Name: Isolamento dellRNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara a isolare RNA ad alta integrità dal pancreas di topo ricco di ribonucleasi. Questo metodo garantisce un numero di integrità RNA superiore a sette per analisi di espressione genica affidabili.

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Ringraziamo Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paolo Grippo e Satyanarayana Rachagani per i loro utili commenti, suggerimenti e condivisione delle loro protocolli. Questo lavoro è stato sostenuto da U01CA111294 sovvenzione e un premio di sviluppo dell&#39;idea del programma di ricerca intramurale Ohio State University.

1. Preparazione Le seguenti pratiche aderiscono ai criteri impostati da cura degli animali ed uso commissione dell&#39;Istituzione (IACUC). <ol><li> Si raccomanda di isolare non più di 6 pancreas di topo in un dato giorno. Hanno tutti gli strumenti chirurgici puliti e sterilizzati in autoclave, un set per ogni animale. </li><li> Etichettare tutti i tubi microcentrifuga. Quattro 2 ml provette per animali. </li><li> Mettere 8 ml di reagente di lisi in 50 ml provette da centrifuga su ghiaccio. Nota: Mentre il kit di purificazione viene fornito con un guanidina tiocianato reagente fenolo che è adatto per l&#39;isolamento pancreas, reagente di lisi viene utilizzato a causa dei grandi volumi che sono necessari per l&#39;isolamento. </li><li> Versare circa 10 ml delle seguenti soluzioni in provette da 15 ml per centrifuga per la pulizia di spazzole del omogeneizzatore. Etanolo, 70% (2 tubi), acqua di qualità per HPLC (1 tubo) e acqua di qualità per HPLC contenente circa 200 ml di RNase via o inattivatore ribonucleasi equivalente. </li></ol&gt; 2. Chirurgia, Pancreas Dissection e omogeneizzazione <ol><li> Mettere 1-2 ml di isoflurano in un barattolo contenente garza di cotone o tovaglioli di carta. I topi sono posti su una piattaforma che impedisce loro di raggiungere la fonte del isoflurano. Aggiungi isoflurano fresco al vaso prima di anestetizzare ogni mouse. </li><li> Posizionare delicatamente il mouse nel barattolo contenente il isoflurano. Tappare il vaso e monitorare gli effetti dell&#39;anestesia ruotando delicatamente il barattolo avanti e indietro. L&#39;animale viene anestetizzato una volta che è in grado di stare nel suo &#39;. </li><li> Per la conferma di anestesia, togliere l&#39;animale dal vaso e applicare un pizzico punta ditta. Se il mouse non reagisce al pizzico punta, passare al punto 2.5. </li><li> Se il mouse reagisce pizzico punta, quindi ripetere i passaggi 2,2-2,3. </li><li> Posizionare l&#39;animale anestetizzato sul banco in posizione prona. Dislocare cervice del mouse ermeticamente ponendo la mano sinistra sul collo del mouse. Noizione la mano destra afferrare la coda del topo e tirare verso l&#39;alto ad un angolo di circa 45 ° per dislocare la cervice rapidamente. </li><li> Fissare la carcassa di una superficie (un pezzo livello di polistirolo ricoperto di carta assorbente) da piercing ciascuno dei quattro zampe dell&#39;animale nella superficie piatta usando 25 calibro aghi ipodermici. </li><li> Utilizzando strumenti chirurgici sterili, tagliare la parte mediana del mouse aperta e rapidamente rimuovere il pancreas dal mouse. Utilizzare le pinze per tenere il pancreas e tagliarlo dalla milza e intestino tenue con le forbici a molla. Fare attenzione a non allungare il pancreas durante la cancellazione dal mouse. Turbativa del tessuto potrebbe rilasciare ribonucleasi. Nota: Il tempo necessario per rimuovere il pancreas dal mouse è critica. Un esperto dovrebbe essere in grado di sezionare pancreas di circa 1 minuto o meno. </li><li> Porre l&#39;intero pancreas in una provetta da 50 ml contenente 8 ml di ghiaccio freddo reagente di lisi. Tappare la provetta e brevemente agitare per immergere il tiSSUE nel reagente e procedere alla fase successiva senza indugio. Il rapporto di reagente di lisi di tessuto è critica. Vedere la sezione Risultati per un confronto dell&#39;integrità dell&#39;RNA isolato utilizzando diversi volumi di reagente di lisi. </li><li> Omogeneizzare per 5 sec. È importante premere le lame omogeneizzatore al fondo della provetta da centrifuga per permettere al tessuto di essere tirato nelle lame di omogeneizzazione efficiente. </li></ol> 3. Rimozione di tessuto non digerito Nota: Dopo omogeneizzazione, piccoli frammenti di tessuto rimarranno nel reagente di lisi. E &#39;più importante per la lisi rapidamente il tessuto lasciando un po&#39; di tessuto non digerito, piuttosto che su di omogeneizzazione e il degrado rischio di RNA. <ol><li> Trasferimento di 2 ml di reagente di lisi contenente il pancreas lisati di una provetta 2 ml. Raccogliere due tubi microcentrifuga di omogenato per isolamento. Eliminare l&#39;omogeneizzato rimanente o conservare a -80 ° C per gli studi futuri. </li><li> Centrifuge a 4 ° C, 12000 × g per 5 min a pellet tessuto non digerito. Questo è un passo fondamentale, come riporto di tessuto non digerito nelle successive soluzioni di RNA probabilmente contaminare il campione con ribonucleasi (punto 5.13). </li><li> Trasferire 1 ml del supernatante in una provetta 2 ml. Procedere con l&#39;isolamento subito e memorizzare il tubo replica a -80 ° C per un uso futuro. Posizionare tutte le provette contenenti omogeneizzato sul ghiaccio bagnato mentre si procede alla fase successiva. </li><li> Smaltire il restante reagente di lisi in un apposito contenitore di rifiuti chimici. </li></ol> 4. Pulizia delle Blades Omogeneizzatore <ol><li> Prima di procedere all&#39;isolamento successivo, pulire le lame omogeneizzatore mettendoli in 10 ml di etanolo al 70%. Attivare l&#39;omogeneizzatore per circa 20 sec per rimuovere eventuali pezzi di tessuto che può essere catturato nelle lame. </li><li> Utilizzare una punta di 200 microlitri pipetta per rimuovere eventuali pezzi che rimangono nelle lame omogeneizzatore. </li&gt; <li> Ripetere il punto 4.1 in acqua, generale inattivatore Rnase e il 70% di etanolo. Asciugare l&#39;albero omogeneizzatore con Kim pulito pulire. </li><li> Ripetere il punto 2.1 per l&#39;isolamento pancreas dei rimanenti animali, mantenendo RNA isolato da ogni animale separato piuttosto che mettere in comune l&#39;RNA. </li></ol> 5. Isolamento RNA La sezione seguente è identico al protocollo del kit di purificazione. Il vantaggio del kit di purificazione è che sarà isolare l&#39;RNA totale compreso piccoli RNA. <ol><li> Se si utilizza la soluzione omogeneizzato congelato, scongelare il ghiaccio umido e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere 200 ml di cloroformio, tappare la provetta e agitare vigorosamente a mano per 15 sec. Lasciate che il tubo di riposare a temperatura ambiente per 2-3 min. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 12.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta. Aggiungere 1,5 volumi di isopropanolo e mescolare accuratamente pipettando su e giù parecchie volte. </li><li> Trasferimento fino a 700 microlitri di campione in una colonna di spin che viene inserito in un tubo di raccolta da 2 ml. Chiudere il coperchio e centrifugare a 8000 xg per 15 secondi a temperatura ambiente. </li><li> Gettare il flow-through. </li><li> Ripetere i passaggi 5,5-5,6, con il resto del campione. </li><li> Aggiungere 700 microlitri Buffer RWT alla colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flow-through. </li><li> Dispensare 500 microlitri Buffer RPE nella colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8000 xg per lavare la colonna. Gettare il flow-through. </li><li> Aggiungere 500 microlitri Buffer RPE alla colonna di spin. Centrifugare per 2 minuti a 8000 xg per asciugare la colonna. </li><li> Trasferire la colonna di selezione per una provetta da 1,5 ml. Dispensare 80 microlitri acqua priva di ribonucleasi direttamente sulla membrana colonna di spin. Centrifugare per 1 min a 8000 xg per eluire l&#39;RNA. </li><li> Aggiungere inibitore RNasi 1 microlitri di soluzione di RNA. Conservare a -80 ° C o procedere alla 5.13. </li><li> Per convalidare l&#39;integrità dell&#39;RNA, prima calcolare il conce RNAntration e 260/280 rapporto utilizzando uno spettrofotometro. </li><li> Diluire una porzione della soluzione di RNA a circa 500 ng / ml con acqua per biologia molecolare. </li><li> Determinare l&#39;RNA Integrity (cioè, RIN) utilizzando l&#39;analisi di elettroforesi capillare. Circa 5 ml di soluzione di RNA è sufficiente per l&#39;analisi. </li><li> Aliquotare la soluzione RNA (vedere Figura 2) e conservare a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li>
<li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li>
<li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry++FEBS%22%5BJournal%5D)">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA+A+Laboratory+Manual%22">RNA A Laboratory Manual</a>. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments++JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Isolare RNA da tessuti che sono ribonucleasi ricco rappresenta una grande sfida per esperimenti di biologia molecolare. I vari reagenti e kit sono disponibili in commercio che si basano principalmente sul metodo fenolo guanidina tiocianato di estrazione di RNA. Guanidina tiocianato denatura proteine ​​e quindi riduce l&#39;attività di ribonucleasi. Tuttavia, l&#39;ampiezza delle ribonucleasi nel pancreas richiede ulteriori modifiche ai protocolli standard di isolamento dell&#39;RNA. Un protocollo è riportato qui che si ...

È necessario isolamento di RNA con grande integrità per esperimenti di routine di biologia molecolare come Northern blotting 9, qRT-PCR 1 o gene expression profiling 5. La maggior parte dei metodi contemporanei di isolamento dell&#39;RNA si basano sulle modificazioni dei protocolli tiocianato di guanidina 2, 3. Guanidina tiocianato è un forte proteina denaturante e verrà efficacemente interrompere l&#39;attività di ribonucleasi in molte condizioni. Il metodo popolare di Chomczynski e Sacchi 3 combinato fenolo alla soluzione di guanidina tiocianato lisi, riducendo il tempo di isolamento per circa 4 ore. Molti reagenti di estrazione dell&#39;RNA commercialmente disponibili sono basati sul metodo Chomczynski e Sacchi 3. Ribonucleasi ricchi tessuti come umano o il mouse pancreas presenta una sfida aggiuntiva per isolare RNA. Pancreas mouse può contenere fino a 75 mg di ribonucleasi 6, alcune delle quali verrà rilasciato During rottura del tessuto pancreatico conseguente autolisi tessuto. Modifiche dei protocolli guanidina tiocianato sono stati utilizzati con successo per isolare l&#39;RNA da pancreas con alta integrità 2, 4, 7, 10. L&#39;infusione di RNA stabilizzante in topo pancreas facilitato isolamento di RNA con elevata integrità 4, 7, 10, tuttavia infusione di Le soluzioni nel pancreas richiede grande abilità, possono richiedere strumenti specializzati come un microscopio da dissezione e interrompere architettura del tessuto durante la procedura può provocare la lisi cellulare. Perfusione tissutale con reagente stabilizzazione dell&#39;RNA potrebbe interferire con altre applicazioni, tra cui l&#39;isolamento delle proteine ​​e la colorazione istologica. Inoltre, questa tecnica non è adatto per isolare l&#39;RNA da pancreas umano. Altri protocolli richiedono la preparazione di soluzioni specifiche dallo sperimentatore 2. Riportiamo un protocollo per isolare l&#39;RNA con grande integrità di topo pancreas. The protocollo utilizza elementi dei metodi precedentemente pubblicati ed è in gran parte basata su protocolli standard di fenolo / guanidina a base di tiocianato-lisi reagenti. Non richiede la preparazione di soluzioni specializzate né richiede infusione di reagenti nelle pancreas. Passaggi critici per il successo di isolamento di RNA comprendono un elevato fenolo / guanidina-basato lisi reagente rapporto tra tessuto, la rimozione del tessuto non digerito prima fase la separazione e l&#39;inclusione di un inibitore della ribonucleasi alla soluzione RNA risultante. Utilizzando queste e altre modifiche, di solito isolare l&#39;RNA con RIN superiore a 7 da utilizzare per l&#39;analisi di espressione genica di routine.

<table><tbody><tr><td>Potenza Gen 500&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-03&nbsp;</td><td>omogeneizzatore</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Microcentifugo refrigerato</td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Reagente Lisi</td></tr><tr><td>Student Vannas forbici a molla</td><td>Fisher</td><td>91500-09&nbsp;</td><td>Utilizzare per tagliare il pancreas dai tessuti attaccati</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche, 6 pollici</td><td>Fisher</td><td>08-951-20</td><td>Utilizzare per tagliare la fessura del topo</td></tr><tr><td>Pinze smussate</td><td>Fisher</td><td>1381239</td><td>Utilizzare per trattenere il pancreas durante la dissezione</td></tr><tr><td>di isoflurano USP</td><td>Abbott Labs</td><td>4/8/5210</td><td>Uscita</td></tr> di <tr><td>rnasi anestetica (40 U/&micro; l)</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Inhbitor</td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>Inattivatore Rnase generale</td></tr><tr><td>Acqua di grado HPLC</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td>Per il lavaggio delle lame dell'omogeneizzatore</td></tr><tr><td>Acqua di grado di biologia molecolare</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.03</td><td>Eluizione dell'RNA</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td> Kit di <td>purificazione</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>del 217004 QiagenProvette per microcentrifuga da 2 ml, certificate Rnase Dnase free</td><td>USA Scientific Plastics</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &; l puntali per pipette</td><td>Rainin</td> GPL200F <td>Per la pulizia delle lame dell'omogeneizzatore</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-1000</td></tr><tr><td>Bioanalizzatore</td><td>Agilent</td><td></td><td>Analizzatore di elettroforesi capillare per misurare l'integrità dell'RNA</td></tr><tr><td>Reagente di stabilizzazione dell'RNA</td><td></td> <td>Ambion</td><td></td> Anni&nbsp;</tr><tr><td>RNeasy&nbsp; colonne di rotazione&nbsp;</td><td>Colonne Qiagen</td><td></td><td>Spin&nbsp; come parte del miRNeasy Mini kit</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Chales River</td><td>Strain C57BL/6</td><td>La loro età variava da 4 a 12 mesi. &nbsp;</td></tr><tr><td>Topi</td><td>Jackson Lab</td><td>ceppo 129</td><td>La loro età variava da 4 a 12 mesi. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolamento dell&#39;rna da mouse pancreas: un tessuto ricco ribonucleasi

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

L'isolamento di RNA di alta qualità da tessuti ricchi di ribonucleasi come il pancreas di topo rappresenta una sfida. Poiché una funzione primaria del pancreas è quella di aiutare la digestione, il pancreas di topo può contenere fino a 75 mg di ribonucleasi. Riportiamo modifiche dei protocolli standard dei reagenti di lisi fenolo/guanidina tiocianato per isolare l'RNA dal pancreas di topo. Il tiocianato di guanidina è un potente denaturante proteico e interrompe efficacemente l'attività della ribonucleasi nella maggior parte delle condizioni. Tuttavia, sono necessarie modifiche critiche ai protocolli standard per isolare con successo l'RNA da tessuti ricchi di ribonucleasi. Le fasi chiave includono un elevato rapporto reagente di lisi/tessuto, la rimozione del tessuto non digerito prima della separazione di fase e l'inclusione di un inibitore della ribonucleasi nella soluzione di RNA. Utilizzando queste e altre modifiche, isoliamo abitualmente l'RNA con un numero di integrità dell'RNA (RIN) maggiore di 7. L'RNA isolato è di qualità adeguata per l'analisi di routine dell'espressione genica. L'adattamento di questo protocollo per isolare l'RNA da tessuti ricchi di ribonucleasi oltre al pancreas dovrebbe essere facilmente realizzabile.

La resa RNA totale da 1 ml di omogenato lisi è 20-40 mg. OD 260/280 rapporti sono in genere circa il 2,0 e il RIN sono costantemente maggiore di 7.0. Se il RIN è ≤ 6, l'isolamento dovrà essere ripetuta. Occasionalmente, un RIN che è superiore a 8,0 si ottiene. I due metodi più comunemente usati di eutanasia topi prima della rimozione del pancreas sono CO 2 asfissia o inalazione di isoflurano. Entrambe le tecniche sono seguiti da dislocazione cervicale. Poiché è possibile che il te...

Riportiamo una procedura per isolare l'RNA con elevata integrità dal pancreas di topo ricco di ribonucleasi.

Isolamento dell&#39;RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare l'RNA con elevata integrità dal pancreas di topo della cresta della ribonucleasi. Ciò si ottiene rimuovendo rapidamente il pancreas dalla carcassa di un topo soppresso. Successivamente, il pancreas è stato immerso nel reagente di lisi e il tessuto è stato omogeneizzato.Dopo la centrifugazione, l'RNA viene isolato dal surnatante utilizzando protocolli standard e la soluzione inibitrice dell'RNA viene aggiunta alla soluzione finale di RNA. Il passaggio finale consiste nel pulire accuratamente le lame dell'omogeneizzatore rimuovendo eventuali pezzi di tessuto intrappolati nelle lame e quindi eseguendo una serie di lavaggi con etanolo e acqua. In definitiva, questa procedura consente l'isolamento dell'RNA per il pancreas di topo con un numero di integrità dell'RNA superiore a sette da utilizzare per l'analisi di routine dell'espressione genica.Mi chiamo Tom Schmid e lavoro con l'RNA da oltre 20 anni e, in tutto questo tempo, non ho mai sperimentato nulla di così difficile come isolare l'RNA con un'elevata integrità per il pancreas di topo. La tecnica che stiamo per mostrarvi è stata sviluppata per il pancreas di topo, ma in realtà non c'è motivo per cui non possa essere utilizzata per una varietà di altri tessuti, compresi i tessuti di cellule umane, linee cellulari o altri tessuti di topo, compresi i tessuti ricchi di nucleasi costali come la milza. L'utilizzo dei suggerimenti di questo protocollo consentirà di isolare l'RNA con elevata integrità dal pancreas di topo.Questo potrebbe essere utilizzato per molte applicazioni a valle come QPCR, array di espressione genica o RNA-Seq. Ola Elgamal. Uno studente laureato del mio laboratorio dimostrerà questa tecnica dopo l'eutanasia del topo come descritto nel protocollo di testo.Fissare la carcassa perforando ciascuna delle quattro zampe dell'animale su una superficie piana utilizzando aghi ipodermici calibro 25 utilizzando strumenti chirurgici sterili. Taglia la parte centrale del mouse e rimuovi rapidamente il pancreas dal topo. Usa la pinza per tenere il pancreas e taglialo via dalla milza e dall'intestino tenue usando le forbici a molla.Fare attenzione a non allungare il pancreas durante la rimozione dal mouse. La rottura del tessuto potrebbe rilasciare ribonucleasi. Posizionare l'intero pancreas in una provetta da 50 centimetri cubi contenente otto millilitri di reagente di lisi ghiacciata.Tappare la provetta e agitare brevemente per immergere il tessuto nel reagente e procedere immediatamente alla fase successiva senza indugio. Quindi, omogeneizzare il pancreas per cinque secondi. È importante premere le lame dell'omogeneizzatore sul fondo della provetta da centrifuga per consentire al tessuto di essere tirato nelle lame per un'omogeneizzazione efficiente.Per rimuovere il tessuto non digerito, trasferire due millilitri di reagente di lisi contenente il pancreas lisato in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Raccogliere due provette da microcentrifuga di omogeneizzato per centrifuga di isolamento a quattro gradi Celsius, 12.000 volte G per cinque minuti per pellettare il tessuto non digerito. Questo è un passaggio critico in quanto il carryover di tessuto non digerito nelle successive soluzioni di RNA probabilmente contaminerà il campione con ribonucleasi.Pulire le lame dell'omogeneizzatore immergendole in 10 millilitri di etanolo al 70%. Attiva l'omogeneizzatore per circa 20 secondi per rimuovere eventuali pezzi di tessuto che potrebbero essere impigliati nelle lame. Quindi utilizzare un puntale per pipetta da 200 microlitri per rimuovere eventuali pezzi rimasti nelle lame dell'omogeneizzatore.Pulire nuovamente le lame dell'omogeneizzatore in acqua, attivatore generale della sintesi a RNA e etanolo al 70%. Infine, asciugare lo stelo dell'omogeneizzatore con una salvietta Kim pulita. Trasferire un millilitro di SNA in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.Posizionare tutte le provette contenenti omogeneizzato sul ghiaccio umido mentre si procede al passaggio successivo. Procedere immediatamente con l'isolamento dell'RNA e conservare la provetta replicata a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Smaltire il reagente di lisi rimanente in un apposito contenitore per rifiuti chimici.La sezione seguente utilizza un kit di purificazione dell'RNA. Il vantaggio del kit di purificazione è che isolerà l'RNA totale, compresi gli RNA piccoli. Iniziare l'isolamento aggiungendo 200 microlitri di cloroformio alla soluzione omogeneizzata.Tappare il tubo e agitare energicamente a mano per 15 secondi. Quindi lasciare riposare la provetta a temperatura ambiente per due o tre minuti dopo la centrifugazione per 15 minuti a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius. Trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta da microcentrifuga.Aggiungere 1,5 volumi di isopropanolo e mescolare accuratamente pipettando su e giù più volte. Trasferire fino a 700 microlitri di campione in una colonna di centrifuga che viene posta in una provetta di raccolta da due millilitri. Chiudere il coperchio e centrifugare a 8.000 volte G per 15 secondi a temperatura ambiente, quindi scartare il flusso.Quindi, aggiungere 700 microlitri di tampone RWT alla colonna di centrifugazione e centrifugare. Come in precedenza, scartare il flusso attraverso la pipetta 500 microlitri di tampone RPE nella colonna di centrifuga e centrifugare nuovamente per lavare la colonna. Dopo aver scartato il flusso, aggiungere altri 500 microlitri di RPE tampone alla centrifuga a colonna rotante per due minuti a 8.000 volte G.To asciugare la colonna, trasferire la colonna rotante in una pipetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri 100 microlitri di acqua libera dal nucleo della costola direttamente sulla centrifuga a membrana a colonna rotante per un minuto alle 8, 000 volte G per eluire, l'RNA.Quindi aggiungere un microlitro di inibitore di RNA alla soluzione di RNA e procedere a determinare l'integrità dell'RNA utilizzando l'analisi dell'elettroforesi capillare come descritto nel protocollo di testo, il confronto del numero di integrità dell'RNA o RIN dell'RNA isolato dal pancreas di topo rivela una correlazione diretta tra il volume del reagente di lisi utilizzato nell'omogeneizzazione e l'integrità dell'RNA. I risultati indicano che dovrebbero essere utilizzati otto millilitri di reagente di lisi In questo protocollo, l'inibitore della ribonucleasi è stato aggiunto alla soluzione acquosa di RNA e l'integrità dell'RNA è stata confrontata al momento del congelamento, del disgelo. Il RIN per la soluzione di RNA con inibitore era 7,3 più o meno 0,15 rispetto a 2,9 più o meno 0,65 per la soluzione che non conteneva inibitore per esaminare la possibilità che il congelamento ripetuto denatura l'inibitore della ribonucleasi rendendolo inefficace.È stata testata una soluzione di RNA contenente inibitore della ribonucleasi. Le soluzioni di RNA che sono state congelate e scongelate fino a cinque volte hanno comunque prodotto un RIN di sette o superiore. Mentre le soluzioni che sono state congelate e scongelate sei volte o più hanno prodotto un RIN inferiore a sette primi casuali, il CDNA è stato sintetizzato dall'RNA e l'espressione di tre geni di housekeeping è stata misurata dal QPCR.Utilizzando tecniche standard, i dati convalidano l'uso di successo dell'RNA pancreatico di topo in una tecnica standard di biologia molecolare. Una volta adeguatamente formati, gli studenti laureati e i postdoc dovrebbero essere in grado di completare questa tecnica in circa 30 minuti. E voglio solo dirvi un po' di come lo stiamo usando.Stiamo studiando modelli murini transgenici di cancro al pancreas e stiamo usando questa tecnica per isolare l'RNA. E poi, quando avremo l'RNA, studieremo l'espressione genica del micro RNA in questi animali.

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Murino pancreatica isolamento Islet

Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.

Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Nei saggi di colonie in vitro per rilevare auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule progenitrici isolate dal pancreas di topo adulti sono messo a punto. In questi saggi, progenitori pancreatici danno origine a colonie di cellule nello spazio 3-dimensionale in terreno semisolido contenente metilcellulosa. I protocolli per la gestione di singole cellule e caratterizzazione delle singole colonie sono descritti.

In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale, seguite dal sequenziamento di RNA di cella singola. Questo metodo consente analisi dello sviluppo del pancreas endocrino lignaggio, eterogeneità e trascrittomica dinamiche di cella.

Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

Qui, descriviamo l'immunoprecipitazioni dei ribosomi e dell'RNA associato da popolazioni selezionate di cellule germinali maschili adulte utilizzando il sistema RiboTag. L'allevamento strategico e un'attenta immunoprecipitazioni si traducono in risultati puliti e riproducibili che informano sul translatoma delle cellule germinali e forniscono informazioni sui meccanismi dei fenotipi mutanti.

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

La purezza e l'integrità dell'RNA isolato è un passo vitale nei saggi dipendenti dall'RNA. Qui, presentiamo un metodo pratico, rapido ed economico per estrarre l'RNA da una piccola quantità di tessuto pancreatico non danneggiato.

Estrazione rapida ed economica dell'RNA del tessuto pancreatico ratto

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule endoteliali di topo dall'intero pancreas.

Isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Impara a isolare RNA ad alta integrità dal pancreas di topo ricco di ribonucleasi. Questo metodo garantisce un numero di integrità RNA superiore a sette per analisi di espressione genica affidabili.

Isolamento dell'RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

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