Name: Culturing Caenorhabditis elegans In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Impara a coltivare C. elegans in mezzo liquido assenico CeHR per studi nutrizionali senza interferenze batteriche. Questo metodo consente di sincronizzare le popolazioni e analizzare con precisione le esigenze metaboliche del verme.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of HealthGrants DK85035 e DK074797 (IH).

1. Ceppi Worm <ol><li> Ottenere C. elegans tipo selvatico ceppi Bristol N2 dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) e li mantengono su piastre NGM seminato con E. coli ceppo OP50 7. Nota: verme transgenico ceppi IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizzati sono stati generati come descritto in precedenza 11. IQ6011 può essere richiesto all&#39;autore corrispondente. </li></ol> 2. Preparazione di Modified C. elegans Habitation e riproduzione Medium (mCeHR) Preparare mCeHR mezzi liquidi come descritto di seguito 12. Questo supporto liquido axenic permette ai vermi di crescere senza fonti di cibo supplementari. Eseguire tutte le manipolazioni di mezzi liquidi axeniche e worm axeniche utilizzando condizioni rigorosamente sterile come una cappa a flusso laminare. <ol><li> Ottenere il latte pastorizzato ultra senza grassi da un negozio di alimentari. Utilizzare il pro refrigeratodotto e non il prodotto temperatura ambiente. Prima di utilizzare in mCeHR mezzo, striscia il latte sul Brain Heart Infusion (BHI) piastre di agar ed incubare per 3 giorni a 30 ° C e 37 ° C per verificare la sterilità. Trasferire il latte a 50 ml provette sterili e conservare a -80 ° C </li><li> Preparare ciascuno dei seguenti componenti e combinare nell&#39;ordine e importi indicati per preparare 1 L di mCeHR (Tabella 1A): 10 ml di 2 mM colina diacido citrato, 10 ml di vitamina e fattore di crescita mix (vedi ricetta in Tabella 1B), 10 ml di 2,4 mM myo-inositolo, 10 ml di 2 mM cloruro emina, 250 ml di acqua deionizzata. Applicare l&#39;aspirazione e il filtro attraverso un gruppo filtro 0,22 micron. </li><li> Aggiungere 20 ml di miscela di acido nucleico (ricetta nella Tabella 1C), 100 ml di miscela di minerali (ricetta nella Tabella 1D), 20 ml di 170 mg / ml lattoalbumina idrolizzato, 20 ml di aminoacidi essenziali, 10 ml di aminoacidi non essenziali acidi, 20 ml di 450 mM KH 2 PO 4,50 ml di 1,45 M D-glucosio, 10 ml di 1 M HEPES, sale di sodio, 250 ml di acqua deionizzata. </li><li> Applicare aspirazione per filtrare sterilizzare i componenti. Rimuovere il filtro e aggiungere 1 ml di 5 mg / ml di colesterolo. Assicurarsi che il pH della media è di circa 6-6,5. Nota: questa soluzione può essere conservata a -80 ° C fino ad un anno. </li><li> Aggiungere 20% (v / v) ultra pastorizzato latte scremato organico al mezzo mCeHR prima dell&#39;uso. Usare una tecnica scrupolosamente sterile (ad esempio in una cappa a flusso laminare) all&#39;apertura e si dispensa il latte. Conservare il supporto a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparare C. elegans per la Cultura in axeniche mCeHR Liquid Media <ol><li> Crescere vermi dieci 60 millimetri piastre NGM finché ci sono molti vermi gravide e una quantità minima di OP50 E. coli sulle piastre. </li><li> Rimuovere le viti senza fine da ciascuna piastra da risciacquo con 5 ml di tampone M9 (ricetta in Tabella 1F), e combinare in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Lasciare i vermi a settle lasciando il tubo riposare per 5 a 10 minuti poi rimuovere con attenzione il surnatante contenente la E. coli. </li><li> Ripetere i punti 3.2 e 3.3 2x per rimuovere la maggior quantità di batteri residui più possibile prima di continuare la procedura. </li><li> Risospendere i vermi in 0,1 N di NaCl in un volume che è un multiplo di tre, per esempio 1,5 ml, 3 ml o 6 ml in cui i singoli vermi può essere visto nel tubo. </li><li> Candeggiare i vermi aggiungendo NaOH 5 N e 5% soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina) in un rapporto di 01:02:06 alla sospensione verme. Per esempio, 1 ml di NaOH 5 N: 2 ml 5% di ipoclorito di sodio: 6 ml della sospensione verme. Mescolare il NaOH e candeggina prima di aggiungere alla sospensione verme. </li><li> Vortex la soluzione energicamente fino vermi gravide vengono sciolti e solo uova sono visibili all&#39;interno della sospensione (circa 5 a 10 min). Monitorare il processo utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10X. </li><li> Dopo che i vermi hanno completamente sciolto, pellet immediatamente l&#39;uova a 800 xg per 45 secondi a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet due volte con 10 ml di acqua sterile per centrifugazione il pellet a 800 xg per 45 sec a 4 ° C. </li><li> Dopo lo sbiancamento, trasferire il pellet uovo ad un tessuto beuta da 25 cm 2 di coltura contenente 10 ml di media mCeHR integrato con 100 pg / ml di tetraciclina. Effettuare questa procedura utilizzando tecniche sterili. Se lo si desidera, aggiungere ulteriori antibiotici, di cui 250 mg / ml di acido nalidixico, per prevenire la crescita batterica nelle colture liquide axeniche. </li><li> Incubare le colture liquide a 20 ° C in un incubatore agitazione a circa 70 rpm. </li><li> Controllare i vermi ogni giorno per notare la fase di sviluppo e il tasso di crescita. Nota: Worms inizialmente crescere lentamente e richiedono 7 a 10 giorni per diventare gravida. Tuttavia, come i vermi acclimatarsi al mezzo liquido il tempo di generazione diminuisce di circa 4 giorni per tipo selvatico (N2) vermi. </li><li> Dopo i vermi hanno svipato alla fase gravido in mezzi liquidi, trasferire la cultura verme in una provetta conica e agglomerare le vermi a 800 xg per 5 minuti a 4 ° C utilizzando un rotore oscillante. </li><li> Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere il pellet verme in un volume uguale di 0,1 M NaCl. Ad esempio, utilizzare 10 ml di 0,1 M NaCl per i vermi coltivate in 10 ml di mCeHR. Lasciare i vermi di stabilirsi per 5 minuti in ghiaccio. </li><li> Effettuare la procedura di sbiancamento come sopra descritto nei passaggi 3,5-3,8, e permettere ai vermi di crescere per una seconda generazione nei mezzi liquidi axeniche. Se necessario, aggiungere di nuovo l&#39;antibiotico per inibire la crescita batterica. </li><li> Anche in questo caso consentono ai vermi di diventare gravida poi pellet e risospendere i vermi in 0.1 M NaCl come descritto nei punti 3.12 e 3.13, poi candeggiare nuovo come descritto nei passaggi 3,5-3,8, per produrre una popolazione sincronizzato. Crescere i vermi larve L1 in mezzi liquidi senza antibiotici da ora in poi. </li></ol> 4. Sincronizzazione Worms da LiquidCultura <ol><li> Pellet e risospendere i vermi a 0,1 M NaCl come sopra descritto nei passaggi 3.12 e 3.13. Bleach come sopra descritto nei passaggi 3,5-3,8. </li><li> Risospendere il pellet uovo in 10 ml di tampone M9 e permettere alle larve di schiudono O / N a 20 ° C su una piattaforma agitatore rotante. Nota: Le uova si schiudono in larve L1, ma non si svilupperanno ulteriormente, sincronizzando i vermi nella fase L1. </li><li> Per mantenere e vermi sottocultura, pellet L1 larve a 800 xg per 5 minuti, poi risospendere le larve in 10 ml di mCeHR e il trasferimento ad un pallone 25 centimetri 2. Lasciare i vermi di crescere a 20 ° C su una piattaforma rotante. Mantenere una densità massima di 3.000 ml / worm / cm 2 per assicurare una nutrizione adeguata per i vermi. Nota: In questa fase, gli antibiotici non sono tenuti a mantenere condizioni axeniche quando le procedure siano effettuate con tecniche sterili in una cappa a flusso laminare. Worms devono essere controllate quotidianamente per monitorare la crescita. </li></ol> 5. Liberozing e scongelamento Worms per colture axeniche medie <ol><li> Congelare le culture verme asincroni axeniche o sincronizzato larve L1 in azoto liquido. Worm pellet a 800 xg per 5 minuti poi risospendere in tampone di S (6,45 KHPO mm 4, 43.55 KHPO mm 4, 146,25 mM NaCl) con 0,5 ml per ogni flacone. Aggiungere un volume uguale di tampone S con il 30% v / v glicerolo ad ogni flacone e trasferire i vermi a -80 ° C prima della conservazione a lungo termine in N 2 liquido. Congelare circa 1 x 10 6 vermi per ml in ogni fiala. </li><li> Scongelare vermi incubando le fiale a 37 ° C per circa 2 min fino a quasi tutto il ghiaccio è fuso. In una cappa a flusso laminare, trasferire i vermi in un pallone sterile contenente mCeHR e metterli a 20 ° C. </li></ol> 6. Determinare l&#39;effetto di Hemin concentrazione sulla crescita e la riproduzione in mCeHR <ol><li> Utilizzare supporti mCeHR axeniche per saggiare la crescita dipende nutrienti di C. elegans. Per determinare l&#39;effetto of emina concentrazione sulla crescita senza fine e lo sviluppo, l&#39;uso sincronizzato vermi N2 axeniche o di altri ceppi di interesse. Sincronizzare L1 larve come descritto sopra nella sezione 4. </li><li> Il giorno successivo, pellet e contare sincronizzato larve L1 e portare ad 1 verme per ogni ml di mezzi axeniche. Effettuare 10 mM cloruro emina in 0,3 M NH 4 OH e regolare a pH 8 mediante HCl concentrato. </li><li> Aggiungere 800 microlitri di media mCeHR ad una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 100 vermi per ciascun pozzetto in 100 microlitri di media. Aggiungere cloruro di emina a ciascun pozzetto in concentrazioni comprese tra 0 mM, 1,5 mM a 1.000 pM in triplice copia. Assicurarsi che tutti i pozzetti contengono la stessa concentrazione di 0,3 M NH 4 OH. Risospeso delicatamente i worm prima il pipettaggio per garantire che il 100 L1 larve sono aggiunti a ciascun pozzetto. </li><li> Esaminare i vermi ogni giorno e notare la crescita di ciascuna concentrazione in ciascun pozzetto. Contare il numero di vermi dopo 9 giorni di incubazione e tracciare il numero di worm / ml corrispondenti a ciascuna emeconcentrazione (Figura 1). </li></ol> 7. Effetto della Hemin concentrazione su eme Worms sensori <ol><li> Incubare sincronizzati L1 vermi sensore eme (Phrg-1 :: GFP) in mCeHR contenente 4 micron, 8 micron, 10 micron e 20 micron emina. </li><li> Immagine worm utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza, 48 ore dopo incubazione (Figura 2). </li></ol> 8. Utilizzando mCeHR per generare transgenici C. elegans Utilizzo di microparticelle Bombardamento Nota: la procedura per la generazione e la realizzazione di microparticelle bombardamento con vermi coltivate in mCeHR unc-119 (ED3) è illustrato nella figura 3 13. <ol><li> Worm Preparazione <ol><li> Trasferire circa 1 x 10 6 asincroni unc-119 (ED3 vermi) in 90 ml di mezzi mCeHR in A 175 cm 2 matraccio una settimana prima del bombardamento. Lasciare i vermi di crescere a 20 ° C ona piattaforma di agitazione a ~ 70 rpm (Figura 3-1). Nota: Una settimana più tardi, la densità verme dovrebbe essere significativamente maggiore con molti adulti vermi gravide. Circa 3 x 10 7 vermi saranno necessari per microparticelle bombardamento. </li><li> Freddo JM109 E. coli testa di serie 10 piatti cm NGM sul ghiaccio. </li><li> Trasferire i vermi axeniche a due tubi da 50 ml coniche e centrifugare i vermi a 800 xg per 2 minuti. Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente le viti senza fine in ciascun tubo in 50 ml di tampone M9 (Figura 3-2). </li><li> Lasciare i vermi adulti a pellet per gravità per 10-15 minuti sul ghiaccio. Nota: Il pellet 2 ml deve contenere ora&gt; 90% vermi adulti. Questo pellet 2 ml dovrebbe avere circa 5 x 10 6 vermi ed è sufficiente per un bombardamento microparticelle. </li><li> Rivestire l&#39;intera superficie del refrigerata JM109 seminato piastra NGM con il pellet 2 ml di vermi. Che il liquido sia completamente assorbito poi lasciare la piastraper 30 min in ghiaccio prima di proseguire (Figura 3-3). </li></ol></li><li> Preparazione di particelle d&#39;oro <ol><li> Pesare 30 mg di particelle d&#39;oro in una provetta siliconato. Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% e agitare la provetta per 5 min. </li><li> Lasciare che il tubo a sedere per 15 minuti, poi centrifugare a 6.000 xg per 10 secondi per far sedimentare le particelle d&#39;oro. Rimuovere il surnatante utilizzando un puntale cautamente la punta verso il lato opposto del tubo di particelle d&#39;oro. </li><li> Lavare le particelle d&#39;oro con 1 ml di acqua sterile, vortex per 1 min e centrifugare brevemente la provetta a 6.000 xg per 10 sec. Ripetere la fase di lavaggio due volte, poi risospendere le particelle d&#39;oro in 0,5 ml di soluzione sterile 50% glicerolo. Nota: La concentrazione finale delle particelle d&#39;oro sarà di 60 mg / ml e può essere conservato per 1-2 mesi a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare la miscela di particelle di DNA-oro <ol><li> Combinare 10 pg di DNA plasmidico desiderato con 10 &amp;# 956; g del unc-119 di salvataggio plasmide in un siliconato 1,5 ml provetta. Aggiungere 50 ml di acqua deionizzata e 100 ml di ben risospeso soluzione di particelle d&#39;oro poi vortex per 1 min. </li><li> Aggiungere 150 ml di 2,5 M CaCl 2 e agitare nuovamente la soluzione per 1 min. A questa soluzione, aggiungere 60 ml di 0,1 M spermidina e vortex per 3-5 min. </li><li> Pulse centrifugare la soluzione a 6.000 xg per 10 secondi, rimuovere il surnatante e aggiungere 300 ml di etanolo al 70%. Vortex bene per 1 min, impulso centrifugare a 6000 xg, rimuovere il supernatante e risospendere in 170 ml di etanolo al 100%. Vigorosamente agitare la soluzione per 5-10 minuti poi pulsano centrifugare e rimuovere il surnatante. </li></ol></li><li> Bombardamento (Figura 3-3) Nota: Questo protocollo è eseguita con il sistema di erogazione di particelle specificato nella tabella dei materiali / Attrezzatura. Seguire le istruzioni per lo strumento consegna particella disponibili. <ol> &lt;li&gt; Inserire un foglio di carta velina in un piatto di 15 centimetri. Usando le pinzette, immergere sette macrocarriers singolarmente in 100% di etanolo e stenderli sul tessuto ad asciugare. </li><li> Pulire accuratamente la camera di biolistic, titolare macrocarrier e piastra bersaglio con etanolo al 70%. Pulire e sterilizzare gli schermi di arresto prima di ogni procedura di bombardamento. </li><li> Caricare i macrocarrriers nel supporto utilizzando pinzette e premere nel supporto utilizzando lo strumento dei posti a sedere. </li><li> Distribuire uniformemente 20 ml del DNA rivestiti particelle d&#39;oro nel centro di ogni macrocarrier e poi lasciare che la soluzione si asciughi completamente. </li><li> Pulire le due parti del divisore pressione con etanolo e assemblare con etanolo puliti dischi di rottura. Avvitare il divisore a pressione montate e dischi di rottura nella camera di bombardamento. </li><li> Montare uno schermo arresto autoclave con il titolare macrocarrier e posizionare l&#39;apparecchio al scaffale di metallo richiesto e bloccare in posizione. </li><li> Inserire il MACR assemblataocarrier apparecchio nella camera biolistic nello slot assegnato sotto del divisore pressione e allinearsi con il divisore pressione. </li><li> Nastro il piatto NGM aperto con i vermi sul ripiano piastra bersaglio e chiudere la porta della camera. </li><li> Per bombardare worm, regolare la pressione a quella necessaria per rompere i dischi di rottura. Accendere il vuoto a 28 pollici di pressione Hg, quindi premere il pulsante di fuoco fino a quando i dischi di rottura. </li><li> Rilasciare il vuoto e rimuovere la piastra NGM dall&#39;apparecchio. Lavare i vermi dalla piastra e ridistribuire in venti 10 piatti cm NGM seminato con JM109 E. coli (Figura 3-4). </li><li> Lasciare i vermi di crescere per 10 a 14 giorni a 25 ° C e morire di fame i piatti. Worms salvati dal difetto unc-119 avranno il movimento normale e possono essere identificate in questo momento. Scegli almeno 10 &quot;di tipo selvatico&quot; vermi da lastre separate per ulteriori analisi in quanto questi rappresentano linee transgeniche indipendenti (Figure 3-5). </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano non ci sono interessi economici in competizione o conflitto di interessi.

In questo protocollo vi presentiamo un axenic mCeHR mezzi liquidi modificato che consente una rapida C. generazione elegans con produzione di un gran numero di vermi. Questo supporto mostra diversi vantaggi come i vermi sono coltivate senza contaminare E. coli o sottoprodotti batterici e possono essere sfruttati in studi nutrizionali e tossicologici. L&#39;uso di E. coli o altri batteri in detti studi ha diversi inconvenienti. Ad esempio, la crescita dei batteri può cambiare in varie ...

Il nematode del suolo, Caenorhabditis elegans, è un potente organismo modello utilizzato in numerosi studi dalla genetica alla tossicologia. Come risultato della sua dimensione 1 mm tempo di generazione rapida di quattro giorni facilità di coltivazione, e un gran numero di progenie, questi nematodi sono stati utilizzati in un numero di schermi genetici e farmacologici 1, 2. Ricercatori approfittare di questo worm per identificare molecole e percorsi conservati nei sistemi di vertebrati. Questi percorsi sono segnali di morte cellulare, percorsi di invecchiamento e del metabolismo, e il sistema nervoso 3-6. Inoltre, la trasparenza di C. elegans consente la generazione di linee transgeniche utilizzando reporter proteine ​​fluorescenti, che possono essere visualizzati direttamente per analizzare i modelli di espressione genica e localizzazione delle proteine. In molti studi questo nematode è coltivato su una superficie a base di agar-solido utilizzando nematode mezzo di crescita (NGM) piastre o in lculture iquid seminati con Escherichia coli come fonte di cibo 7,8. Queste fonti di cibo batteriche possono confondere studi biochimici e tossicologici con interferenza da batteri sottoprodotti che influenzano l&#39;interpretazione dei risultati. Per evitare questi effetti compounding, C. elegans possono essere coltivate in un mezzo liquido axeniche che è privo di batteri come fonte di cibo. Usando questo supporto, abbiamo coltivato con successo milioni di vermi altamente sincronizzati per molti di serie C. protocolli elegans, compresa l&#39;analisi microarray di geni differenzialmente regolati in C. elegans esposto a diverse concentrazioni eme, e produzione di vermi transgenici utilizzando gene bombardamento. Questo supporto è chimicamente definita e modificata da una ricetta originale formulata dal Dr. Eric Clegg 9. Usando questo supporto mCeHR, abbiamo identificato con successo geni coinvolti nella eme omeostasi, riferiti ai geni come eme responsivi (HRG s) 10, che avrebbenon sarebbe stato possibile in condizioni di crescita regolari che utilizzano piastre di agar NGM seminato con E. coli. In questo protocollo si descrive la procedura per l&#39;introduzione e il mantenimento C. elegans cresciuti su E. coli per la axenic mCeHR e utilizzare questo metodo per ottenere un gran numero di vermi per produrre transgenico C. Linee elegans utilizzando microparticelle bombardamento. Abbiamo presenti anche studi che dimostrano l&#39;utilità di utilizzare supporti axeniche per la determinazione del fabbisogno nutrizionale di C. elegans utilizzando eme come esempio. Questi studi mostrano che utilizzando mCeHR supporti consente la rapida crescita di un gran numero di C. elegans per molte applicazioni a valle utilizzate dai ricercatori worm.

<table><tbody><tr><td>MgCl2&#8226; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di potassio monoidrato</td><td>Sigma</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&#8226; 4H2O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)2(SO4)2&#8226; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5 -monofosfato, sale sodico</td><td>Sigma</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>Citidina 5 -fosfato</td><td>Sigma</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>Guanosina 2' - e 3' -monofosfato</td><td>Sigma</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>Uridina 5 -fosfato, sale disodico</td><td>Sigma</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>Timina</td><td>Sigma</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilglucosamina</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-alanina</td><td>Fisher</td><td>S25648&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acido p-aminobenzoico</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>Cianocobalamina (B-12)</td><td>Sigma</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>Folinato (Ca)</td><td>Sigma</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>Niacina</td><td>Sigma</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamide</td><td>Sigma</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>Panteteina</td><td>Sigma</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenato (Ca)</td><td>Sigma</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>Acido pteroilglutammico (acido folico)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>Piridossale 5'-fosfato</td><td>Sigma</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>Piridossamina 2HCl</td><td>Sigma</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>Piridossina HCl</td><td>Sigma</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavina 5-PO4(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>Sigma</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-Acido tiottico</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Colina di-acido citrato</td><td>Sigma</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>myo-Inositolo</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>Idrolizzato enzimatico di lattoalbumina</td><td>Sigma</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di emina</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, sale sodico</td><td>Sigma</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi Soluzione</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Acido nalidixico sale sodico</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina cloridrato</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di somministrazione biolistico</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Particelle d'oro (Au Powder)&nbsp;</td><td>&nbsp; Sistemi di materiali Ferro Electronic</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>o</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>particelle d'oro 1.0 &mu; m</td><td>BioRad</td><td>&nbsp; Codice 165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing caenorhabditis elegans in axeniche liquid media e la creazione di transgeniche worms da microparticelle bombardamento

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In questo protocollo, presentiamo i materiali necessari, e la procedura per fare C modificati. Legans e assuefazione e della Riproduzione media (mCeHR). Inoltre, la procedura per l&#39;esposizione e acclimatazione C. elegans cresciuti su E. coli a axeniche mezzi liquidi sono descritti. Infine, gli esperimenti a valle che utilizzano axenic C. elegans illustrano i benefici di questa procedura. La capacità di analizzare e determinare C. fabbisogno nutritivo elegans è stato illustrato da una crescente N2 wild type vermi in mezzi liquidi axeniche con concentrazioni variabili eme. Questa procedura può essere replicata con altri nutrienti per determinare la concentrazione ottimale per la crescita e lo sviluppo verme o, per determinare gli effetti tossicologici dei trattamenti farmacologici. Gli effetti di varie concentrazioni eme sulla crescita di tipo selvaggio vermi sono stati determinati mediante osservazione microscopica qualitativa e quantificazione tegli numero di worm che crescevano in ciascuna concentrazione eme. Inoltre, l&#39;effetto di varie concentrazioni di nutrienti può essere saggiata utilizzando vermi che esprimono sensori fluorescenti che rispondono alle variazioni del nutriente di interesse. Inoltre, un gran numero di vermi erano facilmente prodotti per la generazione di transgenici C. elegans utilizzando microparticelle bombardamento.

Coltura C. elegans in axeniche aiuti mezzo liquido nella determinazione di sostanze nutritive che sono richiesti dai vermi, senza interferenze da parte di metaboliti secondari prodotti da E. coli. Worm di tipo selvatico N2 acclimatare i media mCeHR entro tre generazioni e mostrano una crescita paragonabile a vermi cresciuti su piastre NGM batteriche. Infatti, questi vermi diventano gravide entro 4 giorni, rispetto a 3,5 giorni per i vermi coltivati ​​sui batteri OP50. Un va...

C. elegans è di solito coltivate su piastre di agar solidi o liquidi in colture seminate con E. coli. Per evitare sottoprodotti batterici da confondere studi tossicologici e nutrizionali, abbiamo utilizzato un mezzo liquido axenic, CeHR, crescere e sincronizzare un gran numero di vermi per una gamma di applicazioni a valle.

Culturing Caenorhabditis elegans In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre e far crescere l'eleganza del mare nei mezzi liquidi CENIC per numerose applicazioni a valle. Ciò si ottiene sbiancando prima i vermi delle tombe dalle piastre di agar affamate. Il secondo passo della procedura consiste nel trasferire gli ovuli rilasciati in M-C-E-H-R con antibiotici e lasciarli sviluppare fino allo stadio di tomba, che può richiedere da sette a 10 giorni.Il terzo passo è quello di sbiancare le tombe e permettere loro di svilupparsi una seconda volta fino allo stadio di tomba senza ulteriori antibiotici. Il passo finale consiste nel sincronizzare i vermi Axe e utilizzarli per studi nutrizionali che esaminano la crescita e lo sviluppo dei vermi. In definitiva, i risultati mostrano che l'eleganza selvatica di tipo C cresce bene nei terreni Axe Liquid e i terreni M-C-E-H-R possono essere utilizzati per esaminare le esigenze nutrizionali dei vermi senza sottoprodotti batterici.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la coltivazione di vermi su piastre di agar o in terreni liquidi con batteri, è che gli effetti degli elementi nutritivi o delle tossine possono essere testati senza confondere i sottoprodotti batterici. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della preparazione del terreno e dell'adattamento iniziale dei vermi al mezzo liquido EMIC. Questa procedura descrive la preparazione di terreni liquidi M-C-E-H-R-A che consentono a C elegance di crescere senza una fonte di cibo batterico.Utilizzando una tecnica rigorosamente sterile sotto una cappa, mescolare i componenti del M-C-E-H-R nel seguente ordine. Inizia con la colina, il citrato di acido diadico e prosegui con la vitamina e il fattore di crescita. Mescolare il myo acetolo, il cloruro umano e infine aggiungere l'acqua deionizzata Filtrare la miscela M-C-E-H-R attraverso un filtro da 0,22 micron con aspirazione.Quindi, nell'ordine seguente, aggiungi l'acido nucleico, mescola la miscela di minerali, il latta, l'albumina, l'idrolizzato, gli aminoacidi essenziali, gli aminoacidi non essenziali, il fosfato di potassio, il deg, il cumulo di glucosio, il sale sodico e l'acqua deionizzata. Ora filtrate nuovamente il composto con l'aspirazione. Dopo il filtraggio, aggiungere il colesterolo al terreno e quindi controllare il pH di un'aliquota di terreno.Il pH dovrebbe essere compreso tra sei e 6,5. Se la soluzione è stata preparata correttamente, aggiungere un 20% in volume di latte pastorizzato al terreno M-C-E-H-R utilizzando una scrupolosa tecnica sterile. Conservare il supporto a quattro gradi Celsius.Tenete pronte 10 piastre NGM da 60 millimetri piene di vermi GR che hanno consumato la maggior parte dell'OP 50 E coli disponibile. Sciacquare questi vermi in un tubo conico da 50 millilitri. Utilizzando cinque millilitri di tampone M nine per piastra, lasciare che i vermi si depositino e quindi rimuovere con cura il surnatante.Ripetere l'operazione, risciacquare altre due volte aggiungendo un tampone M nine, lasciando che i vermi si depositino e rimuovendo il surnatante, quindi aggiungere sei volumi di cloruro di sodio normale 0,1 all'aggregato di vermi ora rispetto alla sospensione di vermi, preparare una miscela di un volume di cinque idrossido di sodio normale e due volumi di candeggina fresca. Soluzione Decolorare i vermi aggiungendo questa miscela alla sospensione. Il vortice successivo, la miscela fino a quando i vermi della tomba non si sono sciolti e rimangono solo le uova nella sospensione.Questo richiede tra i cinque e i 10 minuti. Utilizzare la microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 10 x per monitorare questa reazione nel tubo. Una volta isolate le uova, pellettatele a 800 G per 45 secondi e a quattro gradi centigradi, aspirate il surnatante e sciacquate il pellet due volte in 10 millilitri di acqua sterile nella cappa, ripetete la centrifugazione e l'aspirazione per questi risciacqui.Quindi, risospendere il pellet d'uovo con il terreno M-C-E-H-R e trasferire gli ovuli rilasciati in un pallone di coltura tissutale. Aggiungere 100 microgrammi per millilitro di tetraciclina alle uova nel pallone. Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa a flusso laminare.Utilizzando tecniche rigorosamente sterili, trasferire le colture liquide in un incubatore a 20 gradi Celsius e coltivarle su una piattaforma orbitale. L'agitatore a 70 giri/min monitora quotidianamente lo sviluppo dei vermi. Dopo sette-10 giorni, il verme dovrebbe svilupparsi fino allo stadio di Ravi, trasferire i vermi in un tubo conico e pellettarli a 800 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius in un rotore a secchiello oscillante.Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet di verme in un volume di cloruro di sodio 0,1 molare e lasciare che i vermi si depositino sul ghiaccio per cinque minuti. Ora, ripeti la procedura di sbiancamento di cui sopra e coltiva le uova nel mezzo liquido cenico. Come in precedenza, è essenziale che vengano utilizzate tecniche sterili durante la coltura dell'alleato dei vermi.Evitare l'uso di antibiotici garantisce che le colture di eleganza marina siano effettivamente prive di batteri contaminanti. Quando il processo di coltura viene ripetuto, la seconda generazione emette la tetraciclina dal terreno. A questo punto, le impostazioni cultura sincronizzate possono essere preparate per la sincronizzazione.Aggiungere 10 millilitri di tampone M nove alle uova rilasciate dopo lo sbiancamento dei vermi GR e lasciarle schiudere durante la notte a 20 gradi Celsius su una piattaforma orbitale. Agitare il giorno successivo, pellettare le larve a 800 G per cinque minuti e risospendere le larve L uno. In 10 millilitri di M-C-E-H-R, trasferire le sospensioni in un pallone da 25 centimetri quadrati e farle crescere fino alla loro massima densità.Controllare la crescita dei vermi ogni pochi giorni è necessario per garantire che i vermi non diventino troppo affollati e esauriscano i nutrienti disponibili nel mezzo. Per conservare una coltura di vermi axen, sospendere un pellet di vermi in 0,5 millilitri di tampone S in fiale di conservazione, aggiungere un volume di tampone S con glicerolo al 30%. Quindi trasferire le fiale a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius, seguita da una conservazione a lungo termine in azoto liquido per scongelare i vermi, incubare la fiala a 37 gradi Celsius fino a quando quasi tutto il ghiaccio non si è sciolto, il che richiede circa due minuti.Quindi, in condizioni sterili, trasferirli nuovamente in terreni M-C-E-H-R. Un vantaggio dell'uso di M-C-E-H-R è stato osservato negli studi che esaminano l'esatto fabbisogno di nutrienti sullo sviluppo dei vermi. I vermi sono stati coltivati in M-C-E-H-R integrati con quantità crescenti di eme per determinare livelli bassi ottimali e tossici di eme.Inoltre, è stato utilizzato un ceppo reporter inversamente responsivo all'eme per valutare indirettamente lo stato dell'eme dei vermi in un intervallo più piccolo di concentrazioni. Questi vermi cresciuti a quattro eme micromolari mostravano un'elevata fluorescenza, indicando che i vermi si trovavano in un ambiente a basso eme. Quando la concentrazione di eme è stata aumentata a otto micromolari, l'espressione della GFP è diminuita.Quando la concentrazione di eme è stata aumentata a 10 micromolari, i vermi hanno mostrato un'espressione di GFP molto bassa e a 20 micromolari di eme, non hanno mostrato alcuna espressione di GFP. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di utilizzare tecniche scrupolosamente sterili per garantire che le colture siano emiche e per prevenire la contaminazione batterica. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di fare in modo che M-C-E-H-R stabilisca e mantenga una cultura di eleganza del mare xenex che può essere utilizzata per un ampio numero di applicazioni, che richiedono un gran numero di eleganza del mare.

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Coltura a lungo termine di singoli Caenorhabditis elegans su terreni solidi per il monitoraggio longitudinale della fluorescenza e interventi avversivi

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Culturing Caenorhabditis elegans In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento

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