Immagini dal vivo di Drosophila larvali neuroblasti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dettagliare la dissezione del SNC intatto dalla terza larva di Instar oph. Al fine di studiare le divisioni asimmetriche delle cellule staminali, il differenziamento cellulare e la morfogenesi. Ciò si ottiene espiantando prima il SNC dal corpo larvale mediante dissezione grossolana.

Il secondo passo consiste nell'isolare il cervello intatto dai tessuti periferici mediante microdissezione fine utilizzando strumenti su misura. Successivamente, i cervelli sani vengono montati per l'imaging di cellule vive o sottoposti a fissazione chimica e immunofluorescenza, infine la microscopia confocale a disco rotante viene utilizzata per mostrare gli eventi che governano le divisioni delle cellule staminali neurali e fornire informazioni meccanicistiche per lo sviluppo del SNC. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro delle cellule staminali e dello sviluppo neurale.

Contribuendo alla nostra comprensione di come viene regolata la proliferazione delle cellule staminali, sappiamo che la divisione delle cellule staminali ABER è associata alla tumorgenesi e alla microcefalia e i nostri studi di imaging rivelano i meccanismi che regolano queste divisioni delle cellule staminali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché la microdissezione e il montaggio del cervello sono difficili da imparare in quanto richiedono mani ferme, pazienza e pratica. Iniziare questa procedura mettendo due gocce di mezzo di dissezione caldo su un singolo vetrino, una per la dissezione grossolana e l'altra per la dissezione fine.

Quindi trasferire diverse larve in una delle gocce di terreno. Successivamente, trasferire il vetrino con le larve in un microscopio da dissezione. Ora ingrandisci la goccia contenente le larve in modo che le estremità anteriore e posteriore delle larve siano visibili.

Afferra la regione centrale di una singola larva con un paio di pinze e afferra un'altra regione proprio accanto ad essa con un secondo paio di pinze. Quindi strappare le larve a metà. Ripetere le procedure per tutte le larve sul coperchio, scivolare e smaltire le metà posteriori.

Ingrandisci una larva in modo che gli uncini anteriori della bocca siano chiaramente visibili. Successivamente, praticare una piccola incisione o tacca sul lato opposto dei ganci della bocca larvale tra la terza banda toracica e la prima banda CLE addominale. Quindi, afferra i ganci della bocca con la pinza.

Staccare delicatamente la cuticola in direzione anteriore e posteriore e continuare fino a quando il SNC non è esposto. Quindi strappare i tessuti per isolare il SNC dal resto delle larve. Fare attenzione a non danneggiare il SNC e scartare i campioni danneggiati con un cordone nervoso ventrale strappato o lobi ottici distorti.

Ripetere le procedure per tutte le larve sul vetrino coprioggetto. Quindi trasferire il tessuto sano espiantato nell'altro terreno pulito. Far cadere il vetrino coprioggetto per una dissezione fine.

Utilizzare i perni di dissezione per rimuovere i tessuti periferici dal cervello. Fai scorrere il bisturi tra il cervello e il tessuto indesiderato e fissa il tessuto connettivo al vetrino. Usa il gancio per stuzzicare delicatamente il tessuto indesiderato e contemporaneamente premi il bisturi sul vetrino coprioggetti con movimenti altalenanti.

Lavora lentamente e deliberatamente per rimuovere tutti i dischi da ogni cervello. Prestare attenzione a non disturbare la morfologia del cervello. Un cervello sano avrà un cordone nervoso ventrale intatto e lobi ottici rotondi simmetrici.

Ora capovolgere una piastra di coltura permeabile ai gas da 50 millimetri con una pellicola trasparente rivolta verso l'alto e depositare una piccola goccia di terreno al centro della piastra. Quindi, usa un gancio per raccogliere i cervelli sotto i lobi ottici e trasferirli sulla goccia di terreno sul piatto uno per uno. Raccogli da cinque a 10 cervelli nella goccia di medium.

Quindi spingili verso il fondo uno per uno, poiché molti di loro rimarranno intrappolati nel menisco in seguito. Orientare il cervello per consentire l'imaging del neuroblasto per visualizzare il neuroblasto ventrale anteriore. Posizionare il cervello con il cordone nervoso ventrale rivolto verso l'alto, allineare il cervello in modo tale che tutti i cordoni nervosi ventrali puntino nella stessa direzione all'interno del piano XY.

Utilizzare una siringa o una pipetta di trasferimento in plastica per posizionare quattro gocce di olio di carbonio sulla membrana permeabile al gas. Il volume di ogni goccia di olio dovrebbe essere equivalente tra loro e alla goccia del mezzo. Una volta completate, le cinque gocce assomiglieranno alle cinque sfaccettature dei dadi in stile occidentale.

Quindi, abbassare un vetrino coprioggetto sul gruppo in modo che colpisca tutte e cinque le gocce contemporaneamente. Mantenere una pressione uniforme sui campioni riduce la probabilità che vengano interrotti. Attendi circa tre minuti.

Poiché l'olio e il fluido si disperdono sotto il peso del vetrino coprioggetto sotto un cannocchiale da dissezione. Abbassare ulteriormente il vetrino coprioggetti sulla superficie del cervello rimuovendo il terreno in eccesso con uno stoppino di carta velina fino a quando il vetrino coprioggetti non tocca, il cervello non si eccede in quanto ciò causerà la distorsione dei tessuti o l'esplosione cerebrale del neuroblasto ventrale anteriore. Il vetrino coprioggetto deve essere leggermente spostato in direzione delle punte del cordone nervoso ventrale.

Questo provoca la rotazione del cervello, che porta i lobi cerebrali a diretto contatto con il vetrino coprioggetto per facilitare l'imaging, successivamente sigillato la camera da enc. Il vetrino coprioggetto con una piccola quantità di olio al carbonio halo. L'olio in eccesso che trasuda dal vetrino coprioggetti deve essere ridotto al minimo e asciugato con un fazzoletto.

Prima dell'imaging. Aggiungere una goccia di olio da immersione al vetrino coprioggetti appena sopra i cervelli montati per aiutare a centrare l'obiettivo direttamente sopra il campione. Posizionare delicatamente il campione montato nell'incubatore a 25 gradi Celsius e coprire la camera con il coperchio.

Successivamente, localizza il neuroblasto cerebrale centrale utilizzando la luce trasmessa concentrandoti sulle grandi cellule rotonde che risiedono nelle aree centrale e mediale dei lobi ottici. Una volta in posizione, effettuare esposizioni rapide utilizzando il confocale per determinare la posizione e la profondità corrette del neuroblasto. Limitare la profondità ai primi 10-15 micrometri.

Regolare secondo necessità e scattare un'altra immagine di prova. Per eliminare la deriva assiale, utilizzare un dispositivo di messa a fuoco automatica continua che utilizza un LED a infrarossi o correggere manualmente il piano focale. Una volta identificato un neuroblasto di interesse, ottimizzare tutti i parametri prima dell'imaging.

Ora immagina l'intero neuroblasto raccogliendo da 12 a 14 immagini distanziate di un micrometro sull'asse Z. Regola la risoluzione temporale per catturare cicli cellulari singoli o multipli dello stesso neuroblasto. Utilizzare intervalli da 10 a 32 per l'imaging di cicli cellulari singoli e intervalli da uno a tre minuti per cicli cellulari multipli.

Successivamente, confermare che il campione sia sano monitorando la durata della mitosi. Se la mitosi dura più di 15 minuti, passa a un altro cervello. Un cervello sano mostrerà molti neuroblasti all'interno dello stesso campo visivo, subendo diversi cicli di mitosi.

Una volta completato l'imaging, smontare la camera di incubazione e scartare tutto tranne i piatti di coltura permeabili ai gas. Sciacquare la superficie della piastra di coltura con etanolo al 95% e pulire l'olio con un fazzoletto. Ripetere la procedura altre due volte.

Qui è mostrata l'imaging dal vivo delle divisioni delle cellule staminali dei neuroblasti in preparazioni di montature intere. Queste sono le immagini time-lapse di un singolo ciclo cellulare da un neuroblasto che esprime GFP Mosin per l'analisi cellulare fine, un singolo ciclo cellulare di neuroblasti viene ripreso a meno di 32 intervalli di tempo. E queste sono le immagini time-lapse dei cicli successivi di divisione cellulare da un neuroblasto che esprime sia il marcatore centrosoma marcato G-F-P-M-O che A GFP.

Per visualizzare più cicli cellulari di neuroblasti. I cervelli vengono in genere visualizzati a intervalli di tempo da uno a tre minuti per un periodo di due o tre ore. Le proiezioni confocali di cellule staminali fissate da preparazioni per montature domestiche sono mostrate qui.

Per visualizzare tutti i neuroblasti situati su entrambi i lobi ottici, viene utilizzato un ingrandimento 20x. Questa analisi è particolarmente utile per esaminare la morfologia cerebrale complessiva e per quantificare il numero di neuroblasti. La maggior parte dei neuroblasti provenienti da un singolo lobo ottico può essere visualizzata con un ingrandimento di 40x.

Per un'analisi cellulare dettagliata di alcuni neuroblasti, è necessario utilizzare un ingrandimento 100x. Questo neuroblasto mutante mostra più centrosomi su ciascun polo del fuso. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare danni alla foto limitando la quantità di luce che colpisce il campione.

Questa tecnica di imaging delle divisioni di neuroblasti vivi in preparazioni di montature intere ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali per esplorare la divisione cellulare asimmetrica nel contesto nativo vivo del cervello di drosofila in via di sviluppo.