3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un'applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare come tracciare organelli in rapido movimento come i lisosomi che si muovono in 3D all'interno di una cellula vivente. Ciò si ottiene colorando prima i lisosomi e i microtubuli utilizzando coloranti commerciali specifici all'interno di cellule viventi in coltura. Il secondo passo consiste nell'utilizzare un microscopio a scansione laser e impiegare il metodo di tracciamento orbitale per seguire il movimento del lisosoma ad alta velocità, la dimensione dell'orbita e altri parametri, come la risposta in frequenza del sistema, vengono quindi selezionati per eseguire esperimenti di tracciamento.

In definitiva, i risultati mostrano che è possibile seguire lisosomi in rapido movimento in tre dimensioni e rilevare le interazioni con altri organelli colorati in fluorescenza incontrati lungo l'orbita del laser durante il tracciamento. I principali vantaggi del metodo di tracciamento 3D rispetto ad altri metodi esistenti, che si basano, ad esempio, sugli Astigmats, è che il metodo di tracciamento 3D o withal ci consente di tracciare una gamma molto ampia della demenza. Questo metodo può aiutare a porre una domanda chiave nel campo del trasporto vescicolare, come ad esempio come le vescicole si muovono lungo i microtubi.

Anche se questo metodo può essere utilizzato per studiare la dinamica endosomiale. Può anche essere impiegato in altri sistemi in cui è possibile marcare in fluorescenza particelle isolate come nanoparticelle, recettori di membrana, complessi di porte nucleari aggregate o loci genetici, cellule ovariche di criceto cinese mantenute o cellule CH K one come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver raccolto le cellule, posizionarle su un diametro di 14 millimetri.

Micro pozzetto con uno spessore superficiale di 0,16 millimetri seminare le cellule per una densità ottimale per l'imaging di circa il 60-70% di fluenza di Co incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius 5% di CO2 il giorno successivo, lavare le cellule tre volte nella soluzione salina tamponata di Hank o H-B-S-S-H-B-S-S viene utilizzato per rimuovere le cellule morte o i detriti dalla piastra di coltura e per preparare le cellule per la fase di colorazione. Quindi incubare le cellule in una soluzione HBSS contenente una concentrazione finale di 50 nano molari di lyo tracker e 150 ano molari di tubulina tracker verde per un'ora a 37 gradi Celsius dopo l'incubazione. Lavare le celle tre volte in HBSS per rimuovere eventuali coloranti non legati.

Aggiungere un nuovo terreno di crescita DMEM prima di eseguire l'imaging delle cellule. Il microscopio per l'inseguimento delle particelle descritto nel protocollo video è assemblato sul telaio di un microscopio invertito disponibile in commercio. Viene utilizzata una sorgente luminosa di eccitazione laser a femtosecondi in zaffiro a tamaleonte ultra due camaleonte coerente con una gamma di lunghezze d'onda di uscita sintonizzabile compresa tra 690 nanometri e 1040 nanometri.

Assicurarsi che il raggio laser sia allineato nella porta posteriore del microscopio. Utilizzando specchi rivestiti a infrarossi, il raggio laser viene attenuato utilizzando una piastra a semionda rotante posta davanti a un polarizzatore di calcite, attenuare il raggio in modo che la potenza media al campione sia compresa tra 0,5 e due milliwatt. Raccogliere la luce di fluorescenza dal campione posizionando un obiettivo ad acqua ad alta apertura numerica nel percorso della luce.

Quindi, posizionare il campione su un tavolino motorizzato e regolare il movimento fine dell'obiettivo del microscopio. Utilizzando un controller pizo oggettivo. Scegliere un cubo filtrante a fluorescenza in base alle lunghezze d'onda di emissione desiderate in configurazione a uno o due canali.

Utilizzare filtri passa-banda di emissione. Per selezionare ulteriormente la gamma spettrale della fluorescenza emessa, dirigere la luce dal cubo del filtro in tubi fotomoltiplicatori dove il segnale viene amplificato e discriminato e inviato a una scheda di acquisizione dati di ingresso e uscita digitale per l'immagine delle celle, posizionarle sul tavolino e mettere a fuoco utilizzando l'illuminazione a luce trasmessa. Passa all'imaging a scansione raster per identificare le cellule che hanno incorporato il colorante e, per visualizzare i microtubuli sottostanti, identificare l'area iniziale in cui è presente il movimento delle vescicole.

Una volta identificata una vescicola isolata, impostare i parametri per il tracciamento orbitale. Innanzitutto, seleziona il raggio dell'orbita per definire la dimensione della scansione circolare in base alla dimensione della particella da tracciare. Per un emettitore puntiforme, impostare il raggio dell'orbita uguale alla vita della funzione di diffusione del punto o PSF del raggio di eccitazione.

Per massimizzare la sensibilità e la risposta. Impostare la distanza assiale per definire la distanza tra le due orbite che vengono eseguite per localizzare la posizione delle particelle lungo la direzione assiale. Impostare la distanza assiale su 1,5 o tre volte lo scarto di FPF.

Definisci il tempo di permanenza in base alla luminosità della particella, per impostare il tempo trascorso su ciascun punto dell'orbita, che determinerà anche il tasso di sbiancamento delle foto. Utilizzare un tempo di permanenza compreso tra 10 e 100 microsecondi. Impostate il numero di punti in ogni orbita su 64 o 128 per ottenere periodi di orbita nell'ordine di 4-32 millisecondi e fornite un'alta risoluzione temporale per determinare la posizione della particella.

Modificare il segnale di offset CC inviato agli specchi per centrare il raggio sulla particella attraverso l'interfaccia utente grafica tramite una selezione del cursore nell'immagine raster scansionata. Inizia l'inseguimento passando dalla modalità del microscopio dall'imaging raster alla scansione orbitale. Attiva il feedback e la raccolta dei dati per l'analisi della traiettoria.

Utilizzare il software per visualizzare la fluorescenza raccolta in ogni punto lungo l'orbita e in ogni punto temporale sotto forma di un tappeto di intensità. L'intensità raccolta lungo il tappeto fornisce informazioni sull'interazione della particella con altri oggetti luminosi. Visualizza sia le informazioni sulla traiettoria che l'intensità di fluorescenza raccolta dal tubo fotomoltiplicatore nel tempo sotto forma di serie temporali.

Utilizzare la rappresentazione della serie temporale e le informazioni sul tappeto di intensità per selezionare solo una regione di interesse nella traiettoria. Quindi visualizza una proiezione 2D della parte selezionata della traiettoria della particella. Selezionare i controlli appropriati per codificare a colori la traiettoria in base all'intensità della fluorescenza delle particelle.

Selezionare l'opzione per visualizzare la traiettoria delle particelle in 3D e codificarla a colori in base all'intensità della fluorescenza. Ruota la traiettoria in 3D utilizzando i controlli per visualizzare le caratteristiche del movimento del lisosoma lungo il microtubulo. Utilizzando una colorazione fluorescente con colorante verde dei lisosomi e dei microtubuli, è possibile visualizzare il movimento ad alta velocità delle vescicole lungo il microtubulo con un microscopio a scansione laser a due fotoni.

Tuttavia, l'imaging a scansione raster non ha la risoluzione temporale necessaria per seguire con precisione il movimento degli endosomi più veloci se viene utilizzato il tracciamento orbitale. Invece, i dati mostrano che è possibile ottenere traiettorie di spostamento x, y, Z con una risoluzione temporale di 32 millisecondi. In queste traiettorie di spostamento rispetto al tempo, l'analisi del tappeto mostra l'intensità registrata lungo ciascuna orbita.

Nel tempo, la traiettoria di intensità fornisce informazioni sull'ambiente fluorescente della particella. La regione ristretta corrisponde alla porzione della traiettoria tra due salti. I punti luminosi al di fuori della regione scatolata corrispondono alle interazioni della particella con altri oggetti luminosi e sono associati a salti nella traiettoria quando le orbite si ricentrano sulla sorgente fluorescente più luminosa.

Durante il tracciamento, è possibile registrare l'intensità integrata della fluorescenza emessa. La traiettoria 3D ricostruita mostra un movimento diretto come ci si può aspettare da una vescicola che si muove sulla rete di microtubuli. Inoltre, è possibile correlare la traiettoria 3D a un'immagine RA o a un'immagine di scansione della regione circostante.

Questo conferma il movimento della particella lungo la direzione di un fascio di micro tubuli. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore se eseguita correttamente durante il tentativo. Questa procedura è importante da ricordare per utilizzare un livello di potenza del laser che non sia dannoso per il campione durante l'utilizzo della citazione fotonica Come illustrato in questo protocollo, i livelli di potenza di circa due millivolt dopo gli obiettivi devono essere mantenuti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come impostare un esperimento utilizzando il metodo di tracciamento orbitale 3D, che consente di tracciare oggetti di un intervallo Z molto ampio.