Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come eseguire l'imaging a fluorescenza con una precisione di un nanometro o esperimenti Fiona. Ciò si ottiene impostando prima l'attrezzatura richiesta e allineando l'ottica per la riflessione interna totale, la fluorescenza, la microscopia o il tappeto erboso. Il passo successivo consiste nell'immobilizzare CY 3D NA sulla superficie interna di una camera di campionamento e localizzare singole molecole di CY 3D NA con precisione nanometrica.

Successivamente, Fiona viene applicata per studiare il movimento di una singola miosina tronca cinque, un motore etichettato con un punto quantico. In definitiva, la dimensione del passo della miosina mentre cammina, Acton è stato misurato come 36 nanometri dall'analisi di Fiona. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui motori molecolari, può essere applicato anche ad altri sistemi come il tracciamento dei recettori sulla membrana delle cellule.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i dettagli sperimentali sono difficili da apprendere. È importante indossare sempre occhiali di sicurezza laser durante la configurazione. Per la riflessione interna totale, la fluorescenza, la microscopia o il tappeto erboso.

Per iniziare, impostare le altezze di tutti i componenti ottici all'altezza del centro del microscopio, della porta posteriore, del supporto laser, dell'otturatore laser e dei filtri ND. Utilizzare i filtri ND per attenuare il più possibile la potenza del laser, mantenendo visibile il raggio. Serrare le viti con le apposite chiavi esagonali.

Pianificare un percorso del fascio di travatura, come illustrato dalle linee blu tratteggiate. In questo schema, segnare il percorso del raggio con nastro adesivo o pennarello sul tavolo ottico. Posizionare lo specchio M1 alla prima curva ad angolo retto, posizionare i due iridi lungo la seconda sezione rettilinea del percorso del fascio pianificato.

Regolare sia la posizione che l'inclinazione di M1 in modo tale che il laser passi attraverso l'iride posizionare lo specchio M due. Alla seconda svolta ad angolo retto, posizionare l'espansore del raggio 10 x lungo il terzo tratto rettilineo del percorso. Regolare l'inclinazione in modo che l'espansore del raggio sia parallelo sia al tavolo ottico che al percorso del raggio pianificato.

Il passo successivo consiste nel regolare M1 e M due in modo iterativo in modo che il laser passi direttamente attraverso i centri di entrambe le lenti, L uno e L due dell'espansore del raggio. Utilizzare un pezzo di carta bianca per bloccare il raggio dopo l'espansore del raggio per controllare il profilo del raggio a occhio. Regolare fino a quando il profilo del raggio espanso non è ED.

Gaussian regola la distanza tra L uno e L due in modo tale che il raggio sia fascicolato dall'otturatore. Il laser svita l'obiettivo del microscopio e avvita un allineamento fluorescente. Posizionare il bersaglio sugli specchi M tre e M quattro per dirigere il raggio espanso nella porta del microscopio e sullo specchio dicroico.

All'interno della torretta. Regolare M tre per centrare la parte più luminosa del raggio sul bersaglio fluorescente e M quattro per far inclinare il raggio verticalmente, chiudere il laser e riavvitare l'obiettivo. Bene. Regola le inclinazioni di M tre e M quattro per ottimizzare la potenza del laser e il profilo del raggio fuori dall'obiettivo.

Montare una fotocamera E-M-C-C-D sul microscopio e collegare la fotocamera a un computer. Avviare il software per la fotocamera. Montare un campione fluorescente sul microscopio.

Guarda il punto fluorescente luminoso sulla fotocamera. Verificare che il punto non si sposti sullo schermo poiché la messa a fuoco è cambiata. Posizionare la lente TIR sul tavolino di traslazione XY, Z ad una distanza dal piano focale posteriore dell'obiettivo che sia uguale alla lunghezza focale, la L tre, che è di circa 30 centimetri.

Regolare la posizione di L tre in modo che il laser passi attraverso il centro della lente. Traslare L tre lungo il percorso della trave per regolare la fascicolazione della trave. Assicurarsi che il raggio sia ancora centrato sul monitor e di forma simmetrica.

Traslare L tre perpendicolarmente al percorso del raggio per inclinare il raggio fuori dall'obiettivo. Continuare a tradurre l'obiettivo TIR in modo tale che il TIR sia raggiunto prima di eseguire una Fiona. Esperimento sulla localizzazione e mobilizzazione di CY 3D NA. Le singole molecole costruiscono camere campione come dettagliato nel testo del protocollo.

Due strisce di nastro biadesivo vengono applicate sul vetrino lungo i bordi lunghi, lasciando uno spazio da tre a cinque millimetri al centro e quindi un vetrino coprioggetti pulito viene posizionato sopra il vetrino laterale della camera da destra e dalla parte anteriore vengono mostrate. Le estremità aperte della camera vengono lasciate aperte e fungono da ingresso e uscita per immobilizzare SI 3D NA sulle superfici interne della camera del campione. Pipettare 10 microlitri di biotina BSA nella camera.

Attendi cinque minuti. Lavare la camera del campione pipettando 40 microlitri di T 50 BSA nella camera. Quindi pipettare 10 microlitri di neut travain nella camera e incubare per cinque minuti.

Lavare nuovamente la camera con 40 microlitri di pipetta T 50 BSA, 20 microlitri di SI 3D NA nella camera del campione e incubare per cinque minuti. Infine, lavare la camera con 80 microlitri di T 50 BSA. Per iniziare la procedura di imaging di singole molecole SI 3D NA sotto il tappeto erboso M, pipettare 30 microlitri di tampone di imaging nella camera del campione e attendere da otto a 10 minuti.

Monta il campione per l'imaging su un microscopio per tappeti erbosi dotato di un laser verde, un obiettivo a immersione in olio 100X e una fotocamera E-M-C-C-D. Impostare il tempo di esposizione e il guadagno EM. Acquisire un filmato del campione per 1000 fotogrammi.

Compila ed esegui Fiona Pro per l'analisi di Fiona. Utilizzare questo programma IDL per importare l'immagine acquisita, inserire la dimensione effettiva dei pixel e il fattore di conversione da intensità a numero di fotoni e scegliere i punti per l'analisi di Fiona. Al termine, il programma produrrà i risultati dell'adattamento con funzioni gaussiane 2D, nonché il numero totale di fotoni e la precisione di localizzazione compilano ed eseguono il conteggio del pH pro.

Per caratterizzare il conteggio dei fotoni, utilizzare questo programma DL per misurare il numero medio di fotoni emessi da una flora. Quattro prima dello sbiancamento delle foto per importare l'immagine acquisita e per inserire il fattore di conversione da intensità a numero di fotoni. Il programma rileverà i punti fluorescenti, calcolerà automaticamente il conteggio dei fotoni in funzione del numero di fotogramma e produrrà le tracce del conteggio dei fotoni.

Preparare il campione per questo esperimento pipettando 20 microlitri di BSA biotinilato a un milligrammo per millilitro in DD H2O in una camera del campione. Incubare per 10 minuti. Sciacquare con 30 microlitri di D ddh, due pipette O in 0,5 milligrammi per millilitro di neut travain e incubare per due minuti.

Lavare la camera con 30 microlitri di M cinque PSA. L'atto per questo esperimento deve essere preparato il giorno precedente come descritto nel testo del protocollo. Diluire la f actina preparata 25 volte in generale, tampone di actina fino a una concentrazione finale di circa 0,004 milligrammi per millilitro.

Pipettare la soluzione di actina nella camera e attendere 10 minuti. Sciacquare la camera con 30 microlitri di tampone diluire la miosina cinque A con le etichette a bandiera da 30. Piegare un tampone M five fino a una concentrazione finale di 250 nano molari.

Mescolare un microlitro di miosina diluita con un microlitro di Anti-Flag Q.Do 7 0 5. Aggiungere otto microlitri di M cinque per riempire a 10 microlitri e pipettare su e giù per mescolare. Incubare bene per 10 minuti con ghiaccio.

Pipettare 20 microlitri di tampone di imaging contenente miosina Q dot nella camera del campione. Incubare per 8-10 minuti. Visualizzare il campione al microscopio per tappeti erbosi con un'esposizione di 30 millisecondi.

Acquisisci almeno 1000 fotogrammi per iniziare l'analisi dei dati. Apri il file video nell'immagine J e ritaglia il video attorno a un punto in movimento. Traccia il punto attraverso il video per generare coordinate X e Y nel tempo in pixel applicando l'analisi Fiona a ogni singolo fotogramma del video.

Converti i pixel in nanometri come descritto nel testo del protocollo. Calcola lo spostamento dalla posizione iniziale in funzione del tempo. Eseguire un test T sullo spostamento per ottenere i passi della miosina deambulante.

Elimina tutti i valori zero dalla colonna delle dimensioni del passo. Traccia la distribuzione delle dimensioni dei passi utilizzando origin o matlab. Adattare una gaussiana all'istogramma.

In questa immagine tipica di superficie immobilizzare SI 3D NA. La freccia gialla indica una singola molecola SI 3D NA la cui funzione di diffusione del punto o PSF è mostrata qui. La PSF è dotata di una funzione gaussiana bidimensionale e vengono mostrati anche i residui di adattamento. Questo grafico è una traccia tipica del conteggio dei fotoni rispetto al numero di fotogrammi e l'adattamento esponenziale fornisce il numero medio di fotoni di circa 1,4 volte 10 al sesto per misurare la dimensione del passo della miosina un file video con un buon rapporto segnale/rumore di una singola miosina.

Mentre cammina, viene catturato un filamento di actina. Vengono mostrati tre fotogrammi di esempio. L'applicazione di Fiona a ciascun fotogramma produce una traccia di distanza rispetto al tempo tracciata in rosso.

Un algoritmo di ricerca dei passi basato sul T-test viene utilizzato per estrarre i singoli passaggi e l'output viene sovrapposto in bianco Le dimensioni dei passi e i nanometri sono etichettati in bianco. Quando i passi di più tracce vengono combinati in un istogramma, le dimensioni dei passi misurate sono gaussiane distribuite a circa 35,8 nanometri più o meno. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire gli esperimenti di Fiona, inclusa l'impostazione di un microscopio per tappeti erbosi Per ottenere i migliori risultati Con queste procedure, è importante ridurre al minimo i danni fotografici all'uso della forza sul pavimento e agli esperimenti.

Non dimenticare che lavorare con la microscopia del tappeto erboso e Fiona può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario indossare precauzioni come occhiali di sicurezza.