Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

L'isolamento delle cellule stromali dei linfonodi è una procedura a più fasi che include la digestione enzimatica e la disaggregazione meccanica per ottenere cellule reticolari fibroblastiche, cellule linfatiche ed endoteliali del sangue. Nella procedura descritta, una breve digestione è combinata con la disaggregazione meccanica automatizzata per ridurre al minimo la degradazione del marcatore di superficie delle cellule stromali linfonodali vitali.

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule stromali dei linfonodi. Ciò si ottiene interrompendo prima la capsula linfonodale. Nella seconda fase, i frammenti linfonodali vengono digeriti con collagenasi quattro e D nasi uno.

Gli enzimi vengono quindi sostituiti con la collagenasi D e la D nasi uno e i frammenti vengono disaggregati meccanicamente con una pipetta multicanale automatizzata. In definitiva, l'espressione delle molecole di superficie cellulare delle cellule linfonodali isolate può essere caratterizzata mediante citometria a flusso. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente è che con questo metodo, le cellule SHR dei linfonodi vengono digerite utilizzando una procedura enzimatica standardizzata integrata da una disaggregazione meccanica che preserva la vitalità e l'espressione molecolare superficiale delle cellule.

Inizia mettendo i linfonodi sezionati in una capsula di Petri sterile contenente due millilitri di mezzo ghiacciato. Quindi utilizzare due siringhe da un millilitro dotate di aghi da 25 gauge per interrompere le capsule linfonodali. Successivamente, trasferire il tessuto distrutto in una provetta conica da cinque millilitri contenente 750 microlitri di terreno, integrata con collagenasi quattro e DNA uno e un'agitazione magnetica.

Quindi posizionare la provetta in un becher contenente acqua preriscaldata a 37 gradi Celsius su un agitatore magnetico e mescolare i fanghi cellulari a un giro al secondo per 30 minuti. Dopo aver mescolato, lasciare che il frammento linfonodale si depositi e quindi rimuovere con cura il surnatante. Ora arricchito per le cellule non stromali trasferire ai frammenti linfonodali 750 microlitri di terreno fresco, integrati con collagenasi D e D nasi uno, quindi agitare il tessuto per altri cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale automatizzata per disaggregare i frammenti di tessuto linfonodale in un volume di 700 microlitri per 10 cicli alla massima velocità, quindi mescolare nuovamente i frammenti di tessuto dopo 10 minuti. Inoltre, disaggregare i grumi di tessuto con la pipetta multicanale automatizzata per 99 cicli alla massima velocità. Quindi aggiungere 7,5 microlitri di EDTA 0,5 molare alla provetta e miscelare la sospensione tissutale per altri 99 cicli con la pipetta automatizzata.

Dopo l'ultimo ciclo di disaggregazione, aggiungere 750 microlitri di terreno alla soluzione cellulare e filtrare le cellule attraverso una rete di nylon da 70 micrometri. Quindi pellettare le celle per cinque minuti a 1500 Gs e quattro gradi Celsius. Per visualizzare le popolazioni di cellule stromali linfonodali mediante citometria a flusso, colorare i campioni cellulari appropriati con un tracker vivo morto e gli anticorpi di interesse in 100 microlitri di HBSS contenenti il 2% di FCS per almeno 20 minuti a quattro gradi Celsius al buio.

Quindi lavare le cellule in 500 microlitri di HBSS con FCS e ririspendere. I pellet in 100 microlitri di HBSS e FCS fanno funzionare le cellule su un citometro a flusso che esclude le cellule CD45 positive per escludere le cellule ematopoietiche, quindi l'andatura sulla popolazione di singoletto vivo. Infine, tracciare GP 38 rispetto a CD 31 per visualizzare le cellule reticolari della zona T, le cellule endoteliali linfatiche, le cellule endoteliali del sangue e le cellule doppie negative.

Popolazioni cellulari. Il numero totale di cellule recuperate dopo la digestione dei sottogruppi di cellule stromali dei linfonodi era leggermente superiore nel protocollo appena dimostrato rispetto ai protocolli di collegamento e Fletcher, dimostrando che la vitalità delle cellule stromali dei linfonodi dopo l'isolamento con questo protocollo è simile a quella recuperata utilizzando i protocolli pubblicati. Le cellule reticolari della zona T e le cellule endoteliali linfatiche isolate tramite questo e i protocolli di collegamento e Fletcher sono stati confrontati per l'espressione di IAB CD 1 40 e CD 80, PD L one e CD 40.

L'espressione di tutte e cinque le molecole di superficie era più alta dopo la digestione con il protocollo appena dimostrato e il protocollo di collegamento per entrambi i sottogruppi di cellule stromali, suggerendo che la degradazione di alcune molecole di superficie da parte della collagenasi quattro e D è meno robusta rispetto alla collagenasi p e allo spazio DYS. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare con successo le quattro principali sottopopolazioni di cellule stromali linfonodali preservando l'espressione di diverse molecole di superficie utili per la loro ulteriore caratterizzazione e analisi.