In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

Questo articolo descrive microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo come una tecnica di trasfezione per le cellule testicolari di topo per studiare processi unici di spermatogenesi. Il protocollo presentato prevede fasi di preparazione capillare di vetro, microiniezione attraverso il dotto efferente, e trasfezione mediante elettroporazione.

Lo scopo di questa procedura è quello di eseguire la microiniezione di costrutti genetici nel testicolo del topo, seguita dall'elettroporazione InVivo. Ciò consente di condurre un'analisi genica completa con particolare attenzione alla spermatogenesi e alla funzione testicolare. Ciò si ottiene ottenendo prima l'accesso al testicolo attraverso un'incisione addominale direttamente sopra le ghiandole PrepU.

Il secondo passo consiste nel preparare il dotto efferente attaccato al testicolo per la microiniezione liberando il vaso dal suo tessuto adiposo. Successivamente, il dotto otorinolaringoiatrico viene perforato con una pipetta di microiniezione caricata e la soluzione del costrutto genetico della macchia viene somministrata ai tubuli feroci testicolari. Il passo finale è la trasfezione multilaterale per elettroporazione del testicolo.

Infine, il testicolo trasfettato viene estratto dopo tre giorni per valutare la trasfezione mediante microscopia a fluorescenza o misurazioni con luminometro a seconda dei costrutti genici riportati utilizzati. Questa combinazione di tecnica di microiniezione dell'intelletto per i testicoli dei topi come metodi di trasfezione transitoria fornirà sicuramente molti vantaggi rispetto agli approcci esistenti come gli animali transgenici o i topi knockout. Garantisce prestazioni rapide, un costo contenuto e la necessità di competenze tecniche moderate.

Si spera che questo approccio metodologico possa essere saggio per la tecnica disponibile nel campo della ricerca sulla fertilità maschile. Potrebbe essere essenzialmente utile per affrontare un ampio spettro di questioni riguardanti i geni sperimentali e i processi di fertilità. Ciò sarebbe particolarmente possibile quando si utilizza questo metodo per l'analisi genetica sotto forma di guadagno di tutti gli esperimenti di perdita di funzione.

Presumibilmente, sarà molto utile anche per studiare elementi regolatori, ad esempio, di geni specifici della spermatogenesi. Per iniziare la procedura, anestetizzare un topo maschio di sei-otto settimane con una miscela uno a uno di ketamina al 10% e xilazina al 2% per via sottocutanea. Quindi assicurati che il topo sia in anestesia profonda pizzicando le dita dei piedi.

Applicare un unguento sugli occhi per prevenire la secchezza. Successivamente, rimuovere i peli addominali con un rasoio elettrico e disinfettare successivamente l'area chirurgica. Praticare un'incisione ventrale direttamente sopra le ghiandole PrepU al centro della zona addominale.

Per questo, tirare la pelle ed eseguire un piccolo taglio cutaneo trasversale. Quindi continuare lungo lo strato muscolare addominale. Sollevare con cautela i cuscinetti adiposi addominali per esporre il testicolo attaccato e posizionarlo su una carta sterile sull'addome.

Successivamente, utilizzare uno stereomicroscopio per trovare il dotto otorinolaringoiatrico per la microiniezione. È la sottile giunzione del vaso tra il testicolo e l'epididimo e si trova adiacente all'arteria testicolare. Rimuovere il tessuto adiposo che copre il dotto otorinolaringoiatrico con una pinza sottile.

Successivamente, posizionare il dotto di rilascio su una striscia di carta sterile, assicurandosi che il dotto sia facilmente visibile senza compromettere l'ambiente circostante. Successivamente, collegare la pipetta per microiniezione, che è stata precedentemente caricata con la soluzione plasmidica colorata, all'unità iniettore del micromanipolatore. Successivamente, posizionare l'ago per microiniezione parallelamente al dotto EENT con la punta rivolta verso il testicolo REIT.

Quindi utilizzare una pinzetta fine per rimuovere il condotto sopra la pipetta per microiniezione. Assicurarsi che la pipetta sia tenuta parallela al condotto mentre la si tira verso l'alto. Dirigere con cautela l'ago verso il testicolo e fermarsi non appena penetra nel testicolo REIT direttamente sotto la tunica albuginea.

Quindi, impostare i parametri del micro iniettore. Successivamente, iniziare a iniettare la soluzione del costrutto genico. Monitorare l'intero processo di iniezione osservando lo stato di riempimento del testicolo.

Con l'aiuto della soluzione plasmidica colorata, costruire il testicolo solo fino a due terzi del suo volume. Per consentire un'efficace elettroporazione. Immergere gli elettrodi delle pinzette in una volta PBS per garantire un'adeguata conduttanza.

Quindi premere leggermente il test tra gli elettrodi bagnati e misurare la resistenza elettrica con l'elettroparata. Successivamente, impostare l'elettro in modo adeguato assicurandosi che la corrente possa essere applicata al testicolo con un numero totale di otto impulsi quadrati. In quattro diversi siti del testicolo, eseguire l'elettroporazione in modo completo intorno all'intero testicolo.

Al termine dell'elettroporazione, riposizionare il testicolo nell'addome il più vicino possibile alla sua posizione originale. Quindi lo strato muscolare interno era una sutura chirurgica assorbibile. Quindi chiudere la pelle con clip di sutura.

Consenti al topo di riprendersi dall'anestesia. In una scatola sterile riscaldata su un termoforo a 37 gradi Celsius, preparata con della carta assorbente. Il pad dovrebbe garantire il riscaldamento di solo una metà della gabbia creando un gradiente di calore.

Inoltre, copri il mouse con un altro foglio di carta assorbente per ridurre ulteriormente lo stress. Dopo che l'animale si è completamente svegliato, trasferiscilo in una nuova gabbia pulita e completamente attrezzata. Ma un ulteriore recupero, monitora il processo di recupero fino a quando non riporti finalmente il topo alla struttura per animali.

Questa figura mostra l'intero testicolo Mount tre giorni dopo l'elettroporazione in vivo mediante rilevamento a fluorescenza, i testicoli trasfettati di un topo C 57 black six mostrano una proteina fluorescente verde potenziata o una proteina fluorescente rossa. Ecco le sezioni istologiche di un testicolo. Tre giorni dopo l'elettroporazione unilaterale con PE eeg, FPC one, le cellule tubulari seminifere trasfettate sono illustrate da fluorescenza verde, insieme alla loro tipica struttura organizzata sfericamente.

I loro nuclei erano contromacchiati con due pro tre in blu. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante tenere presente che i processi di identificazione del dotto otorinolaringoiatrico e il rilascio del suo tessuto adiposo sono piuttosto sofisticati. Pertanto, puoi esercitarti su un animale morto prima di realizzare una vera esperienza in vivo.

Dopo l'anti procedura di elettroporazione a microiniezione e la raccolta del test finale, è possibile eseguire molte tecniche come la nave Q-R-T-P-C-R e il Western blotting. Quindi, lo xining del gene tester sono modelli di espressione proteica e le modifiche post-traduzionali sono scontate. Quindi, per mezzo di questi strumenti, una grande varietà di argomenti potrebbe essere attaccata come la spermatogenesi, per esempio, con i suoi complessi meccanismi e regolazioni.