In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di seguire la distribuzione di giunzionali endogeni, terine e pcam durante la migrazione transendoteliale dei leucociti in condizioni di flusso fisiologico. Ciò si ottiene isolando prima i leucociti polimorfonucleati o PMN dall'intero sangue di volontari sani utilizzando un gradiente proco. Il secondo passo consiste nell'aggiungere anticorpi marcati in fluorescenza al monostrato di cellule endoteliali della vena ombelicale umana stimolato con TNF alfa coltivato in vetrini di flusso 30 minuti prima di iniziare l'esperimento di flusso.

Ciò consentirà la visualizzazione delle dinamiche giunzionali delle cellule endoteliali durante la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso fisiologico. Successivamente, il vetrino di flusso contenente le cellule endoteliali della vena ombelicale umana stimolate con TNF alfa marcato in fluorescenza viene collegato al sistema di flusso e posizionato sul tavolino del microscopio. La pompa estrarrà il tampone di flusso dal serbatoio attraverso la camera di flusso nella siringa.

Il passaggio finale consiste nell'iniettare lentamente i PMN nel sistema di flusso attraverso la porta di iniezione. Infine, i PMN vengono visualizzati utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Dopo pochi minuti, i leucociti compaiono, aderiscono e trasmigrano.

L'esperimento può essere interrotto in qualsiasi momento desiderato. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come i saggi di trasmigrazione statica, è che con questa tecnica è possibile studiare l'adesione e la trasmigrazione nella vita reale in condizioni di flusso fisiologico. Questo ci aiuterà a capire perché i leucociti scelgono una radice rispetto all'altra, quindi PGA contro migrazione transcellulare.

Lo facciamo visualizzando le giunzioni cellulari con anticorpi marcati in fluorescenza. Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana o HU X per questo esperimento vengono coltivate secondo le istruzioni del produttore su piastre rivestite di fibronectina utilizzando terreni integrati con crescita endoteliale. Medio. La coltura cellulare viene utilizzata tra i quattro e gli otto passaggi quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, lavarle accuratamente con PBS a temperatura ambiente a pH 7,4 e quindi la tripsina è le cellule dopo la tripsina e la centrifugazione.

Sospendiamo a 800.000 cellule per millilitro utilizzando i terreni. L'esperimento utilizza camere di flusso che sono state rivestite con fibronectina sulla piastra del giorno precedente. 80.000 cellule in ogni singolo canale della fibronectina codificano le camere di flusso e pipettano delicatamente la sospensione cellulare su e giù per la coltura durante la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica il giorno successivo.

Aggiornare il fluido nel vetrino della camera di flusso inclinandolo delicatamente con un angolo di 45 gradi. Si consiglia di rimuovere il fluido solo nei serbatoi e non nel canale stesso. La rimozione del terreno nei canali può causare la perdita e la morte delle cellule endoteliali a causa della forza di trascinamento del terreno causata dal pipettaggio.

Controllare al microscopio a contrasto di fase se le cellule endoteliali hanno formato un monostrato. Se le celle non sono cofluenti al 100%, cambiare il terreno due volte al giorno fino a raggiungere il 100% di confluenza. Una volta che le cellule hanno raggiunto il 100% di fluenza, stimolare le cellule con terreni contenenti il mediatore infiammatorio.

Il TNF alfa stimola l'uix durante la notte con il TNF alfa provoca un fenotipo infiammatorio dell'endotelio IE sovraregolazione delle molecole di adesione cellulare come ICAM one e VA M1. Prima di isolare i leucociti polimorfonucleati o PMN. Preparare un tampone di flusso per il lavaggio dei PMN isolati e per l'uso nel saggio di flusso a 100 millilitri di una soluzione madre precedentemente preparata. A 100 microlitri di cloruro di calcio fresco di un molare, 2,5 millilitri di albumina umana da una concentrazione di 200 grammi per litro e 0,1 grammi di glucosio.

Filtrare il tampone di flusso utilizzando un filtro da 0,45 micron. Prima dell'isolamento dei PMN viene inoltre preparata una soluzione di citrato trisodico al 10% o TNC in PBS a pH 7,4. I PMN saranno isolati da 20 millilitri di sangue intero raccolti in un'eparina sodica da un volontario sano.

Per prima cosa diluire il sangue intero uno a uno con PBST NNC al 10% in una provetta da 15 millilitri. Quindi, utilizzare un pipettatore all'impostazione più lenta per pipettare con cura 20 millilitri di sangue diluito su 12,5 millilitri di soluzione colloidale per co in acqua con una densità di 1,130 grammi per millilitro in una nuova provetta da 50 millilitri. Il tubo contenente il coll deve essere inclinato di un angolo di 45 gradi durante l'aggiunta del sangue.

Posizionare con cura le provette nella centrifuga e farle girare a temperatura ambiente per 20 minuti a 800 Gs con bassa accelerazione e con i freni disabilitati al termine della centrifugazione. Rimuovere tutto il liquido e riempire ogni provetta con tampone di lisi eritrocitaria ghiacciato per lisciare gli eritrociti. Lasciare i tubi sul ghiaccio, capovolgendoli di tanto in tanto fino a quando la sospensione gira centrifuga rosso scuro a 500 GS per cinque minuti a quattro gradi Celsius con i freni inseriti.

La frazione di pellet risultante contiene i PMN Insieme agli eritrociti, rimuovere il surnatante e lavare il pellet due volte in ghiaccio. Tampone di lisi a freddo a 500 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante dal secondo lavaggio, risospendere il pellet con il tampone di flusso a temperatura ambiente e determinare la concentrazione di PMN utilizzando un contatore di celle automatizzato.

Infine, sospendere i PMN nel tampone di flusso a una volta da 10 a sei cellule per millilitro e mantenerli a temperatura ambiente per marcare la caderina VA giunzionale endoteliale e la pcam uno. Aggiungere l'anticorpo pcam LOR 6 47 con una diluizione da 1 a 100 e l'anticorpo FE cadherina ZI indipendente dal calcio con una diluizione da uno a 50 alla coltura VE, il terreno nella camera di flusso e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per preparare i PMN per il test, metterli a bagnomaria per 15 minuti a 37 gradi Celsius prima di iniettarli nel sistema di flusso.

Collegare il tubo a una camera di flusso vuota e riempirlo con un tampone di flusso caldo per evitare la formazione di bolle d'aria. Durante l'impostazione del sistema di flusso. Utilizzando un tubo in silicone, collegare un lato della camera di flusso vuota al sistema di flusso della pompa a siringa contenente una siringa da 20 millilitri.

Posizionare la camera di flusso sul tavolino del microscopio. Il test sarà eseguito utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotato dell'obiettivo ad olio 63x e di una camera climatica impostata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Collegare l'altro lato della camera di flusso vuota al pallone del serbatoio riempito con un tampone di flusso a 37 gradi Celsius e avviare la pompa a siringa per riempire tutti i tubi con il tampone di flusso, la pompa estrarrà il tampone di flusso dal serbatoio attraverso la camera di flusso nella siringa.

Questo tubo contiene anche una porta di iniezione dell'esca in linea, che consente di iniettare i PMN con un ago in un esperimento in corso senza interrompere il flusso e creare bolle d'aria. Quindi, sostituire la camera di flusso vuota con la camera di flusso contenente TNF alfa VE pizzicare i tubi prima di scollegarli e ricollegarli alla camera contenente il VE.To evitare bolle d'aria nel sistema, è fondamentale pizzicare e bloccare i tubi. Quando si collega la diapositiva contenente le celle.

Posizionare la camera di flusso sul tavolino del microscopio, regolare la velocità del flusso a un centesimo centimetro quadrato in base alla velocità del flusso fisiologico in es post capillare, che è da uno a cinque dines per centimetro quadrato registrare il contrasto di interferenza differenziale o DIC fite LOR 6 47. Contemporaneamente, utilizzando una siringa da un millilitro, iniettare lentamente il PMN nel sistema di flusso attraverso la porta di iniezione dell'esca in linea. Dopo pochi minuti, i leucociti compaiono, aderiscono e trasmigrano interrompono l'esperimento in qualsiasi momento desiderato.

Scollegando il tubo dalla camera di flusso e pipettando l'aff fissativo nella camera di flusso, è stata misurata la resistenza dei monostrati endoteliali per verificare se gli anticorpi interferivano con la funzione di barriera dell'endotelio. Non è stato osservato alcun cambiamento nella resistenza quando il VE poteva sentire un clone di anticorpo 55 7 H uno o il controllo dell'isotipo è stato aggiunto alle cellule. Al contrario, l'anticorpo CL 75 che blocca l'udito del merluzzo VE ha ridotto drasticamente la resistenza.

L'analisi RAP non ha rivelato alcun cambiamento nel recupero della fluorescenza in presenza o assenza dell'anticorpo VE CADHERIN 55 7 H one, indicando che l'anticorpo non ha alterato la dinamica della distribuzione di VE caderina, caderina VE e pcam one durante la migrazione transendoteliale dei neutrofili o TEM in tempo reale. Il pannello superiore mostra un neutrofilo delineato in bianco che aderisce all'endotelio e attraversa la giunzione cellula-cellula senza danneggiare la distribuzione del coerente VE e di quello pcam. Durante la diapedesi, si può osservare una dispersione locale di VE coerente e P chem uno quando un neutrofilo sporge attraverso le giunzioni cellula-cellula delineate in bianco è un neutrofilo sopra l'endotelio.

Il contorno giallo mostra la membrana dei neutrofili che si trova già sotto l'endotelio. Dopo il completamento della diapedesi, le giunzioni si chiudono e ve coerenti e pcam uno vengono riposizionate nei siti di diapedesi. I bordi del neutrofilo transmigrato sono delineati in giallo.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire la migrazione transendoteliale dei leucociti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se i leucociti attraversano l'endotelio utilizzando il bagga o la radice transcellulare.