Name: Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Impara l'isolamento di cellule stromali del linfonodo murino mediante digestione enzimatica con collagenasi e DNasi e disaggregazione meccanica. Questo metodo preserva la vitalità cellulare e l'espressione dei marcatori di superficie per studi immunologici.

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Gli autori ringraziano Sanjiv Luther e colleghi per le utili discussioni nello stabilire l'attuale protocollo di digestione dei linfonodi. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni SNF PPOOA-_119204 e PPOOP3_144918 a S.W.R.

In questa pubblicazione video e protocollo, sono state effettuate tutte le procedure sugli animali conformemente al protocollo animali approvato dalla Autorità cantonale di Basilea Città, Svizzera. 1 Linfonodi Preparazione e digestione <ol><li> Acqua preriscaldo in un becher da 37 ° C su un agitatore magnetico con piastra di riscaldamento. </li><li> Preparare Base Medio come segue: terreno DMEM (senza piruvato) supplementato con FCS 2%, 1,2 mM CaCl 2 e Pen / Strep (100 unità di penicillina, 100 mg di streptomicina). </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione prima dell&#39;uso. </li><li> Euthanize topi linfonodale donatori per CO 2 asfissia e asettico sezionare i linfonodi. Non sezionare il grasso circostante. NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per il nodo periferico-pelle drenante linfatico (inguinale, brachiale, ascellare). </li><li> Mettere i linfonodi in una capsula di Petri sterile contenente 2 ml di ghiaccio freddo ambiente basico. </li><li> Interrompere il linfonodo capsule utilizzando due aghi 25 G fissi sulla siringa da 1 ml. </li><li> Trasferire il tessuto linfonodale interrotto in 5 ml in polipropilene tubo a fondo rotondo contenente 750 ml terreno base integrato con 1 mg / ml di collagenasi IV e 40 mcg / ml I. DNAse </li><li> Aggiungere un agitatore magnetico sterile in ciascuna provetta. </li><li> Inserire il tubo nel bicchiere con 37 ° C preriscaldato acqua e mescolare i tubi a bassa velocità (1 round / sec) per 30 min. </li><li> Rimuovere il tubo dalla agitatore magnetico con piastra di riscaldamento e lasciare frammenti linfonodali stabilirsi. </li><li> Rimuovere con cautela il surnatante arricchito in &quot;cella non stromali&quot;. NOTA: Se l&#39;analisi di T, B, cellule dendritiche e CD45 - gp38 - CD31 - è previsto, salva la frazione &quot;cellule non-stromali&quot;. </li><li> Lavare restante tessuto linfonodale una volta con 750 microlitri di media di base. NOTA: Questo passaggio è necessario solo se si lavora con i topi immuno-competenti. </li><li> Lasciate frammenti linfonodali stabilirsi. </li><li> Rimuovere ilfrazione di cellule-floating non-stromale. </li><li> Aggiungi ai frammenti linfonodali 750 microlitri terreno base integrata con 3,5 mg / ml Collagenase D e 40 mcg / ml DNasi I. </li><li> Collocare il tubo indietro nel bicchiere contenente la 37 ° C preriscaldato acqua. </li><li> Digest nodo tessuto linfatico per 5 minuti mentre lentamente mescolando. </li><li> Disaggregare linfatici frammenti di tessuto nodo di pipettaggio e mescolando 700 ml per 10 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata. NOTA: Questo sconvolge nodo tessuto linfatico per migliorare la digestione. </li><li> Posizionare il tubo di nuovo nel bicchiere con 37 ° C acqua preriscaldata. </li><li> Digest frammenti di tessuto linfonodale per altri 10 min, mescolando lentamente. </li><li> Disaggregare linfatici frammenti di tessuto nodo pipettando e miscelazione per 99 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata. </li><li> Aggiungere 7,5 ml di 0,5 M EDTA per assicurare il mantenimento della sospensione singola cellula. </li><li> Frammenti di tessuto linfonodale disaggregare per tubotting e miscelazione per 99 cicli a velocità massima utilizzando una pipetta multicanale automatizzata. </li><li> Aggiungere 750 microlitri di media di base e passare le cellule attraverso una maglia di nylon di 70 micron. </li><li> Sospensione cellulare Centrifugare 5 min a 1.500 xg, a 4 ° C. </li><li> Cellule stromali possono ora essere utilizzati per ulteriori analisi. </li></ol> 2. colorazione di cellule stromali Linfonodo <ol><li> Utilizzare una combinazione di anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anticorpi anti-CD31 per riconoscere con successo le cellule TRC, LEC, BEC e DN. </li><li> Incubare il tessuto linfonodale digerito con Live / inseguitore Morto, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) in 100 microlitri HBSS contenente 2 % FCS per almeno 20 min, 4 ° C, al buio. </li><li> Lavare le cellule aggiungendo 500 l di HBSS contenente 2% FCS </li><li> Sospensione cellulare Centrifugare 3 min a 1500 xg, a 4 ° C. </li><li> Risospendere in 100 ml di HBSS contenente 2% FCS. </li><li> Eseguire le cellule colorate in un citofluorimetro equipped con le seguenti ottiche: fonte di eccitazione fino a tre laser: blu (488 nm, raffreddato ad aria, 20 mW a stato solido), rosso (633 nm, 17 mW HeNe), e viola (405 nm, 30 mW a stato solido) . </li><li> Porta CD45 - cellule di escludere le cellule ematopoietiche. </li><li> Canottiere Cancello (FSC-W) e le cellule vive (live / inseguitore DEAD) per escludere doppietti e cellule morte. </li><li> Trama gp38 vs CD31 per visualizzare TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) cellule (vedi Figura 1) e DN (gp38 - - CD31). </li></ol>

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<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+Aire-expressing+cells+are+a+distinct+bone+marrow-derived+population+that+induce+functional+inactivation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells.</a> Immunity. 39, 560-572 (2013).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Lo studio delle cellule stromali linfonodali recentemente è diventato un focus di ricerca a causa dello sviluppo di due protocolli di digestione pubblicati 6,13. Entrambi i protocolli sono adeguate per ottenere cellule stromali nodo singolo linfatici ma differiscono per l&#39;uso di enzimi digestivi e il tempo di digestione. Poiché le cellule stromali e loro marcatori di superficie sono sensibili alla digestione enzimatica e sollecitazioni meccaniche, è necessario un protocollo ottimizzato. <p class="jove...

I linfonodi sono compartimenti specializzati in cui vengono avviate e coordinate risposte immunitarie adattative contro stranieri e di auto-antigeni. La procedura qui presentata descrive una breve digestione enzimatica combinata con pipettaggio meccanico automatizzato per ottenere linfonodo sospensione singola cella e ottenere l&#39;accesso a linfonodali cellule stromali vitali che mantengono l&#39;espressione di superficie di diverse molecole. Formare cellule stromali linfonodale l&#39;impalcatura del linfonodo e compiere tre funzioni principali: primo filtrano fluidi corporei di assaggiare antigeni, gli agenti patogeni e il loro modello molecolare associata patogeni (PAMP), così come le citochine e pericolo del modello molecolare associato (smorza) presente nel corpo. In secondo luogo, si attraggono e istruiscono le cellule presentanti l&#39;antigene (APC) e linfociti di interagire e di avviare le risposte immunitarie adattative; e terzo, offrono un ambiente strutturale per l&#39;omeostasi e la differenziazione dei linfociti 1-3. Durante le cellule stromali infiammazione dei linfonodi producono fattori di crescita, citochine e chemochine, adattarsi al rigonfiamento in tal modo organizzare l&#39;interazione tra cellule dendritiche (DC), T, e B- cellule. L&#39;orchestrazione delle risposte immunitarie è possibile solo a causa della complessa architettura strutturale formato da diverse popolazioni di cellule stromali. Cellule stromali linfonodi sono cellule CD45 negativi e si distinguono per l&#39;espressione di CD31 o gp38 in cellule endoteliali e fibroblastiche 1 -6. Gp38 + CD31 - definisce le cellule della zona T reticolari (TRC, noto anche come FRC: cellule reticolari fibroblastiche), gp38 + CD31 + definisce cellule linfatiche endoteliali (LEC), gp38 - CD31 + definisce cellule endoteliali del sangue (BEC). Inoltre, la caratterizzazione delle sottopopolazioni ha rivelato l&#39;esistenza di altre cellule stromali linfonodali. Infatti, una piccola popolazione di cellule periciti-simile è stato caratterizzato nellagp38 - CD31 - la popolazione 7. Pertanto, l&#39;adattamento della procedura di isolamento è vantaggiosa per l&#39;identificazione e la caratterizzazione delle proprietà funzionali di varie cellule stromali linfonodali. Prima dello sviluppo del linfonodo cellule stromali digestione protocolli di studio delle cellule stromali linfonodali era limitato a osservazioni in situ utilizzando la sezione di tessuto e microscopia. Tuttavia, studi strutturali e funzionali hanno mostrato caratteristiche importanti delle cellule stromali linfonodali. Cellule stromali linfonodi sono associati con podoplanin, collagene e della matrice extracellulare (ECM) proteine ​​per formare un complesso di 3 struttura dimensionale chiamato sistema conduit, che trasporta le proteine ​​linfatiche e massa molecolare associato-basso dal seno subcapsulare di linfonodo all&#39;alta endoteliale venule nella T cellule zona 8. Dendritiche sono in stretto contatto con le cellule dello stroma e può osservare sporge nel con tubolarestruttura duit di campione di fluido e rilevare gli antigeni 8. L&#39;interazione delle cellule stromali linfonodali (TRC e LECs) con DC è mediata dal rilascio e la presentazione delle chemochine CCL21 e CCL19 9,10. CCL19 e CCL21 sono riconosciuti dal recettore CCR7 facilitare dendritiche e le cellule T di migrare al linfonodo zona di cellule T 4,11. Nonostante l&#39;uso di chemochine simili, le cellule DCs e T hanno diverse rotte migratorie verso i linfonodi 12. Successivamente, utilizzando la digestione enzimatica del linfonodo e l&#39;isolamento delle cellule stromali linfonodali puri, studi funzionali sono stati condotti sul ruolo delle diverse cellule dei linfonodi stromali e la loro capacità di interagire con le cellule dendritiche e le cellule T / B 6,13. In primo luogo, il crosstalk tra la produzione di cellule T effettrici IFN-γ e cellule stromali linfonodali induce la produzione del metabolita ossido nitrico dimostrato di smorzare le risposte delle cellule T e la proliferazione negli organi linfoidi secondari 14-16. In secondo luogo, linfa ncellule stromali ODE sono stati riportati per supportare la differenziazione delle sottopopolazioni DC regolamentazione attraverso la produzione di IL-10 17, e di modulare naif omeostasi delle cellule T attraverso la produzione di IL-7 6,18. In terzo luogo, espressione di TLR in cellule stromali linfonodali suggerisce che le cellule stromali sono suscettibili di segnale derivato da una infezione o di auto-molecole rilasciato durante lesioni dei tessuti. Infatti, il trattamento di cellule stromali linfonodali con il ligando di TLR3 poly (I: C) induce una modesta sovraregolazione di grande espressione di istocompatibilità di classe I e sovraregolazione di co-inibitorio molecola PD-L1, ma non di molecole costimolatorie, con conseguente drammatici cambiamenti nel tessuto periferico antigeni espressione 19. Diversi gruppi hanno mostrato cellule stromali linfonodali esprimono antigeni tissutali periferiche e inducono tolleranza delle cellule T autoreattive 19,21-27. Pertanto, la comprensione delle interazioni tra cellule stromali linfonodali e l&#39;altro re migratorio ecellule linfonodali sidente aiuteranno a trovare nuove molecole bersaglio per consentire l&#39;attivazione o la soppressione delle risposte immunitarie durante l&#39;infiammazione. Pertanto, è necessaria l&#39;attuazione della separazione enzimatica pubblicata del linfonodo. Protocolli precedentemente pubblicati utilizzano diverse combinazioni di base di collagenasi-digestione enzimatica con una bassa sollecitazione meccanica 6,19,20. Tuttavia, lunghe incubazioni con enzimi di digestione o la diversa combinazione di digestione enzimatica potrebbero degradare diverse molecole di superficie necessaria per analizzare lo stato di attivazione e di individuare nuove cellule stromali linfonodali. A seconda del tipo di analisi delle cellule stromali, il protocollo Link o Fletcher protocollo potrebbe essere più adatto. Nella procedura descritta, una digestione enzimatica leggermente più corto è combinato con disaggregazione meccanica automatizzata per ridurre al minimo la superficie marcatore degradazione delle cellule stromali nodo linfa vitale. Questa procedura consente di isolamento altamente riproducibile edistinzione dei linfonodi popolazioni di cellule stromali con bassa variabilità e di oltre il 95% vitalità. Le cellule stromali linfonodi isolati a fresco possono essere utilizzati direttamente per l&#39;espressione marcatore di superficie, analisi delle proteine, e gli studi trascrizionali, nonché creazione di linee di cellule stromali di effettuare saggi funzionali in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>Concentrazione finale 2%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma 499609</td><td></td><td>Concentrazione finale 1,2 mM</td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>>160 unità per mg di peso secco, utilizzare alla concentrazione finale di 1 mg/ml</td></tr><tr><td>di Collagenasi D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td>utilizzare a 3,5 mg/ml</td></tr><tr><td>di DNAsi I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>l'uso a 40 & micro; g/ml</td></tr><tr><td>Magneti di agitazione</td><td>FAUST</td><td></td><td>5 mm di lunghezza-2 mm &oslash;</td></tr><tr><td>Tubi in polistirene a fondo tondo 5 ml</td><td>Falcon-BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico con funzione di riscaldamento</td><td>IKA-RCT-standard</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>piastre di Petri 100 mm, sterili</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>aghi da 25 G</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti topo CD45 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>anti topo CD11c Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>anti topo Podoplanin Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 8.1.1</td></tr><tr><td>anti topo CD31 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone MEC13.3</td></tr><tr><td> Eppendorf Xplorer plus, Multicanale</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 &; l volume massimo</td></tr><tr><td>anti mouse CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone APA5</td></tr><tr><td>anti mouse CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 16-10A1</td></tr><tr><td>anti mouse CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 1C10</td></tr><tr><td>anti mouse I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>anti mouse CD274 (PD-L1)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 10F.9G2</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Kit colorante per cellule morte Near-IR</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule murine linfonodo stromali

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Gli organi linfoidi secondari, compresi i linfonodi, sono composti da cellule stromali che forniscono un ambiente strutturale per l'omeostasi, l'attivazione e la differenziazione dei linfociti. Vari sottogruppi di cellule stromali sono stati identificati dall'espressione della molecola di adesione CD31 e della glicoproteina podoplanina (gp38), cellule reticolari della zona T o cellule reticolari fibroblastiche, cellule endoteliali linfatiche, cellule endoteliali del sangue e periciti FRC-simili all'interno della popolazione cellulare doppia negativa. Per tutte le popolazioni sono descritte diverse funzioni, tra cui la separazione e il rivestimento di diversi compartimenti, l'attrazione e l'interazione con diversi tipi di cellule, la filtrazione dei fluidi drenanti e la contrazione dei vasi linfatici. Negli ultimi anni, diversi gruppi hanno descritto un ruolo aggiuntivo delle cellule stromali nell'orchestrare e regolare le risposte citotossiche delle cellule T potenzialmente pericolose per l'ospite. 
I linfonodi sono strutture complesse con molti tipi di cellule diverse e quindi richiedono una procedura appropriata per l'isolamento delle popolazioni cellulari desiderate. Attualmente, i protocolli per l'isolamento delle cellule stromali linfonodali si basano sulla digestione enzimatica con tempi di incubazione variabili; Tuttavia, le cellule stromali e le loro molecole di superficie sono sensibili a questi enzimi, il che provoca la perdita dell'espressione del marcatore di superficie e la morte cellulare. Qui viene proposto un breve protocollo di digestione enzimatica combinato con la disgregazione meccanica automatizzata per ottenere una sospensione vitale di singole cellule di cellule stromali linfonodali che mantengono la loro espressione molecolare di superficie.

Il presente protocollo è un protocollo di digestione modificata pubblicato da Link et al., 2007 6 con un tempo di digestione breve (45 minuti massimo) a causa di disaggregazione meccanica con una pipetta multicanale automatizzata. Inoltre, la procedura è più standardizzato, minimizza la degradazione dei marcatori di superficie su diverse cellule stromali linfonodali e permette la gestione di più di un campione allo stesso tempo. Collagenase IV e Collagenase D in Links pro...

L'isolamento delle cellule stromali dei linfonodi è una procedura a più fasi che include la digestione enzimatica e la disaggregazione meccanica per ottenere cellule reticolari fibroblastiche, cellule linfatiche ed endoteliali del sangue. Nella procedura descritta, una breve digestione è combinata con la disaggregazione meccanica automatizzata per ridurre al minimo la degradazione del marcatore di superficie delle cellule stromali linfonodali vitali.

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule stromali dei linfonodi. Ciò si ottiene interrompendo prima la capsula linfonodale. Nella seconda fase, i frammenti linfonodali vengono digeriti con collagenasi quattro e D nasi uno.Gli enzimi vengono quindi sostituiti con la collagenasi D e la D nasi uno e i frammenti vengono disaggregati meccanicamente con una pipetta multicanale automatizzata. In definitiva, l'espressione delle molecole di superficie cellulare delle cellule linfonodali isolate può essere caratterizzata mediante citometria a flusso. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente è che con questo metodo, le cellule SHR dei linfonodi vengono digerite utilizzando una procedura enzimatica standardizzata integrata da una disaggregazione meccanica che preserva la vitalità e l'espressione molecolare superficiale delle cellule.Inizia mettendo i linfonodi sezionati in una capsula di Petri sterile contenente due millilitri di mezzo ghiacciato. Quindi utilizzare due siringhe da un millilitro dotate di aghi da 25 gauge per interrompere le capsule linfonodali. Successivamente, trasferire il tessuto distrutto in una provetta conica da cinque millilitri contenente 750 microlitri di terreno, integrata con collagenasi quattro e DNA uno e un'agitazione magnetica.Quindi posizionare la provetta in un becher contenente acqua preriscaldata a 37 gradi Celsius su un agitatore magnetico e mescolare i fanghi cellulari a un giro al secondo per 30 minuti. Dopo aver mescolato, lasciare che il frammento linfonodale si depositi e quindi rimuovere con cura il surnatante. Ora arricchito per le cellule non stromali trasferire ai frammenti linfonodali 750 microlitri di terreno fresco, integrati con collagenasi D e D nasi uno, quindi agitare il tessuto per altri cinque minuti a 37 gradi Celsius.Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale automatizzata per disaggregare i frammenti di tessuto linfonodale in un volume di 700 microlitri per 10 cicli alla massima velocità, quindi mescolare nuovamente i frammenti di tessuto dopo 10 minuti. Inoltre, disaggregare i grumi di tessuto con la pipetta multicanale automatizzata per 99 cicli alla massima velocità. Quindi aggiungere 7,5 microlitri di EDTA 0,5 molare alla provetta e miscelare la sospensione tissutale per altri 99 cicli con la pipetta automatizzata.Dopo l'ultimo ciclo di disaggregazione, aggiungere 750 microlitri di terreno alla soluzione cellulare e filtrare le cellule attraverso una rete di nylon da 70 micrometri. Quindi pellettare le celle per cinque minuti a 1500 Gs e quattro gradi Celsius. Per visualizzare le popolazioni di cellule stromali linfonodali mediante citometria a flusso, colorare i campioni cellulari appropriati con un tracker vivo morto e gli anticorpi di interesse in 100 microlitri di HBSS contenenti il 2% di FCS per almeno 20 minuti a quattro gradi Celsius al buio.Quindi lavare le cellule in 500 microlitri di HBSS con FCS e ririspendere. I pellet in 100 microlitri di HBSS e FCS fanno funzionare le cellule su un citometro a flusso che esclude le cellule CD45 positive per escludere le cellule ematopoietiche, quindi l'andatura sulla popolazione di singoletto vivo. Infine, tracciare GP 38 rispetto a CD 31 per visualizzare le cellule reticolari della zona T, le cellule endoteliali linfatiche, le cellule endoteliali del sangue e le cellule doppie negative.Popolazioni cellulari. Il numero totale di cellule recuperate dopo la digestione dei sottogruppi di cellule stromali dei linfonodi era leggermente superiore nel protocollo appena dimostrato rispetto ai protocolli di collegamento e Fletcher, dimostrando che la vitalità delle cellule stromali dei linfonodi dopo l'isolamento con questo protocollo è simile a quella recuperata utilizzando i protocolli pubblicati. Le cellule reticolari della zona T e le cellule endoteliali linfatiche isolate tramite questo e i protocolli di collegamento e Fletcher sono stati confrontati per l'espressione di IAB CD 1 40 e CD 80, PD L one e CD 40.L'espressione di tutte e cinque le molecole di superficie era più alta dopo la digestione con il protocollo appena dimostrato e il protocollo di collegamento per entrambi i sottogruppi di cellule stromali, suggerendo che la degradazione di alcune molecole di superficie da parte della collagenasi quattro e D è meno robusta rispetto alla collagenasi p e allo spazio DYS. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare con successo le quattro principali sottopopolazioni di cellule stromali linfonodali preservando l'espressione di diverse molecole di superficie utili per la loro ulteriore caratterizzazione e analisi.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Isolamento dei linfociti utilizzando il kit di Miltenyi MAC è un modo affidabile per purificare le cellule da tutta omogenati di tessuto linfoide. Cellule purificate utilizzando il sistema Miltenyi sono tipicamente ≥ 96% puro. Qui, le misure prese per isolare cellule T CD4 +, uno dei tanti kit offerto da Miltenyi.

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Un modo efficace per isolare i linfociti di topo tratto genitale è descritto. Questo metodo si avvale di digestione enzimatica e la separazione gradiente Percoll per consentire l'isolamento efficiente. Questa tecnica è anche adattabile a per l'uso in altre...

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Con le funzioni effettrici distinto da altri sottoinsiemi di cellule T, le cellule Th17 sono stati implicati nel centro di autoimmunità infiammatoria. Questo protocollo vitro la differenziazione in Th17 fornisce un mezzo per determinare se naïve linfociti T CD4 + in grado di differenziarsi in cellule Th17, e di esaminare ulteriormente il loro ruolo nella autoimmunità e risposta dell'ospite.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Viene descritta la generazione di chimere di linfonodi/cuscinetti adiposi per lo studio dell'origine delle cellule stromali dei linfonodi. Il metodo prevede l'isolamento dei linfonodi da topi neonati e cuscinetti adiposi embrionali, la generazione di cuscinetti linfonodali chimerici e il loro trasferimento sotto la capsula renale di un topo ospite.

Generazione di Linfonodo grassi Pad Chimere per lo studio del linfonodo stromale origine cellulare

Qui si descrive un metodo efficace per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T.

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

C'è un crescente interesse per la caratterizzazione quantitativa dei linfociti intestinali a causa del crescente riconoscimento che queste cellule svolgono un ruolo critico in una varietà di malattie intestinali e sistemiche. In questo protocollo, descriviamo come isolare singole popolazioni cellulari da diversi compartimenti dell'intestino tenue per la successiva caratterizzazione citofluorimetrica.

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

I linfociti sono i principali attori nelle risposte immunitarie adattative. Qui, presentiamo un protocollo di purificazione dei linfociti per determinare le funzioni fisiologiche delle molecole desiderate nell'attivazione dei linfociti in vitro e in vivo. Le procedure sperimentali descritte sono adatte per confrontare le capacità funzionali tra linfociti di controllo e linfociti geneticamente modificati.

L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei linfociti dai siti induttivi tra cui il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer ed i linfonodi mesenterici drenanti e i siti di effettrici tra la lamina propria e la epitelio intestinale del piccolo sistema immunitario intestinale.

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali murine dai capillari linfatici dermici. Le cellule endoteliali linfatiche isolate possono essere utilizzate per esperimenti in vitro a valle e per l'analisi dell'espressione proteica.

Isolamento di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine

Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Questo protocollo descrive una procedura di sopravvivenza per una linfadenectomia mesenterica murina sicura e ben tollerata a ciascuna delle quattro stazioni lungo la catena dei linfonodi mesenterici. Questa procedura è adattabile per consentire una interruzione selettiva della comunicazione linfatica con il colon distale, il colon prossimale e/o l'intestino tenue.

Linfodenectomia mesenterica murina per interruzione selettiva della comunicazione linfatica con intestino specifico per regione

Impara l'isolamento di cellule stromali del linfonodo murino mediante digestione enzimatica con collagenasi e DNasi e disaggregazione meccanica. Questo metodo preserva la vitalità cellulare e l'espressione dei marcatori di superficie per studi immunologici.

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

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