Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali
August 8th, 2014
Qui si descrive un metodo efficace per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare, identificare e purificare le cellule epiteliali del timo o la tecnologia. Ciò si ottiene prima enzimaticamente, digerendo e disgregando meccanicamente il timo per dissociare la tecnologia in una sospensione a singola cellula. Successivamente, la tecnologia può essere analizzata mediante citometria a flusso o arricchita tramite una strategia di panning.
In definitiva, i sottogruppi epiteliali del timo possono essere purificati mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a molte domande chiave nel campo dello sviluppo delle cellule T, come ad esempio, in che modo le cellule epiteliali timiche promuovono la selezione timica? Quali sono le cause della disfunzione timica negli animali che invecchiano e come possiamo ottenere la ricostituzione delle cellule T in vitro?
I principali vantaggi di questa tecnica sono l'elevato recupero di cellule germinali emmiche variabili, l'arricchimento imparziale delle cellule epiteliali emmiche e l'elevata purezza che può essere raggiunta con la selezione cellulare. Per isolare le cellule stromali del timo, identificare prima il timo, che si trova appena sotto le costole e assomiglia a due sottili lobi bianchi che sovrastano il cuore. Quindi scollegare il tessuto connettivo che circonda il timo e utilizzare una pinza seghettata curva per tirare e rimuovere delicatamente i lobi del timo.
Posizionare i lobi in una piastra a sei pozzetti contenente cinque millilitri di terreno e tagliare il grasso e il tessuto connettivo circostanti. Quindi trasferisci i lobi tagliati in un nuovo pozzetto contenente cinque millilitri di soluzione enzimatica appena preparata e usa le forbici sottili per praticare piccole incisioni nel tessuto. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.
Dopo 20 minuti, pipettare delicatamente il tessuto su e giù più volte con una pipetta da cinque millilitri per dissociare il liquame in una singola sospensione cellulare. Raccogliere la frazione surnatante in una provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di tampone freddo ricco di albumina su ghiaccio per neutralizzare gli enzimi. Quindi aggiungere 2,5 millilitri di soluzione enzimatica al tessuto rimanente.
Incubare la piastra per 15 minuti. Successivamente, agitare delicatamente il tessuto con una siringa da tre millilitri dotata di un ago da 18 geni per rompere eventuali aggregati. Quindi trasferire il file nella provetta di raccolta.
Quindi aggiungere 2,5 millilitri di soluzione enzimatica al tessuto rimanente. Incubare la piastra per 15 minuti. Dopo la terza incubazione, ripetere l'agitazione meccanica con un ago da 20 5G.
Dopo aver incubato il tessuto per gli ultimi cinque-10 minuti, trasferire il surnatante nella provetta di raccolta per la centrifugazione per identificare la tecnologia recuperata mediante citometria a flusso Seguendo le procedure standard di colorazione degli anticorpi, eseguire i campioni su un citometro a flusso multiparametrico e analizzare i dati utilizzando l'appropriato software di analisi fax per arricchire ulteriormente la tecnologia con il metodo di panning. Innanzitutto, incubare le cellule con l'anticorpo appropriato per l'arricchimento. Quindi, aggiungere la sospensione cellulare a una piastra di panning precodificata, quindi far roteare la piastra e incubarla a temperatura ambiente.
Dopo 30 minuti, agitare energicamente la piastra e poi trasferire il surnatante in un tubo conico. Sciacquare la piastra due volte con acqua fresca, media, raccogliendo i lavaggi nella provetta di raccolta. Quindi, dopo aver fatto girare le cellule, risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno fresco e trasferire la sospensione cellulare su una nuova piastra di panning, raccogliendo le cellule dopo averle fatte roteare e incubare, come appena dimostrato, per purificare ulteriormente la tecnologia arricchita nei loro sottoinsiemi di cellule timiche.
Dopo aver etichettato con gli anticorpi appropriati, selezionare la tecnologia attraverso un ugello da 100 micrometri mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza, raccogliendo le cellule in 30% di volume per volume FBS in terreno. In questa strategia di gating rappresentativa per identificare la tecnologia mediante citometria a flusso, si può osservare l'espressione di epca, ma non di CD 45 da parte della tecnologia. Pertanto, la tecnologia può essere gated in base alla loro espressione ep, camm e CD 45 la tecnologia è composta da sottoinsiemi epiteliali timici corticali o CEC e midollari o mtech.
Questi sottogruppi possono essere distinti dall'anticorpo vivo 51, che riconosce la G glutamil amino peptidasi espressa da ctec e dalla lectina UEA, che si lega a mtech sia ctech che Mtech express MHC Class two sulle loro superfici. Sebbene mtech possa essere ulteriormente classificato in popolazioni mtech basse e mtech alte, a seconda del loro livello di espressione MHC due, circa otto volte più tech può essere recuperato utilizzando il protocollo basato sull'enzima liasi appena dimostrato rispetto a un protocollo con collagenasi e spazio discale, con circa nove volte 10 al quinto, in grado di essere recuperato da un solo timo di topo per ridurre il tempo di selezione e aumentare la vitalità del cellule stromali recuperate. Il panning può essere utilizzato, come appena dimostrato, per esaurire i siti dei timociti rispetto a intere cellule di timo preparate.
La percentuale di tecnologia aumenta da meno dello 0,5% a oltre il 15% nella popolazione cellulare post-arricchita. Dopo il panning, le proporzioni dei sottoinsiemi tecnici non vengono alterate, suggerendo che nessuno dei due sottoinsiemi viene perso selettivamente durante il panning. Rispetto al campione di arricchimento preen, il tasso di recupero della tecnologia è di circa l'85%Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come arricchire le cellule germinali teriche da più di panico, nonché di come identificare e purificare i subside epiteliali più temici mediante citometria a flusso.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo del topo (TEC). Il protocollo è progettato per facilitare gli studi sulla funzione del timo, sullo sviluppo delle cellule T e sulla disfunzione del timo.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Funzione del timo
Sfondo
- Le cellule epiteliali del timo svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo delle cellule T.
- Comprendere le TEC può fornire informazioni sui processi di selezione del timo.
- La disfunzione del timo è associata all'invecchiamento e a varie malattie.
- La ricostituzione delle cellule T è vitale per le strategie terapeutiche.
Obiettivo dello studio
- Isolare e purificare le TEC per un'analisi dettagliata.
- Investigare i meccanismi di selezione del timo.
- Esplorare le cause della disfunzione del timo nell'invecchiamento.
Metodi utilizzati
- Digerenza enzimatica e disgregazione meccanica del timo.
- Citometria a flusso per l'analisi delle TEC.
- Strategia di panning per l'arricchimento delle TEC.
- Selezione attivata da fluorescenza delle cellule per la purificazione dei sottogruppi di TEC.
Risultati principali
- Isolamento e purificazione riusciti delle TEC.
- Identificazione di sottogruppi chiave di TEC coinvolti nello sviluppo delle cellule T.
- Approfondimenti sui meccanismi di selezione del timo.
- Possibili implicazioni per le terapie di ricostituzione delle cellule T.
Conclusioni
- Il metodo descritto è efficace per studiare le TEC.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della funzione e della disfunzione del timo.
- La ricerca futura può basarsi su questo protocollo per esplorare lo sviluppo delle cellule T.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolating rare stromal populations like thymic epithelial cells enables mechanistic de-risking of T-cell development hypotheses and supports predictive confidence in immunotherapy target validation. This method provides a disease-relevant system for studying thymic selection and dysfunction, directly informing preclinical model design and translational biomarker discovery. By improving recovery and viability of rare cell subsets, it reduces biological ambiguity in early discovery and enhances portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thymic epithelial cell function in T-cell commitment and selection pathways.
- Operational Value: Provides unbiased enrichment of rare TECs from murine thymus, increasing yield approximately eightfold over collagenase-based methods.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by allowing multiparameter flow cytometry identification of cortical and medullary TEC subsets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified TEC subsets suitable for downstream functional assays like gene expression profiling and Western blot.
- Operational Value: Reduces cell sorting time and minimizes viability loss through thymocyte depletion via panning prior to FACS.
- Operational Value: Enables standardized preparation of single-cell suspensions from thymic stroma for reproducible immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling of thymic dysfunction in aging and immune reconstitution studies.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by providing purified TECs for in vitro T-cell reconstitution.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in thymic selection and T-cell development pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing validated stromal inputs for immunological target assessment and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of thymic epithelial roles in positive and negative T-cell selection through isolatable, analyzable subsets.
- Screening: Delivers assay-ready, purified TEC populations with enhanced recovery and reduced sorting time for compound or modulator screening.
- Analytics: Enables quantitative multiparameter flow cytometry and molecular profiling (PCR, Western blot) for objective comparison of TEC states.
- Translational Research: Connects to preclinical T-cell reconstitution models by providing purified TECs capable of supporting lymphoid development in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for isolating rare thymic stromal cells applicable across immunology and immunotherapy discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T-cell development models by enabling reliable isolation and characterization of rare TEC subsets.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through enzymatic-mechanical dissociation and panning-based enrichment prior to FACS.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target validation in thymus-dependent immunological pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into thymic selection and stromal-immune crosstalk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation, flow cytometry staining, and fluorescence activated cell sorting.
- Dependent on access to cell culture incubators, centrifuges, flow cytometers, and panning plates coated with appropriate substrates.
- Necessitates standardization of enzyme digestion times and mechanical agitation steps to ensure consistent single-cell suspension quality.
- Requires adaptation considerations when applying to different mouse strains, ages, or disease models affecting thymic cellularity and stromal composition.
- Practical limitations include the rarity of TECs necessitating enrichment steps and the need for careful viability maintenance during prolonged sorting.
