Name: Una guida per In vivo Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Scopri la registrazione single-unit in vivo da interneuroni corticali inibitori identificati ottogeneticamente nel topo. Questo metodo accessibile utilizza ChR2 e elettrodi ad alta impedenza per studiare l'attività neuronale con precisione.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Whitehall Foundation e dal NIH. Ringraziamo Clifford Dax (University of Oregon Technical Support Administration) per il suo aiuto e la sua esperienza nella progettazione di un circuito per l'erogazione della luce.

NOTA: Il seguente protocollo è conforme con il National Institutes of linee guida per la salute, come approvato dalla University of Oregon Animal Care and Use Committee. 1. Chirurgia acuta <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale con un cocktail di ketamina-medetomidina, via intraperitoneale (ip) iniezione (Tabella 1). NOTA: I topi utilizzati in questi esperimenti sono generati attraversando un cre-dipendente ChR2-EYFP transgenico line10 di interneuroni linee conducente (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Consegna virale di ChR2 o opsine correlati dovrebbe funzionare altrettanto bene, assumendo livelli di espressione simili si ottengono. </li><li> Prima di iniziare l&#39;intervento, in modo che le esibizioni di animali non risposta ad un pizzico punta dolce. Ri-somministrare anestetici durante l&#39;esperimento come necessario per mantenere questa profondità dell&#39;anestesia. Se si utilizza anestetici iniettabili, eventualmente impiantare un catetere ip per preparazioni iniettabili di manutenzione. </li><li> Mantenere l&#39;animale idratato con soluzione salina o di Ringer lattato durante l&#39;esperimento (circa 3 ml / kg / ora), per esempio usando un cocktail anestetico opportunamente diluito per preparazioni iniettabili manutenzione (Tabella 1). </li><li> Posto l&#39;animale in un apparato porta-teste stereotassico o altro. Assicurarsi che il cranio è ben protetto,. Ciò è essenziale per mantenere registrazioni monocellulari stabili. </li><li> Applicare una pomata opthalamic agli occhi per prevenire la secchezza. Mantenere la temperatura corporea a 36,5-37 ° C. </li><li> Eseguire uno scarico della cisterna per la stabilità ulteriore registrazione. Usando un bisturi, rimuovere il tessuto dalla faccia posteriore del cranio per esporre la cisterna magna. Fare un piccolo nick nella dura per drenare il liquido cerebrospinale. Utilizzare solo la punta della lama, ed evitare qualsiasi contatto il gambo cervelletto o del cervello. </li><li> Utilizzando il bisturi, eseguire una piccola craniotomia (~ 2 mm 2) sopra la zona corticale di interesse (per l&#39;acusticacorteccia, circa -2.3 mm posteriormente di bregma, 4,5 millimetri laterale della linea mediana). </li><li> Rimuovere la dura e coprire la corteccia esposta con uno strato di agarosio calda 0,5 - spessore di 1 mm (1,5% agarosio in soluzione salina, 0,9% di NaCl; applicare a ~ 37 ° C). Mantenere l&#39;umido agarosio tutto l&#39;esperimento applicando periodicamente alcune gocce di soluzione salina. </li></ol> 2. Registrazione Set-up <ol><li> Preparare un elettrodo di tungsteno (7-14 MW, 127 micron di diametro, 12 ° punta affusolata, rivestimento epossidico). Superglue l&#39;elettrodo di un tubo capillare di vetro e aggiungere termorestringente per una presa (figura 1). </li><li> Montare l&#39;elettrodo su un micromanipolatore motorizzato (o idraulico), impostare viaggiare ortogonale alla superficie corticale. Far scorrere un filo di terra sotto la pelle, contro il cranio. Evitare il contatto con i muscoli sul lato della testa e la parte posteriore del collo, in quanto possono generare artefatti elettromiografici. </li><li> Amplificazione del segnale elettrico utilizzando un amplificatore extracellulareli fi catore adatto per la registrazione singola unità, preferibilmente dotata di una modalità di controllo dell&#39;impedenza. Monitorare l&#39;attività chiodare in corso (banda passante di 300 - 5.000 Hz) con due oscilloscopi e un set di altoparlanti amplificati. Qui, i dati registrati vengono digitalizzate continuo ad una frequenza di campionamento di 10 kHz; picchi vengono estratti in linea. </li><li> Avanzare l&#39;elettrodo attraverso l&#39;agarosio finché la punta raggiunge la superficie della corteccia. Osservare questo passaggio attraverso un microscopio. &quot;Zero&quot; questa posizione sul micromanipolatore. </li><li> Per meglio approssimare la profondità della registrazione, confermare visivamente che la punta dell&#39;elettrodo esce dalla superficie corticale ad una profondità di zero quando ritirare l&#39;elettrodo al termine di una penetrazione. NOTA: Una discrepanza tra la lettura manipolatore e la posizione dell&#39;elettrodo osservato indica che è spostata rispetto al tessuto. Questo può essere causato da instabilità del cervello o animale, o manipolatore deriva. <ol><li> Come un ulteriore controllo per garantire chequesto set-punto zero corrisponde alla superficie della corteccia, monitorare potenziali di campo evocati stimolo mentre avanza attraverso le prime diverse centinaia di micrometri di tessuto. Durante il monitoraggio potenziali di campo, abbassare il più basso filtro passa-banda di taglio dell&#39;amplificatore extracellulare a 10 Hz. Verificare che la polarità del potenziale campo locale inverte intorno una profondità di circa 100 micron, in prossimità dello strato di confine I / II 13. Questo è un punto di riferimento affidabile per la corteccia uditiva, ma può essere diverso per le altre aree corticali. </li></ol></li><li> Montare una fibra ottica accoppiata ad una sorgente di luce blu (figura 2) su un micromanipolatore manuale. Utilizzando il microscopio, posizionare la punta della fibra più vicino alla superficie del agarosio possibile. Centrare il fascio in cui l&#39;elettrodo si entra il tessuto. </li><li> Regolare l&#39;uscita della sorgente di luce con una unità di controllo in grado di erogare un TTL (transistor-transistor logic) treno di impulsi di larghezza e duratio specificaton- esempio, un Arduino (figura 3), una scheda PC I / O (come mostrato), o un generatore di impulsi disponibile in commercio. <ol><li> Monitorare il segnale su entrambi oscilloscopi. </li></ol></li><li> Misurare potenza luminosa totale (mW) sulla punta della fibra ottica utilizzando un misuratore di potenza. Utilizzare questo valore per calcolare irradianza (mW / mm 2) dividendo per l&#39;area della sezione trasversale del nucleo della fibra. Iniziare con un valore di intensità nell&#39;intervallo 10 - 15 mW / mm 2 e regolare verso il basso se necessario, fino artefatti sono eliminati. </li><li> Verificare la presenza di manufatti leggeri con l&#39;elettrodo nella agarosio, pronta a entrare nel tessuto. Avviare la ricerca treno di impulsi (ad esempio, 30 impulsi di luce msec, 500 msec intervallo interstimulus (ISI)). <ol><li> Eliminare manufatti leggeri transitori (Figura 4) per riposizionare la fibra ottica rispetto all&#39;elettrodo per cambiare l&#39;angolo della luce incidente. Se artefatti persistono, provare a diminuire la potenza luminosa. In the caso raro che gli artefatti non possono essere completamente eliminati (solo ridotto al minimo), estendere la durata dell&#39;impulso di ricerca. Questo può aiutare a identificare i veri picchi neuronali. </li></ol></li></ol> 3. Dritto PINP-in &#39; <ol><li> Avanzare l&#39;elettrodo lentamente attraverso il cervello ad una velocità di circa 1 micron / sec. Utilizzare un oscilloscopio per monitorare l&#39;attività in corso. Dall&#39;altro, scatenare gli impulsi laser. </li><li> Attendere il &#39;hash&#39; deboli di picchi luce evocata sul monitor audio, che indica che l&#39;elettrodo si avvicina una cella ChR2 + e spesso può essere percepito ben prima del segnale elettrico risulta sull&#39;oscilloscopio. Rallentare la velocità di avanzamento. NOTA: Se la cella si trova direttamente nel percorso dell&#39;elettrodo, l&#39;attività di luce evocata crescerà più grande (e più forte). Come l&#39;elettrodo si avvicina un singolo interneuroni, l&#39;hash risolverà in piccoli ma ben definiti picchi di forma e dimensione uniformi. </li><li> Appena lipicchi GHT-evocato sono grandi abbastanza per innescare della singolarmente sull&#39;oscilloscopio, cominciano a farlo. Regolare la scala sull&#39;asse orizzontale per osservare la forma esatta della forma d&#39;onda di picco. </li><li> Fermarsi e attendere per il tessuto di stabilirsi. Resistete alla tentazione di spostare l&#39;elettrodo più vicino alla cella. Questo passaggio è fondamentale per una registrazione stabile. Se dopo alcuni minuti il ​​rapporto segnale-rumore non è migliorata - cioè, il tessuto è costante, ma non ha portato la cella più vicino alla punta dell&#39;elettrodo - avanzamento 5 micron ulteriormente e attendere. <ol><li> Ripetere questo processo fino a quando la punta o la depressione del potenziale d&#39;azione possono essere catturati in modo affidabile con una soglia di tensione impostata ben al di sopra del rumore di fondo (ad esempio, +/- 300 mV o superiore). NOTA: C&#39;è poco rischio di falsi positivi o ambiguità quando PINPing interneuroni inibitori. La maggior parte delle cellule in grado di seguire facilmente un treno di impulsi di durata di 30 msec e inter-pulIntervallo SE 500 msec, o più veloce, con una certa latenza primo picco di 2-5 msec (Figura 5). La maggior parte delle cellule fotovoltaiche +, in particolare, può sostenere cottura per un totale di 1 sec (Figura 6). Perché questi sono neuroni inibitori, disynaptic attivazione (indiretto) non è una preoccupazione importante. </li></ol></li><li> Durante la registrazione, monitorare l&#39;attività in corso sul primo oscilloscopio. Tieni d&#39;occhio le dimensioni e la forma del picchi utilizzando il secondo oscilloscopio. Si noti la qualità del loro suono sull&#39;altoparlante. <ol><li> Ascoltate con attenzione per i cambiamenti improvvisi, che indicano che la cella è sia volge troppo vicino all&#39;elettrodo (dove rischia di essere impalato o danneggiato), o è alla deriva. Se le punte si allargano e distorta, tornare indietro; se crescono più piccolo, far avanzare l&#39;elettrodo. Si muovono lentamente in 2 micron passi. </li><li> Verificare la qualità della registrazione post-hoc sovrapponendo tutte le forme d&#39;onda di picco, allineati a picco o depressione. Variare le THRES tensionetenere. Attraverso una vasta gamma di valori di soglia, ci dovrebbe essere solo una forma coerente picco di altezza uniforme (figura 5a). </li></ol></li><li> Se in qualsiasi momento il segnale venga contaminato con punte da un neurone vicino, andare avanti. Avanza lentamente, sulla remota possibilità che l&#39;elettrodo passerà fuori dalla portata della cella vicina, ma rimanere nel raggio d&#39;azione del neurone bersaglio. (Questo è di solito senza successo.) </li><li> Spostare l&#39;elettrodo attraverso l&#39;intera profondità della corteccia (900 + micron) in ogni penetrazione. Se non ci sono i neuroni di luce-sensibili si incontrano dopo molti penetrazioni o, al contrario, le registrazioni sono regolarmente contaminati con punte di cellule ChR2- vicini, provare un nuovo elettrodo. NOTA: Anche all&#39;interno di una stessa partita, la geometria impedenza e punta di singoli elettrodi può variare considerevolmente. Entrambi i fattori contribuiscono alla effettiva &quot;ascolto raggio&quot; dell&#39;elettrodo, che deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocati whricerca ile, ma limitato sufficiente per permettere la registrazione di un singolo interneuroni in isolamento. </li><li> Testare l&#39;impedenza degli elettrodi lo desideri. Per evitare di danneggiare il tessuto, farlo con la punta dell&#39;elettrodo nella parte superiore dello strato di agarosio, ben al di fuori del cervello. All&#39;interno della gamma di 7-14 MW, l&#39;impedenza esatta non è un sicuro indicatore delle prestazioni, o cedere, per questa applicazione. Detto questo, si tratta di un proxy ragionevole per l&#39;ascolto radio: elettrodi più bassa impedenza raccogliere più unità; elevata impedenza, meno. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, eutanasia dell&#39;animale mediante istituzionalmente approvati, quali overdose di anestetico, o dislocazione cervicale sotto un profondo piano di anestesia. </li></ol>

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<li>Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-dependent+temporal+response+properties+in+core+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex.</a> J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).</li>
<li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons%3A+chandelier+versus+basket+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8, 70553(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Anche se PINP è concettualmente semplice, può essere difficile in pratica. Un fattore determinante del successo è la scelta dell&#39;elettrodo. Il raggio di ascolto elettrica è il parametro critico. Deve essere sufficientemente grande per rilevare i picchi di luce evocata quando la punta è ancora lontano da una cella ChR2 +, in modo che si può regolare la velocità di avanzamento di conseguenza. Allo stesso tempo, deve essere limitato sufficiente a consentire un buon isolamento singola unità. Cioè, l&#39;elettrodo non de...

Caratterizzare la miriade di tipi di cellule che compongono il cervello dei mammiferi è stato un obiettivo centrale, ma a lungo sfuggente, della neurofisiologia. Ad esempio, le proprietà e la funzione di diversi tipi di cellule inibitorie nella corteccia cerebrale sono argomenti di grande interesse, ma sono ancora relativamente sconosciuti. Ciò è in parte dovuto al fatto che le tecniche convenzionali di registrazione in vivo alla cieca sono limitate nella loro capacità di distinguere tra diversi tipi di cellule. La larghezza della punta extracellulare può essere utilizzata per separare i neuroni inibitori positivi alla parvalbumina putativi dalle cellule piramidali eccitatorie, ma questo metodo è soggetto a errori sia di tipo I che di tipo II2,3. In alternativa, i neuroni registrati possono essere riempiti, recuperati e colorati per confermare successivamente la loro identità morfologica e molecolare, ma questo è un processo scrupoloso e dispendioso in termini di tempo. Recentemente, popolazioni geneticamente identificate di interneuroni inibitori sono diventate accessibili per mezzo dell'imaging del calcio o delle registrazioni di patch guidate visivamente. In questi approcci, l'espressione virale o transgenica di un reporter del calcio (come la GCaMP) o di una proteina fluorescente (come la GFP) consente l'identificazione e la caratterizzazione dei tipi cellulari definiti dall'espressione del promotore. Questi approcci utilizzano la microscopia a 2 fotoni, che richiede attrezzature costose, e sono anche limitati agli strati corticali superficiali a causa delle proprietà di diffusione della luce del tessuto cerebrale. 
Recentemente, Lima e colleghi1 hanno sviluppato una nuova applicazione dell'optogenetica per indirizzare le registrazioni elettrofisiologiche a tipi neuronali geneticamente identificati in vivo, chiamata "PINP" – o Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Le registrazioni vengono eseguite in topi che esprimono Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifiche sottopopolazioni neuronali. I membri della popolazione sono identificati dalla loro risposta a un breve lampo di luce blu. A differenza di molte altre applicazioni optogenetiche, l'obiettivo non è quello di manipolare la funzione del circuito, ma semplicemente di identificare i neuroni appartenenti a una classe geneticamente definita, che possono poi essere caratterizzati durante la normale funzione cerebrale. La tecnica può essere implementata con apparecchiature di registrazione extracellulare standard e può quindi fungere da alternativa accessibile ed economica all'imaging del calcio o al patching guidato visivamente. Qui descriviamo un approccio al PINPing di specifici tipi di cellule nella corteccia uditiva anestetizzata, con l'aspettativa che i punti più generali possano essere utilmente applicati in altri preparati e regioni del cervello.
In corteccia, PINP è particolarmente promettente per lo studio delle proprietà di risposta in vivo degli interneuroni inibitori. Gli interneuroni GABAergici comprendono un piccolo sottoinsieme eterogeneo di neuroni corticali4. Diversi sottotipi, caratterizzati dall'espressione di particolari marcatori molecolari, hanno recentemente dimostrato di svolgere diversi ruoli computazionali nei circuiti corticali5-9. Man mano che gli strumenti genetici migliorano, potrebbe essere possibile distinguere i tipi morfologicamente e fisiologicamente separabili che rientrano in queste ampie classi. Condividiamo qui la nostra strategia per ottenere registrazioni stabili e ben isolate di singole unità da interneuroni inibitori identificati nella corteccia del topo anestetizzata. Questa strategia è stata sviluppata specificamente per colpire le cellule positive alla parvalbumina (PV+), ma abbiamo scoperto che funziona anche per altri tipi di interneuroni, come gli interneuroni che esprimono somatostatina (SOM+) e che esprimono calretinina (CR+). Sebbene il PINPing sia concettualmente semplice, nella pratica può essere sorprendentemente inflessibile. Abbiamo imparato una serie di suggerimenti e trucchi attraverso tentativi ed errori che potrebbero essere utili ad altri che tentano il metodo.

<table><tbody><tr><td>ChR2-EYFP Linea</td><td>Jackson Colonie</td><td>12569</td><td></td></tr><tr><td>Pvalb-iCre (PV) Linea</td><td>Jackson Colonie</td><td>8069</td><td></td></tr><tr><td>Sst-iCre (SOM) Linea</td><td>Jackson Colonie</td><td>13044</td><td></td></tr><tr><td>Cr-iCre (CR) Linea</td><td>Jackson Colonie</td><td>10774</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>Tipo III-A, High EEO</td></tr><tr><td>Micro Point (dural uncino)</td><td>FST</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>FST</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>FST</td><td>10003-12 (manico), 10011-00 (lame)</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Unguento oftalmico</td><td>Foster & Smith</td><td>9N-76855</td><td></td></tr><tr><td>Coperta Omeotermica</td><td>Harvard Apparatus</td><td><a name="RANGE! C11">507220F</A></td><td></td></tr><tr><td>Microelettrodi di tungsteno</td><td>A-M Systems</td><td>577200</td><td>12 M&Omega; Resistenza CA, 127 &mu; m di diametro, 12&deg; punta affusolata, rivestimento epossidico</td></tr><tr><td>Tubo capillare in vetro</td><td>Warner Instruments</td><td>G150TF-3</td><td></td></tr><tr><td>Guaina termorestringente</td><td>DigiKey</td><td>A332B-4-ND</td><td></td></tr><tr><td>Zapit Accelerator</td><td>DVA</td><td>SKU ZA/ZAA</td><td>Utilizzare con la colla Super standard.</td></tr><tr><td>Amplificatore CA a microelettrodo 1800</td><td>AM Systems</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>MP-285 Micromanipolatore motorizzato</td><td>Sutter</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscopi digitali a 4 canali</td><td>Tektronix</td><td>TDS2000C</td><td></td></tr><tr><td>altoparlanti amplificati</td><td>Harman</td><td>modello JBL&nbsp; </td> Manipolatore Manuale Duet <td></td></tr><tr><td></td><td>Scientifica</td><td>LBM-7</td><td></td></tr><tr><td>800 &micro; m Cavo patch in fibra ottica</td><td>ThorLabs</td><td>FC/PC BFL37-800</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore</td><td>di potenza ThorLabs</td><td>PM100D (misuratore di potenza), S121C (sensore di potenza standard)</td><td></td></tr><tr><td>475 nm Cree XLamp XP-E</td><td>DigiKey</td><td>XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND</td><td>LED la potenza e l'efficienza sono in continuo aumento, quindi si consiglia di controllare gli ultimi prodotti (www.cree.com).</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>DigiKey</td><td>1050-1024-ND</td><td></td></tr></tbody></table>

una guida per in vivo singola unità di registrazione da optogenetically identificato corticale inibitorio interneuroni

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Una sfida importante in neurofisiologia è stato quello di caratterizzare le proprietà di risposta e la funzione dei numerosi tipi di cellule inibitoria nella corteccia cerebrale. Siamo qui condividiamo la nostra strategia per l&#39;ottenimento di stabili, ben isolate-single-unit registrazioni da interneuroni inibitori identificati nel topo corticale anestetizzato utilizzando un metodo sviluppato da Lima e colleghi 1. Le registrazioni vengono eseguite in topi che esprimono channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifiche sottopopolazioni neuronali. I membri della popolazione sono identificati dal loro risposta ad un breve lampo di luce blu. Questa tecnica - chiamata &quot;PINP&quot;, o Identificazione Fotostimolazione-assistita di popolazioni neuronali - possono essere implementati con equipaggiamento di serie di registrazione extracellulare. Può servire come un&#39;alternativa economica e accessibile per l&#39;imaging calcio o patch visivamente guidato, al fine di indirizzare registrazioni extracellulari alle cellule geneticamente identificati. Here mettiamo a disposizione una serie di linee guida per l&#39;ottimizzazione del metodo nella pratica di tutti i giorni. Abbiamo raffinato la nostra strategia specifica per il targeting (PV +), le cellule parvalbumin-positivo, ma abbiamo trovato che funziona per altri tipi di interneuroni, nonché, come ad esempio (CR +) interneuroni-calretinina esprimono-somatostatina che esprimono (SOM +) e.

Siamo qui condividiamo la nostra strategia per ottenere registrazioni singola unità da interneuroni inibitori geneticamente classificati nel topo corticale anestetizzato, utilizzando un metodo optogenetic sviluppato da Lima et al. Tabella 1 i dettagli cocktail anestetico suggerito, Ketamina-Medetomidina-acepromazina (1. " KMA "). La Figura 1 illustra un microelettrodo di tungsteno, preparato per la registrazione. La figura 2 contiene uno schema circu...

Qui descriviamo la nostra strategia per ottenere registrazioni stabili e ben isolate di singole unità da interneuroni inibitori identificati nella corteccia del topo anestetizzata. I neuroni che esprimono ChR2 sono identificati dalla loro risposta alla luce blu. Il metodo utilizza apparecchiature di registrazione extracellulare standard e rappresenta un'alternativa economica all'imaging del calcio o al patching guidato visivamente.

Una guida per In vivo Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere registrazioni di singole unità extracellulari di alta qualità da interneuroni corticali in topi che esprimono la radice del canale due. Ciò si ottiene facendo avanzare un elettrodo di registrazione ad alta impedenza attraverso il tessuto per identificare gli interneuroni dalle risposte di picco agli impulsi di luce blu. Il segnale elettrico viene monitorato per rilevare eventuali variazioni che indicano la velocità di avanzamento appropriata e la probabilità di ottenere una registrazione stabile e ben isolata.Se non è possibile ottenere un buon isolamento di una singola unità o, al contrario, si incontrano raramente neuroni sensibili alla luce, sostituire l'elettrodo di registrazione. I risultati mostrano l'affidabilità della luce che evoca risposte da neuroni identificati otticamente e il tipico rapporto segnale/rumore ottenuto con questa strategia. L'approccio della fotostimolazione è un modo accessibile ed economico per indirizzare tipi di cellule geneticamente identificati utilizzando un amplificatore extracellulare standard e la luce blu.Questa è la nostra strategia per sfruttare specifici neuroni interni nell'anestetizzare la corteccia uditiva, ma i punti più generali si applicano ad altre aree corticali rispetto ai tipi di cellule sparse Per iniziare questa procedura. Dopo che l'animale è stato anestetizzato con un cocktail di ketamina meine tramite iniezione intraperitoneale, posizionarlo in un apparecchio stereotassico o in un altro apparecchio per il supporto della testa, assicurarsi che il cranio sia ben fissato. Questo è essenziale per mantenere stabili le registrazioni di singole cellule.Successivamente, applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza e mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 gradi Celsius per eseguire un drenaggio sternale CI per una maggiore stabilità di registrazione, rimuovere il tessuto dal cranio posteriore con una lama di bisturi per esporre lo sterno magna CI. Quindi fai una piccola incisione nella Dora con la punta della lama per drenare il liquido cerebrospinale. Ora usando il bisturi, esegui una piccola craniotomia sull'area corticale di interesse.Dopodiché, rimuovi la dura, quindi copri la corteccia esposta con lo strato di aros caldo. Mantieni gli agro umidi con soluzione salina. Preparare un elettrodo per lingue.Incollare l'elettrodo a un tubo capillare di vetro con super colla e acceleratore. Quindi aggiungere una guaina termorestringente per la presa. Successivamente, montare l'elettrodo su un manipolatore microm motorizzato o idraulico e impostarlo in modo che viaggi ortogonalmente alla superficie corticale.Fai scorrere un filo di terra sotto la pelle contro il cranio. Evitare il contatto con i muscoli ai lati della testa e nella parte posteriore del collo in quanto possono generare artefatti miografici. Il segnale elettrico viene amplificato utilizzando un amplificatore extracellulare adatto alla registrazione di singole unità, preferibilmente dotato di una modalità di controllo dell'impedenza.L'attività di spiking in corso viene monitorata con due oscilloscopi e un set di altoparlanti amplificati. Ora fai avanzare l'elettrodo attraverso l'agros e testa la sua impedenza per assicurarti che sia compresa tra sette e 14 mega ohm. Quando la punta sfonda la superficie della corteccia, azzerare questa posizione sul manipolatore microm.Per stimare al meglio la profondità di registrazione, confermare visivamente che la punta dell'elettrodo esca dalla superficie corticale a una profondità pari a zero. Quando si ritira l'elettrodo al termine di una penetrazione nella corteccia uditiva per assicurarsi che questo setpoint impostato zero corrisponda al livello della corteccia, monitora i potenziali di campo evocati dallo stimolo. Durante l'avanzamento dell'elettrodo attraverso le prime centinaia di micrometri di tessuto, confermare che la polarità del potenziale di campo locale si inverte intorno a una profondità di 100 micrometri.Quindi, montare una fibra ottica accoppiata a una sorgente di luce blu su un micromanipolatore manuale. Regolare l'uscita della sorgente luminosa con l'unità di controllo in grado di erogare un treno di impulsi TTL di larghezza e durata specificate. Quindi monitora il segnale su entrambi gli oscilloscopi.Misurare la potenza luminosa totale sulla punta della fibra ottica utilizzando un misuratore di potenza. Utilizzare questo valore per calcolare l'irraggiamento dividendolo per l'area della sezione trasversale del nucleo della fibra. Inizia con il valore nell'intervallo da 10 a 15 milliwatt per millimetro quadrato.Usando il microscopio, posizionare la punta della fibra il più vicino possibile alla superficie dell'aros. Centrare il raggio nel punto in cui l'elettrodo entrerà nel tessuto. Ora controlla la presenza di artefatti leggeri con l'elettrodo nell'aros.Eroga un affaticamento del polso. Elimina eventuali artefatti di luce transitoria riposizionando la fibra ottica rispetto all'elettrodo per modificare l'angolo di luce incidente. Se gli artefatti persistono, prova a diminuire la potenza della luce.Quindi, far avanzare lentamente l'elettrodo attraverso il cervello a una velocità di circa un micrometro al secondo. Utilizzare un oscilloscopio per monitorare l'attività in corso dell'elettrodo. Utilizzare l'altro per attivare gli impulsi laser.Ascolta il debole hash dei picchi evocati dalla luce sul monitor audio, che indica che l'elettrodo si sta avvicinando a una cella positiva per l'opsina del canale. Quindi rallentare la velocità di avanzamento non appena la luce evoca. I picchi sono abbastanza grandi da poter essere attivati singolarmente sull'oscilloscopio.Inizia a farlo. Regolare una scala sull'asse orizzontale per osservare la forma esatta della forma d'onda del picco. A questo punto, interrompere l'avanzamento dell'elettrodo e attendere che si depositi nel tessuto.Questo è fondamentale per una registrazione stabile. Dopo alcuni minuti, se il rapporto segnale/rumore non è migliorato, avanzare di cinque micrometri e attendere. Anche in questo caso, ripetere questo processo fino a quando il picco o la depressione di un potenziale d'azione possono essere catturati in modo affidabile con una soglia di tensione.Impostare ben al di sopra del rumore di fondo durante la registrazione. Monitora l'attività in corso sul primo oscilloscopio. Allo stesso tempo, prestare attenzione alle dimensioni e alla forma delle punte utilizzando il secondo oscilloscopio e notare la qualità del loro suono sull'altoparlante.Ascolta attentamente i cambiamenti bruschi, che indicano che la cella si sta avvicinando troppo all'elettrodo o si sta allontanando. Se le punte diventano grandi e distorte, estrarre l'elettrodo. Se diventano più piccoli, far avanzare l'elettrodo.Muoviti lentamente a passi di due micrometri per confermare la qualità delle punte. Sovrapponi tutta la forma d'onda del picco su un'ampia gamma di valori di soglia. Si dovrebbe vedere solo una forma di punta coerente di altezza uniforme.La maggior parte delle celle fotovoltaiche positive può sostenere l'accensione per un secondo intero. Se il segnale viene contaminato da punte provenienti da un neurone vicino, l'elettrodo avanzato e cercare una nuova cellula in ogni penetrazione, abbassare l'elettrodo attraverso l'intera profondità della corteccia. Se non si incontrano neuroni sensibili alla luce dopo molte penetrazioni o, al contrario, le registrazioni vengono regolarmente contaminate con punte dal canale vicino, cellule opsina negative, provare un nuovo elettrodo.Questa figura mostra esempi di registrazioni da tre tipi di interneuroni identificati otticamente. Le cellule rispondono al treno di impulsi di ricerca con una raffica affidabile di picchi. Qui sono mostrati 100 picchi di linea tr e la forma d'onda interpolata media.Questi grafici mostrano la tempistica costante dei picchi evocati dalla luce. Le prime latenze di picco per un campione di potenza. Qui vengono presentati gli interneuroni volin positivi.L'approccio della fotostimolazione è concettualmente molto semplice, ma può essere sorprendentemente impegnativo e a basso rendimento. In pratica. Gli elettrodi a patch in vetro sono fortemente orientati verso i neuroni parametallici, quindi non si ottengono molto spesso neuroni interni.D'altra parte, con il tetros, si ottiene un sacco di interneuroni sensibili alla luce, ma i picchi sono piccoli e ci sono molte forme d'onda sovrapposte, quindi è molto difficile ordinare in modo affidabile in singole unità. Cerchiamo di raggiungere questo obiettivo in molti modi diversi e, per i neuroni interni, abbiamo scoperto che questi elettrodi affilati da 10 a 14 mega hanno raggiunto il giusto equilibrio in termini di raggio di ascolto, che deve essere abbastanza grande da rilevare la luce dei picchi di quercia da lontano, ma abbastanza limitato da ottenere un buon isolamento di una singola unità. C'è un po' di voodoo però.Se non riesci a raggiungere questo obiettivo, risparmierai un sacco di tempo semplicemente abbandonando quell'elettrodo e passando al successivo finché non ne trovi uno che funzioni.

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