dei neuroni di proiezione del lobo dell'antenna e dei neuroni estrinseci dei vettori della popolazione illustra che l'odore nei neuroni di proiezione era prolungato e durava più a lungo dello stimolo. Al contrario, nella popolazione di neuroni estrinseci, erano rappresentati solo i tipi di odore acceso e odore. Quindi, osservando l'attività con il tempo, la popolazione di neuroni estrinseci a destra mostra un'attività di separazione degli odori leggermente prima che la popolazione di neuroni di proiezione inizi a sviluppare la loro attività indotta dagli odori.
La stimolazione degli odori è contrassegnata in grigio. Una volta padroneggiato, ci vogliono circa 30 minuti per costruire un elettrodo. La preparazione dell'ape e l'inserimento degli elettrodi nelle regioni target possono essere eseguiti in un'altra mezz'ora se eseguiti correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ogni passaggio richiede molta pratica e pazienza prima di essere padroneggiato. Prestare particolare attenzione quando si sollevano i fili degli elettrodi verso i punti di connessione e si registra dalla portata del cervello desiderata. È richiesta una solida conoscenza dell'anatomia del cervello delle api mellifere dopo il suo sviluppo.
Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della neuropatologia e dell'olfatto degli insetti di esplorare le precise relazioni temporali tra l'attività di diversi percorsi neuronali e i centri cerebrali nelle api mellifere comportanti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire e utilizzare elettrodi a microfilo multicanale per registrare contemporaneamente da due regioni del cervello e dalle api mellifere che si comportano. Dovresti anche essere in grado di visualizzare le posizioni esatte dei tuoi elettrodi di registrazione.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo per registrazioni extracellulari a lungo termine simultanee da due diversi neuropile cerebrali nelle api. La tecnica consente l'indagine dell'elaborazione neuronale attraverso distinte aree cerebrali sia a livello di singolo neurone che di ensemble in animali in attività.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Elettrofisiologia
- Biologia Comportamentale
Background
- Comprendere l'elaborazione olfattiva nelle api è cruciale per acquisire informazioni sulla formazione della memoria.
- I metodi precedenti non avevano la capacità di effettuare registrazioni simultanee da più aree cerebrali.
- Le api servono come organismo modello per studiare reti neuronali complesse.
- Investigare i meccanismi di codifica degli odori può migliorare la nostra comprensione dell'elaborazione sensoriale.
Obiettivo dello studio
- Studiare il rivestimento olfattivo e la formazione della memoria nelle api.
- Sviluppare una tecnica per registrazioni simultanee da diverse fasi di elaborazione neuronale.
- Comprendere le relazioni nella codifica degli odori tra popolazioni di neuroni.
Metodi utilizzati
- Costruzione di elettrodi multicanale a basso costo da microfili di rame isolati.
- Preparazione delle api per l'inserimento degli elettrodi rimuovendo una sezione della capsula cefalica.
- Registrazione dell'attività neuronale mentre si stimola con odori floreali e feromoni.
- Visualizzazione dell'architettura neuronale attraverso traccianti fluorescenti e ricostruzione 3D.
Risultati principali
- Registrazioni simultanee di successo dal lobo antennare e dal corpo a fungo.
- Comprendimento migliorato dei meccanismi di codifica degli odori nelle api.
- Dimostrazione di stabilità degli elettrodi multicanale per registrazioni prolungate.
- Fornitura di informazioni sulle reti neuronali coinvolte nell'elaborazione olfattiva.
Conclusioni
- Questa tecnica permette una comprensione più profonda di come le api elaborano le informazioni olfattive.
- Può essere adattata per l'uso in altri organismi modello in neurobiologia.
- Le applicazioni future potrebbero affrontare questioni chiave in neuropatologia ed elaborazione sensoriale.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables simultaneous long-term extracellular recordings from two distinct neuronal processing stages in behaving honeybees, providing a unique capability to investigate temporal dynamics in olfactory processing pathways. By capturing multi-unit activity from both the antennal lobe and mushroom body—or parallel tracts connecting them—researchers can de-risk mechanistic hypotheses about sensory integration and memory formation. The approach supports predictive confidence in target validation by revealing how odor-evoked signals propagate across brain regions over time, informing translational models of neural circuit function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking odor-evoked activity across sequential neuropils to clarify pathway-specific contributions to behavior.
- Operational Value: Provides stable, multi-channel recordings over many hours, reducing variability in longitudinal target engagement studies.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing sustained versus transient neuronal responses, informing target selectivity and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, time-resolved neurophysiological outputs that can serve as biomarkers for compound effects on olfactory processing.
- Operational Value: Uses differentially amplified micro-wire electrodes to minimize noise and verify signal origin, enhancing assay reproducibility.
- Scalability: Electrode assembly from insulated copper wires allows low-cost, replicable preparation for multi-condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early sensory processing in the antennal lobe to higher-order integration in the mushroom body, modeling perceptual-to-memory transformation.
- Predictive Confidence: Reveals temporal dissociation in odor responses between neuron populations, supporting biomarker alignment for cognitive or sensory-modulating compounds.
- Disease-Relevant System: Offers a genetically tractable invertebrate model to study conserved principles of sensory gating and adaptive filtering.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum by enabling hypothesis-driven interrogation of neural circuit dynamics, supporting lead identification through functional readouts of target engagement, and informing preclinical decisions via mechanistic de-risking of sensory processing pathways.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by comparing activity in antennal lobe (early processing) and mushroom body (integration center) during odor stimulation.
- Screening: Delivers reproducible, multi-unit extracellular recordings that allow comparison of compound effects across independent neuronal tracts.
- Analytics: Employs spike sorting, template matching, and principal component analysis to resolve single-spike events and population-level dynamics.
- Translational Research: Connects immediate odor responses to longer-term neuronal plasticity, relevant for modeling learning and memory processes.
- Enterprise Reuse: Electrode design is adaptable across model organisms and brain regions, promoting platform-level standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing how odor identity and timing are represented across sequential processing stages.
- Operational Value: Electrode flexibility enables stable recordings in behaving animals for hours to days, improving data yield and reducing attrition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation in vivo, decreasing reliance on surrogate endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on temporal coding fidelity in sensory pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in honeybee brain anatomy and microsurgical techniques for head capsule preparation and electrode targeting.
- Depends on micro-manipulation tools, fluorescent tracers, and spike sorting software for signal validation and 3D reconstruction.
- Necessitates standardization across teams for electrode impedance testing (~300 kΩ at 1 kHz) and reference electrode placement.
- Adaptation to other model systems requires adjustment of electrode size, insertion depth, and brain stabilization methods.
- Practical limitations include the need for extensive training to identify neuronal tracts via anatomical landmarks and the invasiveness of chronic implantation.
