Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di osservare l'effetto degli eventi di ibridazione del DNA sugli spettri di impedenza utilizzando un dispositivo elettrochimico microfluidico. A tale scopo, viene fabbricato un chip elettrochimico per abilitare una serie di sensori a elettrodi e viene fabbricato un chip PDMS microfluidico. Per facilitare l'introduzione di campioni di micro volumi, i due chip vengono legati insieme e funzionalizzati con sonde di DNA a filamento singolo.

Il DNA a singolo filamento bersaglio viene quindi aggiunto al momento dell'ibridazione del DNA, la forza di repulsione più forte tra il DNA a doppio filamento caricato negativamente e le molecole di cianuro Ferris caricate negativamente si traduce in una maggiore resistenza al trasferimento di carica. In definitiva, gli eventi di ibridazione del DNA possono essere rilevati misurando i cambiamenti negli spettri di impedenza elettrochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'utilizzo di un lettore di piastre o di un saggio J shift, è che i dispositivi possono eseguire la stessa tecnica con un volume di campione ridotto e a una frazione del costo senza sacrificare la sensibilità o la specificità.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca sul cancro, nel rilevamento dell'influenza e nell'ingegneria genetica, consentendo un rapido screening di sequenze di DNA specifiche e lo studio della cinetica binaria di sequenze di DNA a singolo filamento. Poiché questo metodo di analisi dell'ibridazione del DNA ad alto rendimento può essere eseguito con un volume di campione ridotto e senza complicate fasi di preparazione del campione, le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di malattie genetiche, varie forme di cancro o malattie con marcatori di DNA specifici come l'influenza. In generale, le persone che non conoscono il metodo avranno difficoltà perché lo sviluppo di micro dispositivi richiede parametri di elaborazione di controllo e un approccio iterativo per risolvere problemi come la perdita di soluzioni.

Dopo l'assemblaggio del dispositivo Per modellare gli elettrodi d'oro sul chip elettrochimico, tenere un wafer di silicio da quattro pollici di prima qualità vuoto con una pinzetta e utilizzare un flacone di lavaggio per sciacquare la superficie di entrambi i lati del wafer con acetone, metanolo e quindi isopropanolo. Questo processo è indicato di seguito come una pulizia A MI sotto un flusso di acqua deionizzata. Sciacquare l'isopropanolo dal wafer, quindi utilizzare una pistola ad azoto per asciugare il wafer.

Caricare il wafer in un'apparecchiatura di deposizione chimica da vapore potenziata al plasma o P-E-C-V-D. Immettere i parametri per produrre uno strato di biossido di silicio spesso un micrometro e avviare il processo automatizzato successivamente, utilizzando uno strumento di sputtering CC depositare uno strato di angstrom di cromo 200 spesso sul wafer, quindi depositare uno strato di oro di 2000 strom di spessore. Caricare il wafer su uno spinner, spolverare la superficie con una pistola ad azoto e utilizzando una pipetta per pasta applicare spin PR un fotoresist positivo spin per creare un film uniforme di circa 1,6 micrometri di spessore.

Quindi precuocere la cialda per un minuto a 100 gradi Celsius su una piastra calda. Caricare il wafer con il fotoresist nell'attrezzatura dell'allineatore della maschera. Quindi avvia un'esposizione di 190 millijoule per centimetro quadrato a 405 nanometri in cui l'allineatore della maschera aprirà l'otturatore ed esporrà la fotoresistenza alla luce attraverso una maschera con le caratteristiche progettate.

Dopo l'esposizione, immergere la cialda in una capsula di vetro contenente 3 5 2 ossidante e incubare per 30 secondi agitando delicatamente. Quindi sciacquare la cialda sotto un getto d'acqua e asciugarla con la pistola ad azoto come prima. Quindi, immergere il wafer in un piatto di vetro contenente una soluzione di mordenzatura all'oro e incubare per 1,5 minuti agitando delicatamente.

Quindi trasferire l'ostia in un piatto di vetro contenente il cromo menzionato e incubare agitando delicatamente fino a quando i segni di cromo sull'ostia scompaiono. L'operazione dovrebbe richiedere circa 30 secondi. Sciacquare la cialda con acqua e asciugarla con la pistola ad azoto tenendo la cialda con una pinzetta.

Smontare il photo resist utilizzando la procedura di pulizia MI. Quindi risciacquare con acqua deionizzata e asciugare con la pistola ad azoto indossando due strati di guanti. Immergere il wafer in una capsula di teflon con soluzione pulita di piranha per un minuto.

Quindi sciacquare il wafer con acqua e asciugarlo con una pistola ad azoto. Accanto al modello degli elettrodi di platino, caricare il wafer su uno spinner. Spolverare la superficie utilizzando una pistola ad azoto e utilizzando una pipetta per pasta erogare PR due fotoresist positivi sulla superficie di rotazione per creare un film uniforme di circa 1,4 micrometri di spessore.

Mettere la cialda su una piastra calda a 100 gradi Celsius e precuocere per un minuto. Dopo la precottura, esporre la cialda a 30 millijoule per centimetro quadrato 405 nanometri attraverso una maschera fotografica. Posizionate quindi la cialda su una piastra calda a 125 gradi e infornate per 45 secondi.

Rimuovere la maschera dalla maschera, dall'allineatore e allagare. Esporre il wafer con 1000 millijoule per centimetro quadrato a una lunghezza d'onda di 405 nanometri senza una maschera fotografica. Dopo l'esposizione, sviluppare il wafer immergendolo in una capsula di vetro contenente sei a uno una soluzione di sviluppo Z 400 K.

Incubare per due minuti agitando delicatamente. Quindi sciacquare il wafer con acqua e asciugarlo con una pistola ad azoto. Utilizzando un sistema di evaporazione a fascio E, depositare uno strato di titanio spesso 400 angstrom seguito da uno strato di platino spesso 1600 angstrom sul wafer.

Metti il wafer in un piatto di vetro pieno di acetone e metti il piatto in un bagno a ultrasuoni per cinque minuti per sollevare la foto. Resisti quindi a tenere l'ostia con una pinzetta. Utilizzare un flacone di lavaggio per sciacquare entrambe le superfici del wafer con acetone e poi isopropanolo.

Sciacquare il wafer con acqua di e asciugarlo con la pistola ad azoto. Per preparare lo stampo per i canali del saggio, sciacquare un wafer di silicio di qualità da quattro pollici con la procedura MI clean. Come prima, sciacquare l'isopropanolo dal wafer con acqua, quindi asciugarlo con una pistola ad azoto.

Caricare la cialda su una spinner, spolverare la superficie della cialda con una pistola ad azoto e utilizzando una pipetta per pasti erogare PR tre fotoresist negativi sulla superficie per creare una pellicola uniforme di circa 100 micrometri di spessore. Metti la cialda su una piastra calda per precuocerla utilizzando una procedura di cottura in due fasi. Innanzitutto, aumenta la temperatura da temperatura ambiente a 65 gradi Celsius a 300 gradi Celsius all'ora.

Quindi mantieni la temperatura a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Rampa fino a 95 gradi Celsius a 300 gradi Celsius all'ora e poi mantieni la posizione per 30 minuti. Esporre il wafer con 2.500 millijoule per centimetro quadrato a una lunghezza d'onda di 405 nanometri attraverso una maschera fotografica.

Quindi posizionare il wafer su una piastra calda e cuocere il wafer aumentando dalla temperatura ambiente a 95 gradi Celsius a 300 gradi Celsius all'ora. Mantieni la temperatura a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Immergere il wafer in una capsula di vetro contenente glicole propilenico, acetato di etere monometilico o rivelatore P-G-M-E-A e lasciarlo sviluppare per 10 minuti.

Sciacquare il wafer con isopropanolo e asciugarlo con una pistola ad azoto per fabbricare i canali di analisi per trovare un involucro attorno al wafer dello stampo con un foglio di alluminio e versare lentamente il polidimetil suboxano non polimerizzato o PDMS sullo stampo. Cuocere lo stampo con il PDMS in un forno a scatola utilizzando una procedura di cottura in due fasi in cui la temperatura sale da una temperatura ambiente a 80 gradi Celsius in cinque minuti e rimane a 80 gradi Celsius per 17 minuti. Dopo che lo stampo si è raffreddato, staccare il PDMS dallo stampo e posizionarlo su un foglio di alluminio.

Tagliare i chip del test con un coltello chirurgico e definire i fori con uno strumento di punzonatura per biopsia, come mostrato qui. Allineare manualmente i canali del saggio PDMS con gli elettrodi di lavoro sul chip elettrochimico. Il PDMS aderisce bene al chip elettrochimico, sigillando i canali e prevenendo le perdite.

Collegare il tubo flessibile a un gomito di plastica o a un connettore diritto utilizzando un tubo flessibile corto come adattatore per funzionalizzare i microcanali verticali. Collegare una siringa contenente la sonda di DNA a filamento singolo al tubo e inserirla in una pompa a siringa. Collegare i connettori a ciascuno degli ingressi forati interi nel dispositivo.

L'aspetto più difficile di questa procedura è far fluire la soluzione nei microcanali senza generare bolle. Per garantire il successo, far fluire la soluzione molto lentamente Per ottenere un riempimento omogeneo del canale, avviare la pompa a una portata di 200 microlitri all'ora per riempire lentamente ciascuno dei tre microcanali separati con una diversa soluzione di incubazione della sonda di DNA a filamento singolo. Dopo l'incubazione per un'ora, sostituire il tubo della siringa e il connettore per sciacquare i microcanali con PBS Quindi, sostituire il tubo della siringa e i connettori per riempire il microcanale con una soluzione composta da un CAPTO millimolare di sei mer, un ETANOLO MCH H in 10 millimolari di PBS, 100 millimolari di cloruro di sodio e 1,395 millimolari di TCEP incubati per un'ora.

Quindi risciacquare con PBS come prima di usare le pinzette. Sollevare il PDMS ruotato di 90 gradi in orientamento orizzontale e posizionarlo verso il basso. Ciò esporrà file separate di camere di reazione, ciascuna delle quali conterrà un contatore e un elettrodo di riferimento unici per l'analisi dell'ibridazione del DNA.

Sostituire, il tubo della siringa e i connettori per riempire i microcanali con una soluzione di misurazione di controllo di soluzione salina concentrata Forex citrato di sodio SSC tampone incubare per 20 minuti dopo l'incubazione Sostituire la siringa per riempire i microcanali con cinque millimolari di cianuro Ferris cinque millimolari di cianuro Pharaoh in soluzione PBS. Quindi, per registrare i valori di impedenza di fondo del sistema elettrochimico per diverse frequenze mediante spettroscopia di impedenza elettrochimica o EIS, collegare una statistica di potenziale al contatore di lavoro e agli elettrodi di riferimento utilizzando le punte della sonda. Inserire i parametri della misurazione EIS nel software del computer e quindi avviare la misurazione.

Ripetere questa misurazione per ogni elettrodo funzionante nei microcanali per misurare l'ibridazione del DNA per ogni scambio di bersagli di DNA a singolo filamento non complementare e complementare. Il tubo della siringa e il connettore. Riempire i microcanali con un tampone SSC concentrato quattro volte contenente un micromolare del DNA a singolo filamento target e incubare per 20 minuti.

Effettuare le misurazioni avviando la misurazione EIS con un software sul computer per ogni soluzione di DNA a singolo filamento target per convalidare l'attività elettrochimica del vol ciclico del biochipp. Le misurazioni telemetriche sono state effettuate nei micro canali riempiti con un cianuro redox elettroattivo Coppia cianuro cianuro mostrati qui sono telegrammi vol ciclici di nove elettrodi funzionanti. La forma simile, l'altezza dei picchi e la separazione dei picchi per tutti gli elettrodi dimostrano un'elevata riproducibilità per dimostrare la capacità dei biochip di rilevare eventi di ibridazione del DNA.

variazioni di impedenza elettrochimica sono state misurate per gli eventi di ibridazione tra tre sonde di DNA a singolo filamento e i loro bersagli di DNA a singolo filamento complementari e non complementari sono state osservate variazioni di resistenza al trasferimento di carica più elevate quando il bersaglio di DNA a singolo filamento complementare è stato introdotto e ibridato con la sonda rispetto all'introduzione di bersagli di DNA a singolo filamento non complementari per dimostrare la sensibilità del biosensore. Diverse concentrazioni di bersaglio di DNA a filamento singolo complementare sono state introdotte nella sonda di rilevamento mostrata qui è un diagramma di Nyquist delle misure di spettroscopia di impedenza elettrochimica dopo l'introduzione di concentrazioni crescenti di DNA a singolo filamento indicato dalla freccia sul grafico. Valori di impedenza aumentati sono stati osservati a basse frequenze di circa 15 hertz per concentrazioni di DNA a singolo filamento più elevate, a causa delle forze di repulsione più forti tra il DNA a doppio filamento e le molecole di cianuro Ferris del ferrocianuro.

Nel complesso, il BIOCHIPS mostra la capacità di percepire rapidamente la presenza di eventi di ibridazione del DNA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare e fabbricare un dispositivo elettrochimico microfluidico e utilizzarlo per rilevare eventi di ibridazione del DNA. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare vari parametri del bios come il rapporto segnale/infermiere, la stabilità e la sensibilità Dopo questa procedura.

Altri metodi, come l'introduzione di bersagli di DNA a singolo filamento con sequenze leggermente diverse di acidi nucleici, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come la combinazione e la competizione delle mutazioni del DNA. Non dimenticare che lavorare con soluzioni di processo di microfabbricazione può essere estremamente pericoloso e la protezione degli occhi e delle mani del corpo dovrebbe sempre essere avvertita durante l'esecuzione di questa procedura.