Name: 3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: unapplicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Scopri il tracciamento orbitale 3D di lisosomi in cellule viventi con microscopio a due fotoni modificato. Questo metodo ad alta velocità permette di studiare la dinamica dei trasporti vescicolari lungo i microtubuli.

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Questo progetto è stato supportato da sovvenzioni NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 e P50-GM076516

Preparazione del campione 1 <ol><li> Mantenere le cellule CHOK1 in tessuto fiasche di coltura utilizzando DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino e 100 UI / ml di penicillina 50 mg / ml di streptomicina. Incubare le cellule in un 5% di CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C. </li><li> Raccolta e poi plate cellule CHOK1 su un diametro di micro-pozzetto 14 mm e uno spessore superficie di 0,16 mm. Cellule seme per densità ottimale per l&#39;imaging, intorno al 60-70% di confluenza. </li><li> Incubare le cellule per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2. Lavare le cellule tre volte in HBSS (Hank Buffered Saline Solution), e incubare le cellule in una soluzione contenente 50 nM di Lysotracker DND26 verde e 150 Nm di tubulina inseguitore verde. Incubare le cellule per 1 ora a 37 ° C. Passaggio facoltativo: Prima di incubazione, eseguire una macchia supplementare con un colorante colorazione matrice mitocondriale (25 Nm). </li><li> Lavare le cellule tre volte in HBSS per rimuovere il colorante non legato. Aggiungere fresco terreno di coltura DMEM prima imagzione le cellule. </li></ol> 2. Configurazioni Microscopio Il microscopio per il tracciamento di particelle descritto nel protocollo video viene montato sul telaio di un microscopio invertito disponibile in commercio (Figura 4). Tuttavia moduli commerciali per 3D tracciamento di particelle orbitali sono ora disponibili. <ol><li> Utilizzare un coerente Chameleon-Ultra II Ti: Sa a femtosecondi sorgente di luce di eccitazione laser, con una gamma di lunghezze d&#39;onda di uscita regolabile tra 690 nm-1.040 nm. </li><li> Assicurarsi che il raggio laser è allineato nella porta posteriore del microscopio utilizzando specchi IR-rivestito. Il raggio laser viene attenuato mediante una piastra semionda rotante seguito da un polarizzatore lineare calcite. Attenuazione del fascio in modo che la potenza media al campione è compreso tra 0,5 e 2 mW. NOTA: Il raggio laser viene riflesso da una coppia di specchi a comando galvanometro motori che consentono il controllo della posizione e traiettoria del fascio focalizzato nel piano campione. Inconfigurazione tipica del fascio laser collimato uscire degli specchi galvanometro viene espanso (10X), che passa attraverso un espansore del fascio, prima di entrare nel retro dell&#39;obiettivo microscopio dopo la riflessione nel passo corto specchio dicroico. </li><li> Raccogliere la luce di fluorescenza dal campione ponendo un obiettivo numerico ad elevata dell&#39;acqua di apertura (60X, NA 1.2) nel percorso ottico. Scegli un cubo filtro di fluorescenza in funzione delle lunghezze d&#39;onda di emissione desiderati in configurazione sia uno o due canali. Impiegare filtri passa-banda di emissione per selezionare ulteriormente la gamma spettrale della fluorescenza emessa. </li><li> Porre il campione su un palco motorizzato, e regolare la multa movimento dell&#39;obiettivo del microscopio con un piezo-controllore obiettivo. </li><li> Dirigere la luce dal cubo del filtro in tubi fotomoltiplicatori dove il segnale viene discriminati e inviato a una scheda di acquisizione dati I / O digitale. Generato dal computer forme d&#39;onda sono l&#39;uscita analogica della scheda I / O e sono provid: NOTAed agli scanner di controllo elettronica. L&#39;ingresso di conteggio di fotoni dai fotomoltiplicatori e il segnale di uscita per gli scanner sono misurati e controllati tramite la scheda I / O dal Laboratorio per il software Fluorescence Dynamics SimFCS. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Posizionare le cellule sul palco e mettere a fuoco utilizzando l&#39;illuminazione a luce trasmessa. </li><li> Passa alla scansione di immagini raster per identificare le cellule che hanno incorporato il colorante e di visualizzare i microtubuli sottostanti. Identificare l&#39;area iniziale in cui il movimento delle vescicole è presente. </li><li> Una volta che una vescicola isolato è identificato, impostare i seguenti parametri per l&#39;inseguimento orbitale: <ol><li> Selezionare il raggio dell&#39;orbita per definire le dimensioni della scansione circolare secondo la dimensione della particella monitorata. Per un emettitore punto, impostare il raggio dell&#39;orbita pari alla vita della Point Spread Function (PSF) del fascio di eccitazione al massimo la sensibilità e la risposta. </li><li> Impostare il assialedistanza per definire la distanza tra le due orbite che vengono eseguite per localizzare la posizione della particella lungo la direzione assiale. Impostare la distanza assiale a 1,5-3 volte la vita PSF. </li><li> Definire il tempo di sosta in base alla luminosità della particella per impostare il tempo speso su ogni punto dell&#39;orbita, che determinerà anche il tasso-photo sbiancamento. Utilizzare un tempo di sosta tra 10-100 msec. </li><li> Impostare il numero di punti in ciascuna orbita di 64 o 128 per produrre periodi orbita nell&#39;ordine di 4-32 msec e fornire un&#39;elevata risoluzione temporale per la determinazione della posizione della particella. </li></ol></li><li> Modificare il segnale di offset DC inviata agli specchi in modo da centrare il fascio sulla particella attraverso l&#39;interfaccia utente grafica mediante un cursore di selezione nell&#39;immagine raster-digitalizzata. </li><li> Inizia il monitoraggio commutando la modalità microscopio da raster-imaging per la scansione orbitale. </li><li> Attivare la raccolta di feedback e dati. </li></ol> 4. TrajectAnalisi ory <ol><li> Utilizzare il software per visualizzare la fluorescenza raccolte in ogni punto lungo l&#39;orbita e ad ogni tempo sotto forma di un &#39;tappeto intensità&#39;. L&#39;intensità raccolto lungo il tappeto fornisce informazioni sulle interazioni della particella con altri oggetti luminosi. Utilizzare il software per visualizzare sia le informazioni traiettoria (cioè lo spostamento CC nel tempo di x, y scanner e del -piezo z) e l&#39;intensità di fluorescenza raccolti dal tubo fotomoltiplicatore nel tempo sotto forma di serie temporali. </li><li> Utilizzare la rappresentazione delle serie storiche e le informazioni &#39;tappeto&#39; intensità &#39;di scegliere solo una regione di interesse nella traiettoria. </li><li> Utilizzare il software per visualizzare una proiezione 2D della porzione selezionata della traiettoria della particella. Selezionare i controlli appropriati per codice colore traiettoria secondo l&#39;intensità di fluorescenza delle particelle. </li><li> Selezionare l&#39;opzione per visualizzare la particolo traiettoria in 3D, e codice-colore che secondo l&#39;intensità di fluorescenza. Ruotare la traiettoria in 3D utilizzando i comandi per visualizzare le caratteristiche del moto lisosomi lungo il microtubulo. </li></ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
<li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li>
<li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li>
<li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li>
<li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nonostante gli enormi progressi delle tecniche di microscopia a fluorescenza e strumentazioni nel corso degli ultimi anni, raggiungendo traiettorie delle particelle fluorescenti in tre dimensioni con una elevata risoluzione temporale è rimasta una sfida nel campo. Se alta risoluzione temporale è stato raggiunto particelle di inseguimento in due dimensioni, estensione alla direzione assiale comporta tipicamente una drastica riduzione della risposta in frequenza del sistema 10. In q...

Un gran numero di approcci sono stati sviluppati fino ad oggi per monitorare le particelle fluorescenti in tre dimensioni utilizzando un microscopio. La maggior parte approcci si basano sull&#39;impiego di telecamere veloci, ideale per monitorare in due dimensioni, di solito in combinazione con modifiche personalizzate dell&#39;ottica emissione del microscopio per ottenere inseguimento in direzione assiale. Microscopi a scansione laser confocale (uno o due fotoni) convenzionalmente in grado di monitorare una particella fluorescente eseguendo una sequenza temporale di z-stack, anche se questo processo è in genere richiede tempo, e produce la risoluzione di tempo ragionevole (10 Hz) solo se la particella monitorata è conservato nel centro di una piccola regione di imaging raster da un meccanismo di feedback attivo 2. L&#39;idea di bloccaggio-in per la particella è alla base del metodo di monitoraggio orbitale. Invece di un raster scan un&#39;orbita circolare viene eseguita intorno alla particella fluorescente. L&#39;intensità della fluorescenza lungol&#39;orbita localizza con precisione la posizione delle particelle 4. La posizione localizzato della particella può quindi essere utilizzato per azionare gli scanner microscopio e ri-centro orbita sulla posizione delle particelle. Gli scanner galvanometro del microscopio sono guidate da una tensione analogica. La componente alternata della tensione permette di eseguire un&#39;orbita con il fascio laser focalizzato, cioè un sinusoidale e un&#39;onda coseno applicata agli specchi X e Y scansione consentirà di eseguire un&#39;orbita circolare. Il DC offset del segnale facilita la modifica della posizione del centro orbita. Dopo un periodo di orbita è determinata e la forma d&#39;onda per il segnale AC è configurato, il sistema di retroazione deve aggiornare solo la componente continua del segnale. Un software in grado di leggere il segnale fluorescente raccolti dai rivelatori è necessario per controllare gli scanner e rivelatori, per calcolare la posizione della particella e aggiornare il DC offset. Per una valutazione di successo di imaging un&#39;accurata scelta dei parametri orbitali (dimensioni e della tempistica) è necessario e questi parametri devono essere regolati in base alle caratteristiche delle particelle fluorescenti che è necessario tenere traccia. I fondamenti fisici e matematici della tecnica sono stati descritti in passato 4,5 per entrambe le applicazioni 2D e 3D. In questo protocollo si illustrano brevemente le principali componenti hardware del setup, e più in dettaglio la scelta dei parametri e la preparazione del campione richiesto per un tipico esperimento che ci permette in seguito lo spostamento di un lisosoma con una risoluzione temporale elevata all&#39;interno di una cellula vivente.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Localizzatore di tubulina Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Coherent Chamelon- ultra II TI</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Polarizzatore di calcite</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometro-motore specchio</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Stadio motorizzato</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezoelettrico</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomoltiplicatore</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Scheda di acquisizione dati</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Software di imaging</td><td>LFD</td><td>Global per immagini-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

3d orbital inseguimento in una modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

L&#39;obiettivo di questo protocollo video è quello di discutere come eseguire e analizzare un esperimento tridimensionale fluorescente orbitale particle tracking utilizzando una versione modificata del microscopio a due fotoni 1. A differenza di approcci convenzionali (scansione raster o largo campo basato su una pila di frame), il tracciamento orbitale 3D permette di localizzare e seguire con un spaziale elevata (10 precisione nm) e risoluzione temporale (risposta in frequenza 50 Hz) lo spostamento 3D di una particella fluorescente passare lunghezza-scale di centinaia di micron 2. Il metodo si basa su un algoritmo di feedback che controlla l&#39;hardware di un microscopio a scansione laser a due fotoni per eseguire un&#39;orbita circolare intorno all&#39;oggetto da tracciare: il meccanismo di feedback manterrà dell&#39;oggetto fluorescente al centro da comandare lo spostamento dei il raggio di scansione 3-5. Per dimostrare i vantaggi di questa tecnica, abbiamo seguito un organello in rapido movimento, il lisosoma, dentro alcellule iving 6,7. Le cellule sono state piastrate secondo protocolli standard, e colorate con un colorante commercialmente lisosoma. Discutiamo brevemente la configurazione hardware e più in dettaglio il software di controllo, effettuare un esperimento di tracciamento orbitale 3D all&#39;interno delle cellule viventi. Si parlerà in dettaglio i parametri richiesti per controllare il microscopio a scansione e consentire il movimento del fascio in un&#39;orbita chiusa attorno alla particella. Concludiamo dimostrando come questo metodo può essere efficacemente utilizzato per tracciare il movimento veloce di un lisosoma marcato lungo i microtubuli in 3D all&#39;interno di una cella dal vivo. Lisosomi possono muoversi con velocità nell&#39;intervallo 0,4-0,5 micron / sec, tipicamente visualizzando un moto diretto lungo la rete microtubuli 8.

Secondo questo protocollo veloce inseguimento singola particella 3D può essere eseguita all'interno di cellule viventi utilizzando un microscopio a due fotoni modificato per monitorare lo spostamento dei lisosomi fluorescente. L'esperimento eseguito consiste di tracciare un lisosoma isolato muoversi all'interno della cella dopo il processo di maturazione endosome 9. I lisosomi sono stati colorati con un colorante verde fluorescente ed eccitato a 930 nm che sfruttano 2-fotone di eccitazione. I nostri dati dimo...

In questo protocollo video tracciamo - ad alta velocità e in tre dimensioni - lisosomi marcati in fluorescenza all'interno di cellule viventi, utilizzando il metodo di tracciamento orbitale in un microscopio a due fotoni modificato.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare come tracciare organelli in rapido movimento come i lisosomi che si muovono in 3D all'interno di una cellula vivente. Ciò si ottiene colorando prima i lisosomi e i microtubuli utilizzando coloranti commerciali specifici all'interno di cellule viventi in coltura. Il secondo passo consiste nell'utilizzare un microscopio a scansione laser e impiegare il metodo di tracciamento orbitale per seguire il movimento del lisosoma ad alta velocità, la dimensione dell'orbita e altri parametri, come la risposta in frequenza del sistema, vengono quindi selezionati per eseguire esperimenti di tracciamento.In definitiva, i risultati mostrano che è possibile seguire lisosomi in rapido movimento in tre dimensioni e rilevare le interazioni con altri organelli colorati in fluorescenza incontrati lungo l'orbita del laser durante il tracciamento. I principali vantaggi del metodo di tracciamento 3D rispetto ad altri metodi esistenti, che si basano, ad esempio, sugli Astigmats, è che il metodo di tracciamento 3D o withal ci consente di tracciare una gamma molto ampia della demenza. Questo metodo può aiutare a porre una domanda chiave nel campo del trasporto vescicolare, come ad esempio come le vescicole si muovono lungo i microtubi.Anche se questo metodo può essere utilizzato per studiare la dinamica endosomiale. Può anche essere impiegato in altri sistemi in cui è possibile marcare in fluorescenza particelle isolate come nanoparticelle, recettori di membrana, complessi di porte nucleari aggregate o loci genetici, cellule ovariche di criceto cinese mantenute o cellule CH K one come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver raccolto le cellule, posizionarle su un diametro di 14 millimetri.Micro pozzetto con uno spessore superficiale di 0,16 millimetri seminare le cellule per una densità ottimale per l'imaging di circa il 60-70% di fluenza di Co incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius 5% di CO2 il giorno successivo, lavare le cellule tre volte nella soluzione salina tamponata di Hank o H-B-S-S-H-B-S-S viene utilizzato per rimuovere le cellule morte o i detriti dalla piastra di coltura e per preparare le cellule per la fase di colorazione. Quindi incubare le cellule in una soluzione HBSS contenente una concentrazione finale di 50 nano molari di lyo tracker e 150 ano molari di tubulina tracker verde per un'ora a 37 gradi Celsius dopo l'incubazione. Lavare le celle tre volte in HBSS per rimuovere eventuali coloranti non legati.Aggiungere un nuovo terreno di crescita DMEM prima di eseguire l'imaging delle cellule. Il microscopio per l'inseguimento delle particelle descritto nel protocollo video è assemblato sul telaio di un microscopio invertito disponibile in commercio. Viene utilizzata una sorgente luminosa di eccitazione laser a femtosecondi in zaffiro a tamaleonte ultra due camaleonte coerente con una gamma di lunghezze d'onda di uscita sintonizzabile compresa tra 690 nanometri e 1040 nanometri.Assicurarsi che il raggio laser sia allineato nella porta posteriore del microscopio. Utilizzando specchi rivestiti a infrarossi, il raggio laser viene attenuato utilizzando una piastra a semionda rotante posta davanti a un polarizzatore di calcite, attenuare il raggio in modo che la potenza media al campione sia compresa tra 0,5 e due milliwatt. Raccogliere la luce di fluorescenza dal campione posizionando un obiettivo ad acqua ad alta apertura numerica nel percorso della luce.Quindi, posizionare il campione su un tavolino motorizzato e regolare il movimento fine dell'obiettivo del microscopio. Utilizzando un controller pizo oggettivo. Scegliere un cubo filtrante a fluorescenza in base alle lunghezze d'onda di emissione desiderate in configurazione a uno o due canali.Utilizzare filtri passa-banda di emissione. Per selezionare ulteriormente la gamma spettrale della fluorescenza emessa, dirigere la luce dal cubo del filtro in tubi fotomoltiplicatori dove il segnale viene amplificato e discriminato e inviato a una scheda di acquisizione dati di ingresso e uscita digitale per l'immagine delle celle, posizionarle sul tavolino e mettere a fuoco utilizzando l'illuminazione a luce trasmessa. Passa all'imaging a scansione raster per identificare le cellule che hanno incorporato il colorante e, per visualizzare i microtubuli sottostanti, identificare l'area iniziale in cui è presente il movimento delle vescicole.Una volta identificata una vescicola isolata, impostare i parametri per il tracciamento orbitale. Innanzitutto, seleziona il raggio dell'orbita per definire la dimensione della scansione circolare in base alla dimensione della particella da tracciare. Per un emettitore puntiforme, impostare il raggio dell'orbita uguale alla vita della funzione di diffusione del punto o PSF del raggio di eccitazione.Per massimizzare la sensibilità e la risposta. Impostare la distanza assiale per definire la distanza tra le due orbite che vengono eseguite per localizzare la posizione delle particelle lungo la direzione assiale. Impostare la distanza assiale su 1,5 o tre volte lo scarto di FPF.Definisci il tempo di permanenza in base alla luminosità della particella, per impostare il tempo trascorso su ciascun punto dell'orbita, che determinerà anche il tasso di sbiancamento delle foto. Utilizzare un tempo di permanenza compreso tra 10 e 100 microsecondi. Impostate il numero di punti in ogni orbita su 64 o 128 per ottenere periodi di orbita nell'ordine di 4-32 millisecondi e fornite un'alta risoluzione temporale per determinare la posizione della particella.Modificare il segnale di offset CC inviato agli specchi per centrare il raggio sulla particella attraverso l'interfaccia utente grafica tramite una selezione del cursore nell'immagine raster scansionata. Inizia l'inseguimento passando dalla modalità del microscopio dall'imaging raster alla scansione orbitale. Attiva il feedback e la raccolta dei dati per l'analisi della traiettoria.Utilizzare il software per visualizzare la fluorescenza raccolta in ogni punto lungo l'orbita e in ogni punto temporale sotto forma di un tappeto di intensità. L'intensità raccolta lungo il tappeto fornisce informazioni sull'interazione della particella con altri oggetti luminosi. Visualizza sia le informazioni sulla traiettoria che l'intensità di fluorescenza raccolta dal tubo fotomoltiplicatore nel tempo sotto forma di serie temporali.Utilizzare la rappresentazione della serie temporale e le informazioni sul tappeto di intensità per selezionare solo una regione di interesse nella traiettoria. Quindi visualizza una proiezione 2D della parte selezionata della traiettoria della particella. Selezionare i controlli appropriati per codificare a colori la traiettoria in base all'intensità della fluorescenza delle particelle.Selezionare l'opzione per visualizzare la traiettoria delle particelle in 3D e codificarla a colori in base all'intensità della fluorescenza. Ruota la traiettoria in 3D utilizzando i controlli per visualizzare le caratteristiche del movimento del lisosoma lungo il microtubulo. Utilizzando una colorazione fluorescente con colorante verde dei lisosomi e dei microtubuli, è possibile visualizzare il movimento ad alta velocità delle vescicole lungo il microtubulo con un microscopio a scansione laser a due fotoni.Tuttavia, l'imaging a scansione raster non ha la risoluzione temporale necessaria per seguire con precisione il movimento degli endosomi più veloci se viene utilizzato il tracciamento orbitale. Invece, i dati mostrano che è possibile ottenere traiettorie di spostamento x, y, Z con una risoluzione temporale di 32 millisecondi. In queste traiettorie di spostamento rispetto al tempo, l'analisi del tappeto mostra l'intensità registrata lungo ciascuna orbita.Nel tempo, la traiettoria di intensità fornisce informazioni sull'ambiente fluorescente della particella. La regione ristretta corrisponde alla porzione della traiettoria tra due salti. I punti luminosi al di fuori della regione scatolata corrispondono alle interazioni della particella con altri oggetti luminosi e sono associati a salti nella traiettoria quando le orbite si ricentrano sulla sorgente fluorescente più luminosa.Durante il tracciamento, è possibile registrare l'intensità integrata della fluorescenza emessa. La traiettoria 3D ricostruita mostra un movimento diretto come ci si può aspettare da una vescicola che si muove sulla rete di microtubuli. Inoltre, è possibile correlare la traiettoria 3D a un'immagine RA o a un'immagine di scansione della regione circostante.Questo conferma il movimento della particella lungo la direzione di un fascio di micro tubuli. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore se eseguita correttamente durante il tentativo. Questa procedura è importante da ricordare per utilizzare un livello di potenza del laser che non sia dannoso per il campione durante l'utilizzo della citazione fotonica Come illustrato in questo protocollo, i livelli di potenza di circa due millivolt dopo gli obiettivi devono essere mantenuti.Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come impostare un esperimento utilizzando il metodo di tracciamento orbitale 3D, che consente di tracciare oggetti di un intervallo Z molto ampio.

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Questo video dimostra come le vescicole neuronali siano marcate con specifiche proteine fluorescenti per visualizzare il loro movimento. In primo luogo, un plasmide codificante per una proteina fluorescente viene incubato con un agente di trasfezione e quindi introdotto in una coltura di neuroni. Successivamente, le immagini dei neuroni vengono acquisite e analizzate per tracciare il movimento delle vescicole.

Visualizzazione delle motilità delle vescicole nei neuroni mediante imaging a fluorescenza

Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi.

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

L'indagine sul traffico di membrana è fondamentale per la comprensione delle funzioni neuronali. Qui introduciamo un metodo per quantificare la motilità della vescicola nei neuroni. Questo è un metodo conveniente che può essere adattato alla quantificazione del traffico di membrana nel sistema nervoso.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

Questo dettagli del protocollo la costruzione e il funzionamento di un microscopio di rilevamento in tempo reale 3D singola particella capace di rilevamento su scala nanometrica fluorescente sonde ad alta velocità diffusiva e tassi di conteggio basso del fotone.

Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella

Qui illustriamo come microscopia di localizzazione foto-attivata di singola molecola può essere effettuata sul terminale del nervo motore di un live Drosophila melanogaster terzo instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

Questo protocollo descrive l'analisi dei compartimenti intracellulari etichettati fluorescentmente in lievito in erba utilizzando la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D). I parametri di imaging vengono scelti per catturare segnali adeguati limitando i fotodanni. I plug-in Custom ImageJ consentono di tenere traccia delle strutture etichettate e di analizzarle quantitativamente.

Microscopia 4D del lievito

La microscopia di localizzazione 3D a molecola singola viene utilizzata per sondare le posizioni spaziali e le traiettorie di movimento delle proteine fluorescenti etichettate nelle cellule batteriche viventi. Il protocollo sperimentale e di analisi dei dati descritto nel presente documento determina i comportamenti diffusivi prevalenti delle proteine citosoliche basate su traiettorie a singola molecola raggruppate.

Microscopia di tracciamento a singola molecola - Uno strumento per determinare gli stati diffusivi delle molecole citosoliche

L'analisi iMSD (Imaging-derived mean square displacement) viene applicata ai macropinosomi per evidenziare la loro natura intrinseca in evoluzione temporale in termini di proprietà strutturali e dinamiche. I macropinosomi vengono quindi confrontati con i granuli secretori di insulina (ISG) come riferimento per strutture subcellulari con proprietà strutturali/dinamiche medie invarianti nel tempo.

Sondare le proprietà strutturali e dinamiche delle nanostrutture subcellulari di traffico mediante spettroscopia di fluttuazione spaziotemporale

Nel primo embrione di Drosophila , molti organelli sono mobili. In linea di principio, possono essere ripresi dal vivo tramite specifiche sonde fluorescenti, ma il guscio d'uovo impedisce l'applicazione diretta all'embrione. Questo protocollo descrive come introdurre tali sonde tramite microiniezione e quindi analizzare il movimento degli organelli di massa tramite velocimetria dell'immagine delle particelle .

Visualizzazione del traffico citoscheletro-dipendente di organelli contenenti lipidi in embrioni di Drosophila

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di come creare campioni per il tracciamento a singola proteina in bistrati lipidici supportati da solidi. Spiega anche un microscopio a fluorescenza semplice con sensibilità a singola molecola e un frame rate elevato. Infine, delineiamo la procedura per estrarre traiettorie a singola proteina.

Tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza

Scopri il tracciamento orbitale 3D di lisosomi in cellule viventi con microscopio a due fotoni modificato. Questo metodo ad alta velocità permette di studiare la dinamica dei trasporti vescicolari lungo i microtubuli.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: unapplicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole (Video) | JoVE Journal

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un'applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

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