Una guida per In vivo Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere registrazioni di singole unità extracellulari di alta qualità da interneuroni corticali in topi che esprimono la radice del canale due. Ciò si ottiene facendo avanzare un elettrodo di registrazione ad alta impedenza attraverso il tessuto per identificare gli interneuroni dalle risposte di picco agli impulsi di luce blu. Il segnale elettrico viene monitorato per rilevare eventuali variazioni che indicano la velocità di avanzamento appropriata e la probabilità di ottenere una registrazione stabile e ben isolata.

Se non è possibile ottenere un buon isolamento di una singola unità o, al contrario, si incontrano raramente neuroni sensibili alla luce, sostituire l'elettrodo di registrazione. I risultati mostrano l'affidabilità della luce che evoca risposte da neuroni identificati otticamente e il tipico rapporto segnale/rumore ottenuto con questa strategia. L'approccio della fotostimolazione è un modo accessibile ed economico per indirizzare tipi di cellule geneticamente identificati utilizzando un amplificatore extracellulare standard e la luce blu.

Questa è la nostra strategia per sfruttare specifici neuroni interni nell'anestetizzare la corteccia uditiva, ma i punti più generali si applicano ad altre aree corticali rispetto ai tipi di cellule sparse Per iniziare questa procedura. Dopo che l'animale è stato anestetizzato con un cocktail di ketamina meine tramite iniezione intraperitoneale, posizionarlo in un apparecchio stereotassico o in un altro apparecchio per il supporto della testa, assicurarsi che il cranio sia ben fissato. Questo è essenziale per mantenere stabili le registrazioni di singole cellule.

Successivamente, applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza e mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 gradi Celsius per eseguire un drenaggio sternale CI per una maggiore stabilità di registrazione, rimuovere il tessuto dal cranio posteriore con una lama di bisturi per esporre lo sterno magna CI. Quindi fai una piccola incisione nella Dora con la punta della lama per drenare il liquido cerebrospinale. Ora usando il bisturi, esegui una piccola craniotomia sull'area corticale di interesse.

Dopodiché, rimuovi la dura, quindi copri la corteccia esposta con lo strato di aros caldo. Mantieni gli agro umidi con soluzione salina. Preparare un elettrodo per lingue.

Incollare l'elettrodo a un tubo capillare di vetro con super colla e acceleratore. Quindi aggiungere una guaina termorestringente per la presa. Successivamente, montare l'elettrodo su un manipolatore microm motorizzato o idraulico e impostarlo in modo che viaggi ortogonalmente alla superficie corticale.

Fai scorrere un filo di terra sotto la pelle contro il cranio. Evitare il contatto con i muscoli ai lati della testa e nella parte posteriore del collo in quanto possono generare artefatti miografici. Il segnale elettrico viene amplificato utilizzando un amplificatore extracellulare adatto alla registrazione di singole unità, preferibilmente dotato di una modalità di controllo dell'impedenza.

L'attività di spiking in corso viene monitorata con due oscilloscopi e un set di altoparlanti amplificati. Ora fai avanzare l'elettrodo attraverso l'agros e testa la sua impedenza per assicurarti che sia compresa tra sette e 14 mega ohm. Quando la punta sfonda la superficie della corteccia, azzerare questa posizione sul manipolatore microm.

Per stimare al meglio la profondità di registrazione, confermare visivamente che la punta dell'elettrodo esca dalla superficie corticale a una profondità pari a zero. Quando si ritira l'elettrodo al termine di una penetrazione nella corteccia uditiva per assicurarsi che questo setpoint impostato zero corrisponda al livello della corteccia, monitora i potenziali di campo evocati dallo stimolo. Durante l'avanzamento dell'elettrodo attraverso le prime centinaia di micrometri di tessuto, confermare che la polarità del potenziale di campo locale si inverte intorno a una profondità di 100 micrometri.

Quindi, montare una fibra ottica accoppiata a una sorgente di luce blu su un micromanipolatore manuale. Regolare l'uscita della sorgente luminosa con l'unità di controllo in grado di erogare un treno di impulsi TTL di larghezza e durata specificate. Quindi monitora il segnale su entrambi gli oscilloscopi.

Misurare la potenza luminosa totale sulla punta della fibra ottica utilizzando un misuratore di potenza. Utilizzare questo valore per calcolare l'irraggiamento dividendolo per l'area della sezione trasversale del nucleo della fibra. Inizia con il valore nell'intervallo da 10 a 15 milliwatt per millimetro quadrato.

Usando il microscopio, posizionare la punta della fibra il più vicino possibile alla superficie dell'aros. Centrare il raggio nel punto in cui l'elettrodo entrerà nel tessuto. Ora controlla la presenza di artefatti leggeri con l'elettrodo nell'aros.

Eroga un affaticamento del polso. Elimina eventuali artefatti di luce transitoria riposizionando la fibra ottica rispetto all'elettrodo per modificare l'angolo di luce incidente. Se gli artefatti persistono, prova a diminuire la potenza della luce.

Quindi, far avanzare lentamente l'elettrodo attraverso il cervello a una velocità di circa un micrometro al secondo. Utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'attività in corso dell'elettrodo. Utilizzare l'altro per attivare gli impulsi laser.

Ascolta il debole hash dei picchi evocati dalla luce sul monitor audio, che indica che l'elettrodo si sta avvicinando a una cella positiva per l'opsina del canale. Quindi rallentare la velocità di avanzamento non appena la luce evoca. I picchi sono abbastanza grandi da poter essere attivati singolarmente sull'oscilloscopio.

Inizia a farlo. Regolare una scala sull'asse orizzontale per osservare la forma esatta della forma d'onda del picco. A questo punto, interrompere l'avanzamento dell'elettrodo e attendere che si depositi nel tessuto.

Questo è fondamentale per una registrazione stabile. Dopo alcuni minuti, se il rapporto segnale/rumore non è migliorato, avanzare di cinque micrometri e attendere. Anche in questo caso, ripetere questo processo fino a quando il picco o la depressione di un potenziale d'azione possono essere catturati in modo affidabile con una soglia di tensione.

Impostare ben al di sopra del rumore di fondo durante la registrazione. Monitora l'attività in corso sul primo oscilloscopio. Allo stesso tempo, prestare attenzione alle dimensioni e alla forma delle punte utilizzando il secondo oscilloscopio e notare la qualità del loro suono sull'altoparlante.

Ascolta attentamente i cambiamenti bruschi, che indicano che la cella si sta avvicinando troppo all'elettrodo o si sta allontanando. Se le punte diventano grandi e distorte, estrarre l'elettrodo. Se diventano più piccoli, far avanzare l'elettrodo.

Muoviti lentamente a passi di due micrometri per confermare la qualità delle punte. Sovrapponi tutta la forma d'onda del picco su un'ampia gamma di valori di soglia. Si dovrebbe vedere solo una forma di punta coerente di altezza uniforme.

La maggior parte delle celle fotovoltaiche positive può sostenere l'accensione per un secondo intero. Se il segnale viene contaminato da punte provenienti da un neurone vicino, l'elettrodo avanzato e cercare una nuova cellula in ogni penetrazione, abbassare l'elettrodo attraverso l'intera profondità della corteccia. Se non si incontrano neuroni sensibili alla luce dopo molte penetrazioni o, al contrario, le registrazioni vengono regolarmente contaminate con punte dal canale vicino, cellule opsina negative, provare un nuovo elettrodo.

Questa figura mostra esempi di registrazioni da tre tipi di interneuroni identificati otticamente. Le cellule rispondono al treno di impulsi di ricerca con una raffica affidabile di picchi. Qui sono mostrati 100 picchi di linea tr e la forma d'onda interpolata media.

Questi grafici mostrano la tempistica costante dei picchi evocati dalla luce. Le prime latenze di picco per un campione di potenza. Qui vengono presentati gli interneuroni volin positivi.

L'approccio della fotostimolazione è concettualmente molto semplice, ma può essere sorprendentemente impegnativo e a basso rendimento. In pratica. Gli elettrodi a patch in vetro sono fortemente orientati verso i neuroni parametallici, quindi non si ottengono molto spesso neuroni interni.

D'altra parte, con il tetros, si ottiene un sacco di interneuroni sensibili alla luce, ma i picchi sono piccoli e ci sono molte forme d'onda sovrapposte, quindi è molto difficile ordinare in modo affidabile in singole unità. Cerchiamo di raggiungere questo obiettivo in molti modi diversi e, per i neuroni interni, abbiamo scoperto che questi elettrodi affilati da 10 a 14 mega hanno raggiunto il giusto equilibrio in termini di raggio di ascolto, che deve essere abbastanza grande da rilevare la luce dei picchi di quercia da lontano, ma abbastanza limitato da ottenere un buon isolamento di una singola unità. C'è un po' di voodoo però.

Se non riesci a raggiungere questo obiettivo, risparmierai un sacco di tempo semplicemente abbandonando quell'elettrodo e passando al successivo finché non ne trovi uno che funzioni.