Name: Produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per lanalisi biochimica Uso dei filtri porosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Scopri come isolare assoni puri da neuroni DRG embrionali utilizzando filtri porosi per analisi biochimiche e immunocitochimiche. Questa tecnica semplice e robusta permette di studiare la fisiologia assonale e i meccanismi della neurodegenerazione.

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Questo progetto è stato supportato da sovvenzioni MOP62827 dal Canadian Institutes of Health Research.

NOTA: Le seguenti procedure sono conformi alle linee guida approvate dal Consiglio canadese dei Animal Care. Tutti gli sforzi sono fatti per minimizzare il dolore e la sofferenza degli animali durante le procedure. 1. Rivestimento di filtri NOTA: Quando inserti del filtro cultura sono poste in pozzetti di piastre multi-pozzetto, due comparti sono definite: vano superiore è la regione sopra l&#39;inserto ed il vano inferiore è quello sotto l&#39;inserto Figura 1A.ab. Espianti vengono seminate nel vano superiore dove essi attribuiscono al lato superiore del filtro; molti assoni crescono attraverso il filtro e si estendono sul lato inferiore del filtro, all&#39;interno del compartimento inferiore Figura 1A.c. I volumi di lavoro standard (ad esempio per l&#39;applicazione di soluzione di rivestimento, lavaggi, terreni di coltura, ecc) sono 2 ml per il comparto inferiore e 1 ml per il comparto superiore e stanno ad essere indicato nel protocollo come &quot;; Volumi standard &quot;. Aggiungere soluzioni a partire con il vano inferiore posizionando la punta della pipetta nel divario tra l&#39;inserto e il lato del bene. Inoltre, l&#39;inserto, inclinarlo su un lato, mentre l&#39;erogazione della soluzione per evitare bolle restino intrappolate sul fondo del filtro. <ol><li> Avviare rivestire i filtri il giorno prima placcatura. Sotto il cofano coltura tissutale sterili, collocare 24 cartucce filtranti mm in una piastra da 6 pozzetti ricezione. Incubare inserti con poli-D-lisina in acqua (1 mg / ml) per 1 ora a temperatura ambiente, usando volumi standard: 2 ml nel comparto inferiore e 1 ml in cima. </li><li> Aspirare poli-D-lisina e lavare una volta con acqua. Aspirare acqua, chiudere il coperchio e lasciare le piastre ad asciugare al cofano O / N. Durante l&#39;aspirazione di liquidi, assicurarsi di rimuovere un residuo di liquido che diventa intrappolato direttamente sotto il filtro. </li><li> La mattina successiva, diluire laminina in acqua (10 mg / ml), mescolare e calda a 37 ° C. Incubare inserti con laminina 1 ora in cell incubatore a 37 ° C, utilizzando volumi standard. </li><li> Aspirare laminina e collagene aggiungere in acqua (0,1 mg / ml) e incubare per 1 ora a RT. In questo caso utilizzare 2 ml per il comparto inferiore e 2 ml per vano superiore. </li><li> Aspirare collagene e lavare una volta con acqua sterile. I filtri sono ora pronti a ricevere terreni di coltura e espianti DRG, come descritto nel passaggio 3. </li></ol> 2. Dissezione embrionali radice dorsale Ganglion (DRG) espianti <ol><li> Anestetizzare un 13-giorno incinta topo femmina da una iniezione IP di Avertin (250 mg / kg). Attendere 10-15 minuti e verificare per mancanza di riflessi di prelievo della cornea e pedali. Una volta che i riflessi sono assenti, eseguire dislocazione cervicale. </li><li> Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici e addome femminile con il 70% di etanolo. Lasciare strumenti per asciugare. Tenere la pelle dell&#39;addome e tagliare gli strati cutanei e muscolari per esporre la cavità addominale. </li><li> Rimuovere l&#39;utero staccando dal collo dell&#39;utero e delle ovaie. In un steriLe cappuccio, rimuovere gli embrioni dall&#39;utero con le forbici e raccoglierli in una capsula di Petri pieno di ghiaccio freddo L15 media. Tenere su ghiaccio. NOTA: Fare riferimento a relazioni tecniche precedenti per ulteriori dettagli su come ottenere embrioni di 13 giorni di gestazione 17,18. </li><li> Sotto il microscopio, porre l&#39;embrione da un lato e l&#39;uso di piccole forbici a molla per rimuovere la testa. Fare un&#39;incisione lungo i fianchi laterali per eliminare il petto, ventre, gli arti e la coda. Tenere la schiena che contiene la colonna vertebrale, laici lato ventrale e rimuovere tutti gli organi viscerali. </li><li> Con piccole forbici a molla, esporre l&#39;intero midollo spinale tagliando la colonna vertebrale dal suo lato ventrale lungo la linea mediana. Tenere la carcassa giù con un paio di pinze (# 3) e utilizzando una seconda coppia di tenere il midollo spinale dal suo aspetto più rostrale. </li><li> Lentamente e delicatamente tirare il cavo lontano dalla cavità vertebrale e un pizzico fuori DRG dal midollo spinale con pinze ultra-sottile (# 5). Gruppo DRG devono essere raccolte suil fondo del piatto. </li><li> Raccogliere DRG raggruppati aspirando con 200 microlitri pipetta punta che è stato tagliato per allargare la sua apertura. Mettere i DRG in un tubo e lasciare sul ghiaccio fino alla raccolta DRG è finito. NOTA: consigli Bianco / trasparente sono preferiti perché DRG non si attaccano alle pareti di questa punta (rispetto alle punte gialle standard). Ha Flushing con i media prima dell&#39;uso ulteriore impedisce DRG di attaccarsi alle sue mura. </li></ol> 3. Semina e manutenzione di radice dorsale Ganglio espianti su Filtri <ol><li> Aggiungere supporti DRG completa a 37 ° C per gli inserti rivestiti con volumi standard. Integrare il supporto comparto inferiore a 15 ng / ml di NGF, pur mantenendo il vano superiore NGF-free. NOTA: Anche se NGF diffonde in modo efficiente attraverso il filtro e la sua concentrazione in equilibrio entro poche ore, abbiamo osservato che l&#39;applicazione di NGF per il vano inferiore direttamente prima della semina aumenta significativamente il rendimento assonale sul bottom superficie del filtro. </li><li> Trasferire i DRG dal tubo ai filtri utilizzando una pipetta di 1.000 pl con una punta tagliata per ingrandire sua apertura. </li><li> Disegnare supporto nella punta 2-3x prima di raccogliere i DRG. Questo impedisce loro di attaccarsi al lato interno della punta. La stessa punta può essere riutilizzato per tutti i pozzetti. L&#39;uso di punte incolore (contro punte blu standard) riduce DRG si attacchi alla superficie punta. </li><li> Per trasferire DRG, impostare la pipetta a 800 ml. Aspirare circa 200 ml di media dal lato superiore del filtro, quindi andare al tubo-DRG e pipetta contenente un piccolo volume su e giù - per risospendere DRG che hanno toccato il fondo. Aspirare l&#39;intero volume e DRG pipette sommergere la punta al centro dell&#39;inserto. </li><li> Una volta che tutti gli inserti sono stati caricati, chiudere il coperchio piatto e agitare la piastra 10x, picchiettando delicatamente sul banco cofano tra ogni ricciolo. Questi movimenti aumentano la resa assonale aiutando espianti DRG lavello eallegare al filtro. Questo aiuta anche a distribuire uniformemente espianti modo che assoni di diversi espianti non si sovrappongano. NOTA: La procedura semina espianto descritto nei passaggi precedenti aumenta significativamente il tasso globale di attaccamento espianto al substrato (fino al 75%). Più significativamente, la procedura di pipettaggio impedisce prontamente espianti dal galleggiante sulla superficie del supporto invece di affondare al fondo dell&#39;inserto. </li><li> Per le analisi biochimiche, DRG seme da un embrione (circa 30) per filtro. Per le analisi morfologiche, utilizzare la metà o un terzo dei DRG da un embrione (10-15). Tale decisione deve essere presa prima di raccogliere i DRG in tubi, in modo che tutti i DRG di un tubo vengono seminate in un singolo bene (se si tratta di 30, 15, o 10 DRG). </li><li> Mantenere culture in un incubatore cella a 37 ° C, a cambiare i media ogni 2-3 giorni. Per cambiare supporto, aspirare il vano superiore per primo, seguito dal comparto inferiore. Aggiungi mezzi freschi in volume standards partendo con il vano inferiore. NOTA: per evitare cellule / assoni di asciugatura, non cambiare supporto in più di 3 inserti allo stesso tempo. DRG coltivate su filtri in presenza di NGF estenderà assoni lunghi, raggiungendo fino a 2 mm dopo 2 giorni di coltura. </li></ol> 4. Trofico Factor sospensione del trattamento NGF ritiro induce degenerazione assonale con la frammentazione assonale (determinata dal contrasto di fase e β-III-tubulina IF) che appare prima di circa 12 ore dopo la sospensione. Frammentazione completo si ottiene con 36 hr. Per quanto tempo la degenerazione viene lasciata procedere per deve essere scelta dall&#39;utente finale secondo il disegno sperimentale. <ol><li> Dopo la assonale fase di estensione di 2 giorni, cambiano i media dai compartimenti superiori e inferiori a media che manca di NGF e contiene anticorpi anti-NGF (1 mg / ml) di sequestrare qualsiasi residuo (o produzione endogena) NGF. </li><li> Piastre Return to incubatore cellulare (37 ° C) per consentireNGF degenerazione ritiro indotto a procedere per il tempo desiderato. </li><li> Procedere alla estrazione delle proteine ​​(fase 6) per esame da western blot o esaminare direttamente i filtri da IF (punto 7). </li></ol> 5. Assonale transezione per indurre degenerazione Walleriana Questa procedura lascia gli assoni sul lato inferiore del filtro staccati dalla loro corpo cellulare, ma altrimenti intatto. Successivamente, questi assoni rapidamente avviare walleriana degenerazione. Frammentazione assonale (evidenziato dal contrasto di fase o β-III-tubulina IF) appare per la prima da 3 ore dopo resezione; da 9 ore, gli assoni sono completamente frammentati e si staccano dal filtro. Per quanto tempo la degenerazione viene lasciata procedere per deve essere scelta dall&#39;utente finale secondo il disegno sperimentale. <ol><li> Raschiare il lato superiore del filtro, contenente espianti DRG coltivate, con una cella-raschietto. Assicurare la completa rimozione di materiale superiore spostando raschietto in X, Y e circolareindicazioni. </li><li> Eliminare il supporto dal vano superiore contenente gli espianti galleggianti che sono stati raschiati dal filtro e sostituire con 1 ml di pre-riscaldato, i media DRG completo contenente NGF (10 ng / ml). </li><li> Piastra di ritorno alla cella incubatore (37 ° C) per consentire Wallerian degenerazione procedere per la quantità di tempo scelto dall&#39;utente finale. </li><li> Procedere alla estrazione delle proteine ​​(fase 6) per esame da western blot o esaminare direttamente i filtri da IF (punto 7). </li></ol> 6. Proteine ​​Estrazione di assonale Campioni <ol><li> Riempire tubi di raccolta (1,5 ml) con 75 ml di tampone campione Laemmli. Conservare le provette su ghiaccio mentre la raccolta assoni dall&#39;intera serie di filtri. </li><li> Lavare il filtro con espianti DRG in PBS e raschiare il lato superiore del filtro. Rimuovere l&#39;inserto dalla piastra, pulire la superficie superiore del filtro con un applicatore con punta di cotone e aspirare qualsiasi PBS supplementare dai lati superiore e inferiore. </li><li> Posizionare inserto upsidegiù sulla panca e tagliare il filtro dell&#39;inserto con un bisturi affilato. Tenere il filtro con una pinza, bottom-up. Effettuare un taglio dalla circonferenza al centro del filtro con le forbici. </li><li> Inserire filtro sulla parte superiore del tubo di raccolta, e con una pinza, premere il centro del filtro nel tubo. Nel fare questo, un imbuto dovrebbe formare. Spingere il filtro a imbuto al fondo del tubo in modo che sia immerso nel tampone Laemmli. </li><li> Estrazione di proteine ​​complete facendo bollire le provette per 4 min. Rimuovere il filtro con pinze per posizionarlo capovolto nella parte superiore del tubo e l&#39;esecuzione di una breve rotazione (2.000 xg per 15 sec). Eliminare i filtri secchi. </li><li> Risolvere 10 ml di preparazione proteina assonale in un SDS-PAGE seguita da western blot per rilevare le proteine ​​di interesse. NOTA: Come riferimento, una preparazione assonale da 20 espianti coltivati ​​per 2 giorni e lisati in 100 ml di RIPA Lysis Buffer avrà una concentrazione proteica di 4-6mg / mL. </li></ol> 7. Immunofluorescenza Esame degli assoni su Filtri Le seguenti operazioni delineano le manipolazioni generali da eseguire se la colorazione su inserti filtranti, esemplificate dal rilevamento di β-III-tubulina. Fixative, tempi di incubazione, le concentrazioni e le altre indicazioni devono essere ottimizzati per altre coppie antigene-anticorpo. <ol><li> Utilizzare 6 pozzetti utilizzati in precedenza, accuratamente puliti, per i seguenti lavaggi e incubazione degli inserti. </li><li> Brevemente lavare inserti in PBS. Fissarli in appena preparato 4% paraformaldeide in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente su agitatore. </li><li> Dopo fissazione, raschiare e pulire la superficie superiore dell&#39;inserto per raccogliere gli assoni che crescevano esclusivamente sulla superficie inferiore del filtro. Procedere con incubazione standard per IF. </li><li> Incubare inserti in soluzione di blocco (TBS, 0,05% Tween 20, latte scremato 5%), con volumi standard, per 1 ora a RT agitando delicatamente. </li><li> Trasferimento inserti di anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio (anti-β-III-tubulina, 1/5.000), utilizzando volumi standard. Incubare O / N (~ 18 hr) a 4 ° C con un leggero scuotimento. </li><li> Lavare il primo anticorpo due volte in PBS (2 X 10 min a temperatura ambiente). </li><li> Trasferimento inserti di anticorpi secondari fluorescenti coniugato diluito in tampone di bloccaggio (capra anti-topo, 1:2.000), utilizzando volumi standard. Incubare coperto dalla luce per 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente. </li><li> Lavare 3x anticorpo secondario in PBS (3 x 10 min a temperatura ambiente). </li><li> Dopo IF è completo, prendere inserire out, svuotare PBS dall&#39;ultimo lavaggio e pulire il lato superiore del filtro con un applicatore di cotone punta. Aspirare il liquido dai lati superiore e inferiore. </li><li> Luogo inserire capovolta sulla panchina, e tagliare il filtro dell&#39;inserto con un bisturi affilato. </li><li> Tenere il filtro con una pinza, ribasso, e mettere al microscopio diapositiva. Overlay con un vetrino e mou-compatibile fluorescentesupporti nting. Lasciate asciugare piatto in camera fredda, coperto dalla luce. Esaminare e catturare immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza. NOTA: Se conservato a 4 ° C e al riparo dalla luce, questi preparati possono essere conservati per settimane con una perdita minima di fluorescenza. </li><li> OPTIONAL: In alternativa, se può essere eseguita su filtri che sono stati rimossi dal dell&#39;inserto. Per fare questo, raschiare e pulire il lato superiore dei filtri direttamente dopo la fissazione. <ol><li> Prendere filtri su inserti con un bisturi e filtri Consiglio tagliente assoni-up sul fondo di una piastra sei pozzetti. </li><li> Successivamente, eseguire incubazione per IF come indicato in 7,4-7,8 e 7.11. Il vantaggio di questa alternativa è che risparmia reagenti, poiché, ad esempio, i volumi di incubazione può scendere a 500 microlitri (rispetto ai 3 ml utilizzati a filtri colorati direttamente sugli inserti come mostrato in 7,1-7,11). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Parametri importanti da prendere in considerazione quando si adegua questa tecnica includono la popolazione neuronale che sarà studiato, il substrato, dimensione dei pori del filtro e superficie. Tutti questi parametri avranno un impatto la specificità, la qualità e la quantità della preparazione neurite ottenuto, e deve essere considerato con attenzione da parte dell&#39;utente finale. Negli esempi presentati in questo protocollo, l&#39;uso di neuroni DRG ha il vantaggio di estendere solo assoni, dando così una pura (s...

Il compartimento assonale dei neuroni mostra un buon grado di autonomia funzionale dal compartimento somato-dendritico. In neuroni di proiezione, assoni contengono la maggior parte della proteina 1,2 neuronale. Lo studio della fisiologia e fisiopatologia degli assoni ha avuto un impulso nella comunità neuroscientifica, perché recenti studi hanno dimostrato che inizi la disfunzione assonale sembra essere una caratteristica comune delle malattie neurodegenerative e dei disturbi neuropsichiatrici 3. Sembra probabile che una migliore comprensione dei meccanismi assonale esclusiva in condizioni normali e patologiche farà luce sui primi eventi che guidano erettile. Il presente protocollo descrive come utilizzare inserti di coltura recanti una membrana porosa (filtro) per ottenere grandi quantità di materiale assonale puro che è adatto per biochimica e analisi immunocitochimica. L&#39;uso del filtro inserti a studiare biologia assonale è stato realizzato da Steward ecolleghi 4 e ulteriormente sviluppati da Twiss e colleghi 5 alla sua configurazione attuale. La tecnica è ora in uso corrente da gruppi studiano diversi aspetti della assonale e dendrite biologia, con lievi modifiche in ciascun caso per ospitare per la popolazione di neuroni studiati, i trattamenti eseguiti e del tipo di analisi biochimiche usati 6-9. Il presente protocollo non intende accogliere tutte le alternative per una tale varietà di applicazioni, ma piuttosto di fornire un approccio semplice che è adatto per la maggior parte delle applicazioni. In particolare, il protocollo qui descritto utilizza un triplo strato che massimizza il rendimento assonale per le analisi biochimiche ed è più adatto per studiare i rivestimenti assonale degenerazione-altri descritti nella letteratura prodotta meno assoni che ritraggono e degenerano più rapidamente in caso di privazione di fattori trofici 9. In questa procedura, corpi cellulari neuronali rimangono isolati in cima alle wh filtroassoni ile passano attraverso i pori e crescono lungo la sua superficie di fondo. Assoni puro (esente della glia e contaminanti corpo cellule neuronali) che si sviluppano sulla superficie inferiore del filtro possono essere raccolti per analisi biochimiche o possono essere fissati in situ ed esaminati mediante tecniche immunocitochimiche 9. La procedura si basa sull&#39;utilizzo di neuroni sensoriali embrionali dai gangli della radice dorsale (DRG). DRG embrionali sono ampiamente usati per studiare biologia assonale perché neuriti da queste cellule subiscono quando mantenuto in fattore di crescita nervosa (NGF) crescita veloce e robusto in vitro, e perché rapidamente subiscono degenerazione quando privati ​​di questo fattore. Inoltre, i neuroni DRG mancano dendriti, in modo che tutti i neuriti raccolti da questo metodo sono puramente assoni. Inserti del filtro rappresentano un grande vantaggio rispetto ad altri approcci utilizzati per studiare gli assoni. Studi basandosi sull&#39;uso di microscopia per differenziare i processi che si verificano nel soma cella da quelli di unXON forniscono informazioni biochimiche limitate. Come altro esempio, sistemi di coltura compartimenti (ad esempio, camere Campenot 10 o dispositivi microfluidici 11) sono utili per approcci di imaging e per il trattamento differenziato dei compartimenti cellulari ma forniscono solo piccole quantità di materiale assonale, precludendo l&#39;uso di queste tecniche di analisi biochimiche che richiedono relativamente grandi quantità di campione. Inoltre, il loro uso richiede una formazione significativa così come i dispositivi specializzati, e sono in termini di tempo. Un altro approccio spesso utilizzato per isolare gli assoni da espianti è quello di rimuovere manualmente un centro di espianto (che contiene i corpi cellulari neuronali) prima della raccolta del campione assonale. Anche se questo può produrre grandi quantità di preparazioni assone arricchito, assoni di questa preparazione possono essere avvolti glia e rimuovere rapidamente organi 20 di espianto consecutivamente da 6 pozzetti (come esempio di un esperimento minima) richiede tempo e al limite della fattibilità. Al contrario, il metodo presentato qui produce abbondanti e pure preparati assonale che possono poi essere analizzati da virtualmente qualsiasi tecnica biochimica che viene comunemente utilizzato per analizzare lisati di cellule intere, come western blot, immunoprecipitazione 6, northern blot 5 spettrometria di massa 6, purificazione dell&#39;RNA 7,12,13, tra gli altri. Inoltre, il protocollo può essere applicato a tecniche di immunofluorescenza (IF), in quanto è possibile fissare assoni in crescita nella parte inferiore del filtro di esaminarli ulteriormente IF. Questo approccio facilita notevolmente l&#39;analisi dei processi specifici assonale poiché non esistono corpi cellulari nella preparazione finale. Questo è un vantaggio significativo in quanto un segnale alto immunofluorescenza da corpi cellulari spesso pregiudica esame e l&#39;analisi di un segnale più debole proveniente da strutture sottili come assoni. Due applicazioni del metodo di coltura per studiare assonale degenerazione are descritto; un modello di potatura di sviluppo e un modello di degenerazione lesioni indotte (comunemente indicato come la degenerazione walleriana). La modellazione di potatura sviluppo si basa sul fatto che i neuroni sensoriali in vivo competono per limitare quantità di NGF-bersaglio derivato e quelli non ricevono abbastanza neurotrofico supporto degenerato 14. Questo fenomeno può essere imitato in colture DRG embrionali ritirando NGF dal terreno di coltura, che, come accade in vivo, avvia degenerazione assonale seguito dalla distruzione corpo cellulare. Per modellare degenerazione Wallerian, il lato superiore del filtro con i corpi cellulari viene raschiata via. Gli assoni che erano cresciute sul lato inferiore del filtro diventare fisicamente separati dai corpi cellulari e successivamente subire il processo degenerativo rapido e stereotipico noto come degenerazione Walleriana 15, dal nome A. Waller che per primo ha segnalato il fenomeno nel 1850 16.

<table><tbody><tr><td>Topo CD-1, gravidanza temporizzata E13</td><td>Charles River</td><td></td><td>Le gravidanze cronometrate in casa possono essere effettuate accoppiando topi e controllando la presenza di tappi vaginali (Giorno E0)</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari</td><td>Falcon Corning</td><td>353102</td><td>1 & micro; m dimensione dei pori, adatto a piastra ricevente a 6 pozzetti</td></tr><tr><td>Piastre accompagnatrici per colture cellulari</td><td>Falcon Corning</td><td>353502</td><td>Piastre riceventi per inserti</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Utilizzato a 1 mg/ml in acqua. Può essere riutilizzato una sola volta.</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Usato a 10 &micro; g/ml in acqua. Prendi 100x stock da -80 &deg; C e disgelo O/N a 4 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di collagene bovino PureCol</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>Può essere sostituito da DMEM</td></tr> Integratore senza siero <tr><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 Integratore senza siero</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deossiuridina (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, subunità beta)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-NGF</td><td>Preparato internamente</td><td></td><td>Come descritto in: Acheson, A. et al. Rilevamento dell'attività simile al fattore neurotrofico derivato dal cervello nei fibroblasti e nelle cellule di Schwann: inibizione da parte di anticorpi contro NGF. Neurone. <forte>7</forte>, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>Opzione</td><td></td>commerciale</tr><tr><td>Anticorpo anti-tubulina</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo anti-topo di capra</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">DRG coltura medium</td></tr><tr><td colspan="4">Mezzo neurobasale 2% B27 Integratore neurobasale 2 mM L-glutammina 1% Penicillina-streptomisina 10 e micro; M FDU 15 ng/ml NGF (solo scomparto inferiore)</td></tr><tr><td colspan="4">1x tampone campione Laemmli</td></tr><tr><td colspan="4">2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glicerolo 0.01% (p/v) Blu di bromofenolo</td></tr></tbody></table>

produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per l&#39;analisi biochimica uso dei filtri porosi

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Gli assoni neuronali utilizzano meccanismi specifici per mediare l'estensione, mantenere l'integrità e indurre la degenerazione. È necessario un adeguato equilibrio di questi eventi per modellare i circuiti neuronali funzionali. Il protocollo qui descritto spiega come utilizzare inserti per colture cellulari dotati di membrana porosa (filtro) per ottenere grandi quantità di preparati assonali puri adatti all'esame con tecniche biochimiche o immunocitochimiche convenzionali. La funzionalità di questi inserti filtranti sarà dimostrata con modelli di potatura evolutiva e degenerazione walleriana, utilizzando espianti di ganglio embrionale della radice dorsale. L'integrità e la funzione assonale sono compromesse in un'ampia varietà di patologie neurodegenerative. Infatti, è ora chiaro che la disfunzione assonale appare molto prima nel corso della malattia rispetto alla perdita di soma neuronale in diverse malattie neurodegenerative, indicando che i processi assono-specifici sono principalmente mirati in questi disturbi. Ottenendo campioni assonali puri per l'analisi con tecniche molecolari e biochimiche, questa tecnica ha il potenziale per gettare nuova luce sui meccanismi che regolano la fisiologia e la fisiopatologia degli assoni. Questo, a sua volta, avrà un impatto sulla nostra comprensione dei processi che guidano le malattie degenerative del sistema nervoso.

Espianti gangli spinali dei topi E13.5 crescono ampiamente su filtri in sequenza rivestito con poli-D-lisina, laminina e collagene (Figura 1B, a sinistra), arrivando fino a due millimetri entro 2 giorni di coltura. Questa combinazione produce substrato di crescita particolarmente esuberante; altre combinazioni producono assoni che sono notevolmente più brevi (Figura 1B, a destra). Inoltre, DRG mantenuti sui filtri estendere assoni più e più a lungo rispetto DRG coltivate su plastica <st...

Questo articolo descrive un sistema di coltura neuronale che può essere utilizzato per ottenere grandi quantità di campioni assonali puri per analisi biochimiche e immunocitochimiche. Questa tecnica consentirà una migliore comprensione della normale fisiologia assonale e delle vie di segnalazione che portano alla neurodegenerazione.

Produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per l&#39;analisi biochimica Uso dei filtri porosi

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

L'obiettivo di questa procedura è ottenere preparati assonali puri adatti per l'esame con tecniche convenzionali, biochimiche o immunocitochimiche. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule gangliari della radice dorsale embrionale su inserti di coltura che portano un filtro a membrana porosa mentre i neuroni DRG estendono gli assoni. Alcuni degli assoni crescono attraverso i pori del filtro e si estendono sulla sua superficie inferiore, mentre i corpi cellulari rimangono isolati sulla superficie superiore Dopo le manipolazioni sperimentali desiderate, la preparazione assonale si ottiene rimuovendo fisicamente le cellule sul lato superiore dei filtri, mantenendo gli assoni che sono cresciuti sul lato inferiore.In definitiva, gli assoni isolati possono essere posizionati per analisi biochimiche o fissati per l'esame immunochimico producendo campioni assonali puri adatti per l'analisi con tecniche biochimiche convenzionali. Questa procedura si è dimostrata molto utile per studiare la fisiologia e la fisiopatologia degli assoni. Come vedrai, la tecnica è relativamente semplice da implementare e può essere adattata a particolari contesti sperimentali.Dimostreremo il suo utilizzo nello studio dei meccanismi di degenerazione assonale Il giorno prima della placcatura. Iniziare rivestendo i filtri sotto una cappa di coltura tissutale sterile. Primo posto, inserti filtranti da 24 millimetri in una piastra ricevente a sei pozzetti.Quindi aggiungere due millilitri di un milligrammo per millilitro, polide luccina in acqua nello scomparto inferiore e un millilitro in alto, e incubare gli inserti per un'ora a temperatura ambiente. Il suo prossimo aspirare il poli de lice assicurandosi di rimuovere il residuo di liquido che rimane intrappolato direttamente sotto il filtro. Quindi sciacquare una volta con acqua dopo aver aspirato l'acqua, chiudere il coperchio e lasciare asciugare le piastre nella cappa per una notte.La mattina successiva, mescola e riscalda una soluzione di laminato e acqua a 37 gradi Celsius. Incubare gli inserti nella soluzione di laminina per un'ora in un incubatore cellulare a 37 gradi Celsius utilizzando volumi standard. Dopo l'aspirazione.La laminina aggiunge 0,1 milligrammi per millilitro, collagene in acqua e incubare per un'ora a temperatura ambiente, quindi aspirare il collagene e lavare una volta con acqua sterile. I filtri sono ora pronti per ricevere i terreni di coltura e l'explan DRG dopo, dopo aver sezionato e decapitato un embrione di topo E 13 come descritto nel protocollo di testo. Posizionare l'embrione su un fianco in una capsula di Petri riempita con terreni L 15 mentre si osserva attraverso un microscopio da dissezione, praticare un'incisione lungo i lati per scartare il torace, il ventre, gli arti e la coda.Posiziona la parte posteriore contenente la colonna vertebrale con il lato ventrale rivolto verso l'alto e rimuovi tutti gli organi viscerali usando piccole forbici a molla. Esporre l'intero midollo spinale tagliando la colonna vertebrale dal suo lato ventrale lungo la linea mediana. Tieni ferma la carcassa con un paio di pinze numero tre e usa un secondo paio per tenere il midollo spinale dal suo aspetto più rostrale.Ora, tira lentamente e delicatamente il cavo lontano dalla cavità vertebrale. Poiché i DRG sono esposti, utilizzare una pinza ultrasottile numero cinque per pizzicarli dal midollo spinale. Posizionare i DRG staccati sul fondo del piatto utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri che è stato tagliato per ingrandire.La sua apertura. Aspirare i DRG raccolti e metterli in una provetta sul ghiaccio. Integrare il supporto dello scomparto inferiore con 15 nanogrammi per millilitro di NGF mantenendo libero l'NGF dello scomparto superiore.Quindi, aggiungere un supporto DRG completo a 37 gradi Celsius agli inserti rivestiti utilizzando volumi standard. Quindi utilizzare una pipetta da 1000 microlitri con un tappo per allargarne l'apertura. Impostare la pipetta a 800 microlitri.Quindi trasferire circa 200 microlitri di terreno dal lato superiore del filtro alla pipetta DRG contenente tubo di un piccolo volume su e giù per sospendere nuovamente i D RRG che sono affondati sul fondo. Una volta aspirato l'intero volume, trasferire i DRG nel filtro immergendo la punta della pipetta al centro dell'inserto ed espellendo i DRG. Mantenere le colture in un incubatore cellulare a 37 gradi Celsius.Cambiare il supporto ogni due o tre giorni per cambiare il supporto. Aspirare prima lo scomparto superiore, seguito dallo scomparto inferiore. Aggiungere nuovi terreni in volumi standard a partire dallo scomparto inferiore per studiare l'effetto della ritirata del fattore trofico sugli assoni.Attendere due giorni per consentire l'estensione assonale. Quindi, rimuovere il supporto dagli scomparti superiore e inferiore. Quindi, per sequestrare eventuali residui o prodotti endogenamente e GF, aggiungere terreni privi di NGF e contenenti anticorpi anti NGF.Rimettere le piastre nell'incubatore cellulare a 37 gradi Celsius per consentire alla degenerazione indotta dal ritiro dell'NGF di procedere per il tempo desiderato per studiare durante la degenerazione ariana. Utilizzare filtri contenenti DRG explan mantenuto in NGF per due giorni. Utilizzare un raschietto per celle per raschiare i DRG dal lato superiore del filtro.Garantire la completa rimozione dei corpi cellulari neuronali muovendo il raschietto avanti e indietro nelle direzioni x e y e in cerchio. Confermare il successo della raschiatura controllando che non rimangano piante X attaccate al filtro. Quindi, scartare il terreno contenente gli espianti galleggianti dallo scomparto superiore e aggiungere un millilitro di terreno DRG completo di preriscaldamento contenente 10 nanogrammi per millilitro e gf.Quindi rimettere la piastra nell'incubatore cellulare a 37 gradi Celsius per consentire alla degenerazione walleriana di procedere per il tempo desiderato per estrarre le proteine dai campioni assonali. Iniziare riempiendo provette di raccolta da 1,5 millilitri con 75 microlitri di tampone per campioni di foglie di agnello e posizionare le provette sul ghiaccio. Lavare il filtro contenente l'explan DRG in PBS e raschiare il lato superiore del filtro come prima.Dopo aver rimosso l'inserto dalla piastra, utilizzare un applicatore con punta di cotone per pulire il lato superiore del filtro. Quindi aspirare il PBS in eccesso dai lati superiore e inferiore. Quindi, posiziona l'inserto capovolto su un banco e usa un bisturi affilato per tagliare il filtro dall'inserto.Quindi tenendo il filtro con una pinza. Dal basso verso l'alto. Usa le forbici per fare un taglio dalla circonferenza al centro del filtro.Ora posiziona il filtro sopra il tubo di raccolta e con una pinza, premi il centro del filtro lungo il tubo. Mentre si fa questo, si formerà un imbuto che spingerà il filtro a forma di imbuto sul fondo del tubo in modo che sia immerso nel tampone del campione di Laly. Ora completate l'estrazione delle proteine coprendo i tubi e mettendoli in acqua bollente per quattro minuti.Rimuovere il filtro con una pinza e posizionarlo a testa in giù nella parte superiore della provetta e centrifugarlo brevemente. Al termine, scartare i filtri essiccati per l'immunofluorescenza. Lavare gli inserti in PBS in piastre a sei pozzetti.Quindi fissare gli inserti in aldeide paraforme al 4% appena preparata in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente su uno shaker dopo il fissaggio, raschiare e pulire il lato superiore degli inserti per assicurarsi che solo gli assoni che sono cresciuti esclusivamente sulla superficie inferiore del filtro siano macchiati. Quindi eseguire l'immunofluorescenza standard come descritto nel protocollo di testo. Una volta completate tutte le incubazioni in immunofluorescenza.Versare il PBS dell'ultimo lavaggio. Pulire il lato superiore del filtro con un applicatore di cotone e aspirare il liquido rimanente dai lati superiore e inferiore. Posizionare l'inserto capovolto sul banco e utilizzare un bisturi affilato per tagliare il filtro dall'inserto.Quindi tenendo il filtro con la pinza capovolta. Posizionalo su un vetrino da microscopio. Utilizzare supporti di montaggio fluorescenti compatibili per posizionare un vetrino coprioggetto sul filtro e lasciare che il filtro si asciughi al buio a quattro gradi Celsius.Terminato esaminando e catturando le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza. Il rivestimento sequenziale dei filtri con polilisina, laminina e collagene si traduce in piante che crescono più assoni e più a lungo rispetto a quelle coltivate con polilisina da sola o polilisina e collagene sotto lo stesso substrato. Condizioni di rivestimento.I filtri DRG Explan mantenuti mostrano una crescita assonale considerevolmente più esuberante rispetto alle piante X coltivate su plastica. La preparazione assonale ottenuta dopo aver raschiato il lato superiore del filtro è priva di nuclei cellulari, dimostrando che i corpi cellulari sono esclusi dal lato inferiore del filtro mostrato. Ecco alcuni esempi di assoni che hanno avuto origine da circa 17 explan, che si estendevano attraverso i pori del filtro per crescere sul lato inferiore di un filtro da 24 millimetri.Le macchie immunologiche di lisati raccolti dalla parte superiore del filtro rispetto alla parte inferiore dimostrano che l'istone H tre un marcatore nucleare è confinato alla parte superiore del filtro. Il contenuto proteico totale è stato normalizzato tra i diversi campioni. Gli esperimenti di deprivazione di NGF sono dimostrati in queste immagini a diversi ingrandimenti di preparati assonali rispetto all'explan mantenuto in NGF o privato di NGF per 12 o 36 ore.Gli studi sulla degenerazione assonale ariana di parete sono mostrati in queste immagini di preparati assonali da espianti intatti o da tre a 7,5 ore dopo la transezione, come in altri modelli di degenerazione walleriana. Cinque millimolari NAD plus protegge dalla degenerazione indotta dalla trassezione Una volta padroneggiato. Questa tecnica è robusta e facile da riprodurre.Consente la generazione di grandi quantità di preparati assonali affidabili Da quando è stato descritto per la prima volta da Twist e colleghi nel 2001. Variazioni di questa tecnica sono state utilizzate per esplorare molti aspetti della fisiologia degli assoni e dei dendriti. Fare riferimento alle citazioni nel protocollo testuale per scoprire altre applicazioni di questa tecnica.

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