Name: In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Impara a visualizzare in tempo reale la migrazione dei neutrofili attraverso le giunzioni endoteliali in condizioni di flusso fisiologico. Questo metodo consente di distinguere le vie paracellulari e transcellulari.

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Gli autori ringraziano il Dr. P.L. Hordijk per aver letto criticamente il manoscritto. L'AED è supportato da una borsa di studio della Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) (sovvenzione #1028). JK è supportato dalla Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB è un NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

I neutrofili sono stati isolati da volontari sani che hanno sottoscritto un consenso informato. La ricerca è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per il benessere umano. 1 placcatura e manutenzione di ombelicale Cellule endoteliali Vena <ol><li> Cellule Cultura ombelicale umano Vena endoteliali (HUVEC) secondo le istruzioni del produttore. Crescere HUVECs su fibronectina (FN) Rivestiti piatti (10 mcg / ml, disciolti in acqua demineralizzata) utilizzando supporti (Endothelial Basal Medium (EBM-2) media integrato con Endothelial Growth Medium (EGM-2) singlequots). Utilizzare coltura cellulare tra 4-8 passaggi per gli esperimenti. </li><li> 1 ° giorno: Cappotto portate camere con 100 ml di fibronectina (10 mg / ml in PBS) per almeno 2 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Giorno 2: Quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, trypsinize le cellule dopo il lavaggio accurato con RT tampone fosfato (PBS) pH 7,4, centrifugare a 800 xg e risospendere a 800.000 cellule / ml utilizzando supporti. Piatto 80.000 cellule in ogni singolo canale delle portate camere FN-rivestiti e delicatamente pipetta la sospensione cellulare su e giù. Cultura O / N in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Giorno 3: Aggiornare i media nella diapositiva flusso camera inclinando delicatamente il vetrino con un angolo di 45 °. (Vedi Figura 1A). NOTA: Si raccomanda di rimuovere solo i media nei serbatoi e non nel canale stesso. Rimozione dei media nei canali può causare la perdita delle cellule endoteliali e la morte a causa della forza di trascinamento dei media causata da pipettaggio. </li><li> Controllare al microscopio a contrasto di fase se le cellule endoteliali hanno formato un monostrato (cioè, 100% confluenti). Se le cellule non sono al 100% confluenti, cambiare i media due volte al giorno fino a raggiungere il 100% di confluenza. </li><li> Una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza, stimolare le cellule con i media (vedere il passaggio1.1) contenente mediatore infiammatorio (TNF-α (10 ng / ml)). Stimolare HUVECs O / N (vale a dire, 12 ore) con risultati TNF-α in un fenotipo infiammatorio dell&#39;endotelio, cioè., Up-regolazione delle molecole di adesione delle cellule, quali ICAM-1 e VCAM-1 13. </li></ol> 2. leucociti polimorfonucleati Isolamento Uso gradienti Percoll <ol><li> Preparare N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethanesulfonic acido (HEPES) -buffer (qui di seguito denominato: flow-buffer) prima di isolare leucociti polimorfonucleati (PMN). Flow-tampone è usato per lavare PMN isolati e come tampone nel saggio flusso. Per preparare flow-tampone: diluire 7.72 g di NaCl (132 mm), 4.76 g HEPES (20 mm), 0,45 g KCl (6 mm), 0,25 g MgSO4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mm) in 1 l di acqua demineralizzata e regolare a pH 7,4 (questo stock può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane). </li><li> Aggiungere fresca 100 ml 1 M CaCl 2 &amp; #160, (1 mM), 2,5 ml di albumina umana da una concentrazione di 200 g / L stock (0,5% v / v) e 0,1 g di glucosio per 100 ml (0,1% w / v) di flusso-buffer. Successivamente, filtrare il flusso buffer utilizzando un filtro da 0,45 micron. NOTA: Questo flusso-tampone deve essere preparato fresco per ogni esperimento. </li><li> Prima di isolamento di PMN, preparare una soluzione al 10% di citrato trisodico (TNC) in PBS, pH 7,4. </li><li> Raccogliere 20 ml di sangue intero in vacuettes eparina di sodio da un volontario sano. Diluire sangue intero 1: 1 con 10% PBS / TNC in provette da 50 ml e 20 ml pipetta diluiti attentamente sangue sul 12,5 ml di Percoll (un 23% (w / w) soluzione colloidale in acqua con una densità di 1.130 g / ml) in un nuovo tubo da 50 ml. Posizionare con cura le provette nella centrifuga e centrifugare per 20 minuti a 800 xg con bassa accelerazione e nessuna rottura fissato a RT. NOTA: Quando si aggiunge il sangue diluito al Percoll, inclinare il tubo di Percoll-contenente, in un angolo di 45 ° e pipettare delicatamente il sangue diluito l&#39;arguzia tuboh il più lento impostazione pipetta ragazzo. </li><li> Rimuovere tutto il liquido e successivamente riempire il tubo con gelida lisi degli eritrociti-buffer (4.15 g di NH 4 Cl [0.155 M], 0,5 g KHCO 3 [0.01 M] e 18,5 mg di EDTA (triplex III) [0,1 mm] per 500 ml di ghiaccio-freddo H 2 O) per lisare eritrociti. Lasciare provetta in ghiaccio, talvolta invertendo il tubo, finché la sospensione diventa rosso scuro, seguita da centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C con pause abilitati. NOTA: la frazione pellet contiene i PMN (neutrofili, eosinofili, basofili) insieme ai eritrociti. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare pellet due volte gelida lisi-buffer a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet con flusso-buffer a RT e determinare la concentrazione di PMN utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzati. Sospendere i PMN nel flusso-buffer a 1 x 10 6 cellule / ml e conservare a temperatura ambiente. </li></ol> 3 Etichettatura dei endoteliale Junctional VE-caderina e PECAM-1 <ol><li> Aggiungere il PECAM Alexa Fluor 647 anticorpi (clone WM59) ad una diluizione 1: 100 e l&#39;anticorpo VE-caderina-FITC calcio-indipendente (clone 55-7H1) ad una diluizione 1:50 di HUVEC terreno di coltura (vedere il punto 1.1), e incubare per 30 minuti prima di iniziare l&#39;esperimento flusso di visualizzare la dinamica giunzionali di cellule endoteliali durante neutrofili trasmigrazione in condizioni di flusso fisiologiche. NOTA: Prima di aggiungere gli anticorpi direttamente etichettati al flusso-camere, assicurarsi che il volume di ciascun canale non superi i 100 ml. Questo aiuta a mantenere le spese di anticorpi più basso possibile. </li></ol> 4. PMN TEM Assay Under flusso <ol><li> Posizionare i PMN in un bagno di acqua per 15 min a 37 ° C prima di iniettarle nel flusso del sistema. </li><li> Collegare il tubo di un flusso-camera vuota e riempire con acqua calda (ad esempio, 37 ° C) Flusso-buffer (vedi punto 4.3) per evitare la formazione di bolle d&#39;aria durante l&#39;impostazione thsistema di flusso e. </li><li> Collegare un lato di un flusso camera vuota per il sistema di flusso pompa a siringa utilizzando tubi in silicone contenente una siringa da 20 ml, e mettere il flusso-camera nella fase microscopio. </li><li> Collegare l&#39;altro lato di un flusso camera vuota nel pallone serbatoio riempito con 37 ° C di mandata-buffer (Figura 1B) e avviare la pompa a siringa per riempire tutte le tubazioni di flusso-buffer. La pompa tirerà il flusso buffer dal serbatoio attraverso il flusso camera nella siringa. NOTA: Questo tubo contiene anche una porta di iniezione in linea Luer, che permette PMN da iniettare con un ago in un esperimento in esecuzione senza arrestare il flusso e la creazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Sostituire il flusso-camera vuota con il flusso-camera contenente TNF-α-trattati HUVEC, collegare il tubo del flusso tampone contenente e posizionarlo nella fase di microscopio (Figura 1C). Pinch off i tubi prima di scollegare e ricollegare ilm alle camere contenenti il ​​HUVEC, come non pizzicare fuori può causare la formazione di bolle d&#39;aria all&#39;interno del tubo e / o velocità di flusso camere. </li><li> Regolare la velocità di flusso di 1 dyn / cm 2, in conformità con le velocità del flusso fisiologico in venule post-capillari (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Record interferenza differenziale contrasto (DIC), FITC (488 nm) e Alexa Fluor 647 (647 nm) simultaneamente utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. </li><li> Iniettare i PMN (passo 4.1) lentamente nel flusso attraverso il sistema in-linea Luer porta di iniezione (Figura 1D) con 1 ml siringhe. </li><li> Dopo pochi minuti, leucociti appaiono, aderire, e trasmigrare. Fermare l&#39;esperimento in qualsiasi momento desiderato scollegando il tubo dal flusso-camera e pipettaggio fissativo (3,7% di formaldeide in PBS) nel flusso-camera. Lasciare fissazione per 10 minuti, seguita da un lavaggio con PBS. I dati vengono analizzati con il software di imaging (vedi Materiali e attrezzature tabella). NOTA: Eseguire la egli esperimento utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotata di una camera climatica a temperatura costante a 37 ° C, 5% di CO 2, e un olio 63X-obiettivo. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Per questo protocollo, è fondamentale per evitare la formazione di bolle d&#39;aria nel flusso-camere, dal momento che questo si tradurrà in apoptosi cellulare e un monostrato perturbato. Per evitare questo, vogliamo sottolineare di prestare particolare interesse alle fasi 4.2 e 4.5, dove i tubi sono collegati al flusso-camera. Un altro punto critico nel protocollo è il priming dei PMN che vengono tenuti a RT da loro incubazione per 15-30 minuti a 37 ° C prima di iniettarle al flusso-camera (passo 4.1). Ciò si traduce in priming delle integrine leucocitarie, permettendo loro di aderire a molecole di adesione, quali ICAM-1 e VCAM-1 presso l&#39;endotelio. Questo protocollo non si limita a studiare la trasmigrazione dei neutrofili. Possono essere utilizzati anche altri tipi di leucociti quali monociti o linfociti. Si noti che passo 4.1, vale a dire, adescamento leucociti possono differire tra i vari tipi di leucociti. Inoltre, possono essere utilizzati altri tipi di cellule endoteliali. Per questo rimane criticoper stimolare le cellule endoteliali con opportuni stimoli infiammatori come il TNF-α e IL-1β. Se neutrofili non rispondono in trasmigrante, si può prendere in considerazione il trattamento della neutrofili brevemente (5 min) con N-formil-L-metionil-L-leucyl-L-fenilalanina (fMLP) peptide 16. Ciò stimolerà i neutrofili, in particolare i loro integrine, ancora di più, che li rende più inclini ad aderire all&#39;endotelio. In genere viene utilizzato 1 dyn / cm 2 velocità del flusso. Questa velocità di flusso si misura in venule post-capillari, luoghi dove avviene la maggior parte della migrazione leucocitaria transendoteliale 17. Utilizzando le portate camere descritti, è possibile aumentare la velocità di flusso fino a 10 dine / cm 2. Tuttavia, non è consigliabile per aumentare ulteriormente il taglio. Essa può causare perdite indesiderate del tubo e il distacco delle cellule dal flusso-camera. I risultati descritti in figura 3 indicano che questiGli anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare e studiare la dinamica del endoteliali giunzioni cellula-cellula durante diapedesi leucocitaria. In particolare, oltre ai saggi di trasmigrazione esistenti questo protocollo permette di discriminare paracellular dalla migrazione transcellulare in condizioni fisiologiche di flusso in tempo reale. Dal momento che gli anticorpi macchiano le giunzioni cellula-cellula, si può segnare il numero di leucociti che attraversano VE-caderina / giunzioni PECAM-1-positivi rispetto non positiva VE-caderina / PECAM-1 siti. In questo modo, la migrazione transcellulare può essere discriminato dalla migrazione paracellulare. È importante sottolineare che questi anticorpi non interferiscono con la funzione delle proteine ​​che si legano a: la PECAM-1 anticorpo utilizzato in questo studio è diretto contro il secondo dominio extracellulare. Le cellule endoteliali che sono state piastrate in presenza dell&#39;anticorpo non presentavano difetti di diffusione o formare un monostrato, suggerendo che l&#39;anticorpo almeno non hainterferire con le interazioni omotipiche tra le cellule endoteliali. in aggiunta a ciò, entrambi gli anticorpi non compromettono la capacità dei neutrofili di migrare attraverso il monostrato endoteliale. Inoltre, il numero di neutrofili che trasmigrano attraverso il monostrato endoteliale in assenza o presenza di anticorpi non viene alterato (dati non mostrati). È importante sottolineare che, microscopio confocale a scansione laser ci dà la possibilità di registrare i canali fluorescenti diversi e DIC contemporaneamente. Pertanto, questo test permette di studiare le dinamiche della VE-caderina e PECAM-1 nello stesso momento in cui una neutrofili attraversa la giunzione cellula-cellula endoteliale e vi aiuterà a capire perché i leucociti scegliere una rotta sopra l&#39;altro, vale a dire, paracellulare contro transcellulare.

Efficiente e strettamente controllato migrazione dei leucociti transendoteliale (TEM) è di fondamentale importanza nei processi fisiologici quali la sorveglianza immunitaria e l&#39;infiammazione acuta. Tuttavia, in determinate condizioni fisiopatologiche, TEM incontrollata ed eccessiva si osserva traduce in malattie infiammatorie croniche (ad esempio, l&#39;artrite reumatoide, aterosclerosi, asma). Anche durante metastasi tumorali delle cellule, il processo di migrazione transendoteliale è strumentale per le cellule tumorali di lasciare la circolazione di metastatizzare 1-3. Al fine di interferire specificamente con eccessiva leucociti o TEM cellule tumorali, è necessaria una conoscenza dettagliata della regolazione di questo processo. Si ritiene che il processo TEM avviene attraverso diverse fasi. Studi seminali, recensito due decenni fa da Butcher e Springer, hanno portato al modello multistep che descrive il processo di TEM 4,5. Questo modello è ancora valido, anche se alcuni annuncipassi nali sono stati inclusi 6. Alon et al. Descritto la necessità della presenza di chemochine immobilizzati sulla superficie dell&#39;endotelio 7. Di recente, hanno mostrato che l&#39;endotelio si genera chemochine che sono presentati alla superficie apicale endoteliale 8. Inoltre, lo stesso gruppo ha presentato l&#39;importanza delle condizioni di flusso durante TEM 7. Recentemente, diverse pubblicazioni incentrate sulle due rotte diverse leucociti possono prendere nella fase finale di diapedesi TEM. Essi possono sia passare attraverso le giunzioni cellula-cellula, cioè, il percorso di migrazione paracellulare, o attraversare il corpo delle cellule endoteliali, noto come il percorso di migrazione transcellulare 9. Carman e colleghi hanno studiato queste vie in dettaglio e ha concluso che leucociti preferenzialmente scegliere il percorso di migrazione paracellulare (90%) sul percorso transcellulare (10%) quando attraversano una vena ombelicale monostrato endoteliale 10.Tuttavia, quando sono stati utilizzati cellule endoteliali provenienti da altre origini, ad esempio, il cervello o microcircolo, più leucociti utilizzato il percorso transcellulare (30%) 11. Il gruppo Vestweber di recente ha mostrato che quando le giunzioni cellula-cellula erano in grado di dissociarsi tra loro utilizzando un knock-in modello animale, sostituendo endogena VE-caderina per VE-caderina-alfa-catenina chimera, leucociti TEM è stato completamente bloccato 12 . Sorprendentemente, gli autori hanno notato che il TEM è stato bloccato in alcuni, ma non tutti, i tessuti. Nel complesso, questi eleganti esperimenti hanno indicato che i leucociti preferito il percorso paracellulare sul percorso transcellulare, anche se i segnali regolatori che attivano questa decisione sono ancora sconosciute. Anche se la maggior parte dei leucociti preferiscono la rotta migratoria paracellulare, è ancora difficile discriminare tra i due percorsi. In aggiunta a ciò, nonostante vari studi focalizzati sul ruolo del junct cellula-cellula endotelialeioni, le dinamiche di queste giunzioni, in particolare le proteine ​​giunzionali VE-caderina e PECAM-1, durante la traversata dei leucociti è ancora in discussione. Abbiamo sviluppato una relativamente semplice test in cui queste molecole di giunzione possono essere monitorati in tempo reale durante la diapedesi dei leucociti in condizioni di flusso fisiologiche mediante anticorpi fluorescente-etichettati. Questi anticorpi non interferire con o bloccare l&#39;integrità giunzionale o mobilità delle proteine ​​target. Questo test ci permette di seguire la dinamica delle proteine ​​giunzionali durante il processo di paracellulare TEM. Inoltre, questo test permette anche di discriminare tra le rotte migratorie parametri e transcellulare.

<table><tbody><tr><td>&mu;-Scivolo VI</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td>Camera di flusso</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtro&nbsp;</td><td>Whatman/GE Lifesciences</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 20 ml&nbsp;</td><td>BD Discardit II</td><td>366296</td><td></td></tr><tr><td>21 g Ago&nbsp;</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>Albumina&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>15522644</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio (NH4Cl)</td><td>Merck</td><td>1009245000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Fattori di crescita</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 + CC-4176</td><td>media</td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1370041000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-2MG</td><td>FN</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Porta di iniezione Luer in linea&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4&bull; 7H2O)Merck</td><td></td> <td>105886</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1-ALEXA-647&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561654</td><td>clone WM59</td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Fresenius Kabi Nederland</td><td>M090001/01NL</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato acido di potassio (KHCO3)</td><td>Merck</td><td>1048540500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico triidrato (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Tygon 3350</td><td>tubi VWR</td><td>228-4331</td><td>Tubo</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa&nbsp;</td><td>Apparecchio Harvard numero</td><td>di modello 55-5920</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td>fattore di necrosi tumorale</td></tr><tr><td>Citrato trisodico</td><td>Merck</td><td>1.06447.5000</td><td>TNC</td></tr><tr><td>Vacuettes</td><td>Greiner, Germania</td><td>980044</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-FITC&nbsp;</td><td>BD Pharmingen 560411</td><td></td><td>clone 55-7H1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software 2008</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in tempo reale imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula durante neutrofili trasmigrazione sotto fisiologico flusso

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Durante l&#39;infiammazione, leucociti lasciano la circolazione e attraversano l&#39;endotelio a combattere invasori patogeni nei tessuti sottostanti. Questo processo è noto come migrazione leucocitaria transendoteliale. Sono stati descritti due percorsi per leucociti per attraversare il monostrato endoteliale: il percorso paracellulare, cioè, attraverso le giunzioni cellula-cellula e il percorso transcellulare, cioè, attraverso il corpo delle cellule endoteliali. Tuttavia, è stato tecnicamente difficile discriminare tra il paragrafo e itinerario transcellulare. Abbiamo sviluppato un semplice test in vitro per studiare la distribuzione di endogeno VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei neutrofili transendoteliale in condizioni di flusso fisiologiche. Prima di perfusione neutrofili, cellule endoteliali sono stati brevemente trattati con anticorpi fluorescenza marcata nei confronti di VE-caderina e PECAM-1. Questi anticorpi non interferiscono con la funzione di entrambe le proteine, come è stato determinato elettrico cellula-substrarilevamento impedenza te e FRAP misure. Usando questo test, siamo stati in grado di seguire la distribuzione dei endogeno VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione transendoteliale in condizioni di flusso e distinguere le parametri e migrazione transcellulare percorsi dei leucociti attraverso l&#39;endotelio.

Abbiamo prima testato se gli anticorpi non hanno interferito con la funzione di barriera dell'endotelio. Abbiamo misurato la resistenza di monostrati endoteliali mediante rilevamento impedenza cellula-substrato elettrico (ECIS). Per dettagli, vedere Van Buul et al. 13 Nessun cambiamento nella resistenza è stata osservata quando l'anticorpo anti-VE-caderina fluorescenza marcata è stato aggiunto alle cellule (Figura 2A). Un anticorpo anti-VE-caderina che è ben riconosciuto per bloccare VE-caderina funzione riduce drasticamente la resistenza (Figura 2A). Inoltre, gli anticorpi utilizzati per l'imaging non alterano le dinamiche della VE-caderina, come è stato valutato misurando il recupero fluorescente dopo fotometabolismo (FRAP) di VE-caderina-GFP (Figura 2B). Dopo 1-2 minuti, neutrofili rispettate monostrato endoteliale attivato come potrebbe essere visualizzato nel canale DIC (Figura 3A). Dopo la scansione per 5-30 seC, la stragrande maggioranza dei neutrofili trasmigrato attraverso il monostrato endoteliale attraverso le giunzioni cellula-cellula che sono stati etichettati con gli anticorpi diretti contro PECAM-1 e VE-caderina. Durante il processo di diapedesi, la distribuzione di VE-caderina e PECAM-1 è stata seguita in tempo reale (Figura 3B). Nei siti di neutrofili diapedesi, VE-caderina è stato interrotto a livello locale e PECAM-1 ha mostrato una struttura più anulare. Dopo il completamento della diapedesi, le giunzioni strette e VE-caderina e PECAM-1 chiaramente trasferiti nei siti di diapedesi (Figura 3C). Si noti che le parti del anticorpo anti-PECAM-1 sono stati rilevati sulla superficie del neutrofilo, una volta raggiunta la neutrofili lato basolaterale dell'endotelio. Tuttavia, questo non ha impedito neutrofili di attraversare l'endotelio. Le dinamiche osservate del VE-caderina in tempo reale durante la migrazione dei neutrofili transendoteliale erano in accordo con il lavoro di Shaw e colleghi cheha mostrato, utilizzando la microscopia confocale e VE-caderina-GFP-trasfettate cellule endoteliali, che VE-caderina-GFP diffusa lateralmente quando leucociti attraversarono le giunzioni cellula-cellula endoteliali 14. Lavorare anche da Su e colleghi hanno sottolineato le nostre osservazioni di PECAM-1. Essi hanno dimostrato che, accanto al laterale VE-caderina diffusione sul passaggio dei leucociti, è stato ridistribuito localmente PECAM-1 in un anello intorno al trasmigrante neutrofili 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400"> Figura 1 Nella camera di flusso vitro. (A) La freccia indica il serbatoio da cui il mezzo deve essere aggiornato. (B) tubo in silicone che collega la camera di flusso con la porta di iniezione Luer in-linea utilizzata per l'iniezione di PMN senza scollegare il tubo (punta di freccia). (C) Connezione di un flusso-camera vuota al pallone serbatoio riempito con 37 ° C di flusso-buffer (punta di freccia). (D) Collegamento del flusso da camera con i HUVECs TNF-α-trattate per il tubo-flow-tampone contenente e posto in palco microscopio (punta di freccia). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2 VE-caderina anticorpi non interferiscono con la dinamica o la funzione giunzionale. (A) delle cellule endoteliali impedenza monostrato viene misurata utilizzando ECIS. Y esprime impedenza in Ohm e asse x rappresenta il tempo in ore. VE-caderina anticorpi clone 55-7H1, marcato con ALEXA647 (linea blu) o isotipo di controllo IgG-ALEXA647 (linea rossa) non alterare l'impedenza monostrato di cellule endoteliali, mentre la VE-caderina blocco CL75 anticorpo (linea nera) si riduce l'impedenza . (B <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3 VE-caderina e PECAM-1 durante la distribuzione dei neutrofili TEM in tempo reale. (A) dei neutrofili (contrassegnato con linea bianca) aderendo sull'endotelio e attraversando la giunzione cellula-cellula senza influenzare la distribuzione di VE-caderina e PECAM -1. (B) dei neutrofili attraversando il monostrato endoteliale attraverso le giunzioni cellula-cellula. Una dispersione locale di VE-caderina e PECAM-1 possono essere osservati quando una neutrofili sporge attraverso le giunzioni cellula-cellula. Linea bianca illustra la presenza di neutrofili ancora in cima dell'endotelio. Linea gialla mostra membrana dei neutrofili that è già sotto endotelio. (C) dei neutrofili ha completamente attraversato il monostrato endoteliale. VE-caderina e PECAM-1 sono trasferiti in siti di diapedesi. Linea gialla illustra confini neutrofili trasmigrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di seguire la distribuzione di giunzionali endogeni, terine e pcam durante la migrazione transendoteliale dei leucociti in condizioni di flusso fisiologico. Ciò si ottiene isolando prima i leucociti polimorfonucleati o PMN dall'intero sangue di volontari sani utilizzando un gradiente proco. Il secondo passo consiste nell'aggiungere anticorpi marcati in fluorescenza al monostrato di cellule endoteliali della vena ombelicale umana stimolato con TNF alfa coltivato in vetrini di flusso 30 minuti prima di iniziare l'esperimento di flusso.Ciò consentirà la visualizzazione delle dinamiche giunzionali delle cellule endoteliali durante la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso fisiologico. Successivamente, il vetrino di flusso contenente le cellule endoteliali della vena ombelicale umana stimolate con TNF alfa marcato in fluorescenza viene collegato al sistema di flusso e posizionato sul tavolino del microscopio. La pompa estrarrà il tampone di flusso dal serbatoio attraverso la camera di flusso nella siringa.Il passaggio finale consiste nell'iniettare lentamente i PMN nel sistema di flusso attraverso la porta di iniezione. Infine, i PMN vengono visualizzati utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Dopo pochi minuti, i leucociti compaiono, aderiscono e trasmigrano.L'esperimento può essere interrotto in qualsiasi momento desiderato. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come i saggi di trasmigrazione statica, è che con questa tecnica è possibile studiare l'adesione e la trasmigrazione nella vita reale in condizioni di flusso fisiologico. Questo ci aiuterà a capire perché i leucociti scelgono una radice rispetto all'altra, quindi PGA contro migrazione transcellulare.Lo facciamo visualizzando le giunzioni cellulari con anticorpi marcati in fluorescenza. Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana o HU X per questo esperimento vengono coltivate secondo le istruzioni del produttore su piastre rivestite di fibronectina utilizzando terreni integrati con crescita endoteliale. Medio. La coltura cellulare viene utilizzata tra i quattro e gli otto passaggi quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, lavarle accuratamente con PBS a temperatura ambiente a pH 7,4 e quindi la tripsina è le cellule dopo la tripsina e la centrifugazione.Sospendiamo a 800.000 cellule per millilitro utilizzando i terreni. L'esperimento utilizza camere di flusso che sono state rivestite con fibronectina sulla piastra del giorno precedente. 80.000 cellule in ogni singolo canale della fibronectina codificano le camere di flusso e pipettano delicatamente la sospensione cellulare su e giù per la coltura durante la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica il giorno successivo.Aggiornare il fluido nel vetrino della camera di flusso inclinandolo delicatamente con un angolo di 45 gradi. Si consiglia di rimuovere il fluido solo nei serbatoi e non nel canale stesso. La rimozione del terreno nei canali può causare la perdita e la morte delle cellule endoteliali a causa della forza di trascinamento del terreno causata dal pipettaggio.Controllare al microscopio a contrasto di fase se le cellule endoteliali hanno formato un monostrato. Se le celle non sono cofluenti al 100%, cambiare il terreno due volte al giorno fino a raggiungere il 100% di confluenza. Una volta che le cellule hanno raggiunto il 100% di fluenza, stimolare le cellule con terreni contenenti il mediatore infiammatorio.Il TNF alfa stimola l'uix durante la notte con il TNF alfa provoca un fenotipo infiammatorio dell'endotelio IE sovraregolazione delle molecole di adesione cellulare come ICAM one e VA M1. Prima di isolare i leucociti polimorfonucleati o PMN. Preparare un tampone di flusso per il lavaggio dei PMN isolati e per l'uso nel saggio di flusso a 100 millilitri di una soluzione madre precedentemente preparata. A 100 microlitri di cloruro di calcio fresco di un molare, 2,5 millilitri di albumina umana da una concentrazione di 200 grammi per litro e 0,1 grammi di glucosio.Filtrare il tampone di flusso utilizzando un filtro da 0,45 micron. Prima dell'isolamento dei PMN viene inoltre preparata una soluzione di citrato trisodico al 10% o TNC in PBS a pH 7,4. I PMN saranno isolati da 20 millilitri di sangue intero raccolti in un'eparina sodica da un volontario sano.Per prima cosa diluire il sangue intero uno a uno con PBST NNC al 10% in una provetta da 15 millilitri. Quindi, utilizzare un pipettatore all'impostazione più lenta per pipettare con cura 20 millilitri di sangue diluito su 12,5 millilitri di soluzione colloidale per co in acqua con una densità di 1,130 grammi per millilitro in una nuova provetta da 50 millilitri. Il tubo contenente il coll deve essere inclinato di un angolo di 45 gradi durante l'aggiunta del sangue.Posizionare con cura le provette nella centrifuga e farle girare a temperatura ambiente per 20 minuti a 800 Gs con bassa accelerazione e con i freni disabilitati al termine della centrifugazione. Rimuovere tutto il liquido e riempire ogni provetta con tampone di lisi eritrocitaria ghiacciato per lisciare gli eritrociti. Lasciare i tubi sul ghiaccio, capovolgendoli di tanto in tanto fino a quando la sospensione gira centrifuga rosso scuro a 500 GS per cinque minuti a quattro gradi Celsius con i freni inseriti.La frazione di pellet risultante contiene i PMN Insieme agli eritrociti, rimuovere il surnatante e lavare il pellet due volte in ghiaccio. Tampone di lisi a freddo a 500 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante dal secondo lavaggio, risospendere il pellet con il tampone di flusso a temperatura ambiente e determinare la concentrazione di PMN utilizzando un contatore di celle automatizzato.Infine, sospendere i PMN nel tampone di flusso a una volta da 10 a sei cellule per millilitro e mantenerli a temperatura ambiente per marcare la caderina VA giunzionale endoteliale e la pcam uno. Aggiungere l'anticorpo pcam LOR 6 47 con una diluizione da 1 a 100 e l'anticorpo FE cadherina ZI indipendente dal calcio con una diluizione da uno a 50 alla coltura VE, il terreno nella camera di flusso e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per preparare i PMN per il test, metterli a bagnomaria per 15 minuti a 37 gradi Celsius prima di iniettarli nel sistema di flusso.Collegare il tubo a una camera di flusso vuota e riempirlo con un tampone di flusso caldo per evitare la formazione di bolle d'aria. Durante l'impostazione del sistema di flusso. Utilizzando un tubo in silicone, collegare un lato della camera di flusso vuota al sistema di flusso della pompa a siringa contenente una siringa da 20 millilitri.Posizionare la camera di flusso sul tavolino del microscopio. Il test sarà eseguito utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotato dell'obiettivo ad olio 63x e di una camera climatica impostata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Collegare l'altro lato della camera di flusso vuota al pallone del serbatoio riempito con un tampone di flusso a 37 gradi Celsius e avviare la pompa a siringa per riempire tutti i tubi con il tampone di flusso, la pompa estrarrà il tampone di flusso dal serbatoio attraverso la camera di flusso nella siringa.Questo tubo contiene anche una porta di iniezione dell'esca in linea, che consente di iniettare i PMN con un ago in un esperimento in corso senza interrompere il flusso e creare bolle d'aria. Quindi, sostituire la camera di flusso vuota con la camera di flusso contenente TNF alfa VE pizzicare i tubi prima di scollegarli e ricollegarli alla camera contenente il VE.To evitare bolle d'aria nel sistema, è fondamentale pizzicare e bloccare i tubi. Quando si collega la diapositiva contenente le celle.Posizionare la camera di flusso sul tavolino del microscopio, regolare la velocità del flusso a un centesimo centimetro quadrato in base alla velocità del flusso fisiologico in es post capillare, che è da uno a cinque dines per centimetro quadrato registrare il contrasto di interferenza differenziale o DIC fite LOR 6 47. Contemporaneamente, utilizzando una siringa da un millilitro, iniettare lentamente il PMN nel sistema di flusso attraverso la porta di iniezione dell'esca in linea. Dopo pochi minuti, i leucociti compaiono, aderiscono e trasmigrano interrompono l'esperimento in qualsiasi momento desiderato.Scollegando il tubo dalla camera di flusso e pipettando l'aff fissativo nella camera di flusso, è stata misurata la resistenza dei monostrati endoteliali per verificare se gli anticorpi interferivano con la funzione di barriera dell'endotelio. Non è stato osservato alcun cambiamento nella resistenza quando il VE poteva sentire un clone di anticorpo 55 7 H uno o il controllo dell'isotipo è stato aggiunto alle cellule. Al contrario, l'anticorpo CL 75 che blocca l'udito del merluzzo VE ha ridotto drasticamente la resistenza.L'analisi RAP non ha rivelato alcun cambiamento nel recupero della fluorescenza in presenza o assenza dell'anticorpo VE CADHERIN 55 7 H one, indicando che l'anticorpo non ha alterato la dinamica della distribuzione di VE caderina, caderina VE e pcam one durante la migrazione transendoteliale dei neutrofili o TEM in tempo reale. Il pannello superiore mostra un neutrofilo delineato in bianco che aderisce all'endotelio e attraversa la giunzione cellula-cellula senza danneggiare la distribuzione del coerente VE e di quello pcam. Durante la diapedesi, si può osservare una dispersione locale di VE coerente e P chem uno quando un neutrofilo sporge attraverso le giunzioni cellula-cellula delineate in bianco è un neutrofilo sopra l'endotelio.Il contorno giallo mostra la membrana dei neutrofili che si trova già sotto l'endotelio. Dopo il completamento della diapedesi, le giunzioni si chiudono e ve coerenti e pcam uno vengono riposizionate nei siti di diapedesi. I bordi del neutrofilo transmigrato sono delineati in giallo.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire la migrazione transendoteliale dei leucociti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se i leucociti attraversano l'endotelio utilizzando il bagga o la radice transcellulare.

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Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

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Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Leucociti avidamente interagiscono con le cellule vascolari e le piastrine dopo lesione di parete del vaso o durante l'infiammazione. Qui, descriviamo un semplice test a flusso laminare per caratterizzare i meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni tra leucociti ed i loro partner cellulari.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Qui, presentiamo un protocollo integrato che misura sottopopolazione del monocito traffico sotto flusso in vitro mediante uso di specifici marcatori di superficie e microscopia a fluorescenza confocale. Questo protocollo consente di esplorare reclutamento sequenziale passaggi anche per quanto riguarda il profilo di altri sottotipi del leucocita utilizzando altri specifici marcatori di superficie.

Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

In questo protocollo, un test microfluido biomimetico, in grado di riprodurre un ambiente microvascolare fisiologicamente rilevante e riprodurre l'intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria, viene impiegato per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale nella malattia infiammatoria.

Un sistema microfisiologico per studiare l'interazione leucocitaria-cellula endoteliale durante l'infiammazione

Impara a visualizzare in tempo reale la migrazione dei neutrofili attraverso le giunzioni endoteliali in condizioni di flusso fisiologico. Questo metodo consente di distinguere le vie paracellulari e transcellulari.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

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