Name: Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Scopri la microscopia TIRF per visualizzare la dinamica dei singoli invaginati rivestiti di clatrina nelle cellule viventi. Questo metodo consente di studiare l'endocitosi mediata da recettori accoppiati a proteine G.

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Gli autori desiderano ringraziare i dottori C. Szalinski, H. Teng e M. Bruchez per l'aiuto con Imaris, R. Vistein e D. Shiwarski per l'aiuto tecnico e i consigli, e il dottor M von Zastrow, il dottor T Kirchhausen, il dottor D Drubin e il dottor W Almers per i reagenti e l'utile discussione. I finanziamenti forniti dalla sovvenzione T32 NS007433 a SLB e NIH DA024698 e DA036086 a MAP.

<ol><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Design+for+the+Clathrin-+and+Actin-Mediated+Endocytosis+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery.</a> Cell. 123 (2), (2005).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biology. 9 (3), (2011).</li>
<li>Ungewickell, E., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+units+of+clathrin+coats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly units of clathrin coats.</a> Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).</li>
<li>Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-like+protein+encoded+by+the+Drosophila+shibire+gene+associated+with+vesicular+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic.</a> Nature. 351 (6325), (1991).</li>
<li>Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+self-assembles+into+rings+suggesting+a+mechanism+for+coated+vesicle+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding.</a> Nature. 374 (6518), (1995).</li>
<li>Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+Clathrin-Coated-Pit+Invagination%2C+Cortactin+Recruitment%2C+and+Membrane+Scission+Observed+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells.</a> Cell. 121 (4), 593-606 (2005).</li>
<li>Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SH3+domain+of+amphiphysin+binds+the+proline-rich+domain+of+dynamin+at+a+single+site+that+defines+a+new+SH3+binding+consensus+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence.</a> The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).</li>
<li>Tosoni, D., Puri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTP+Specifically+Regulates+the+Internalization+of+the+Transferrin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor.</a> Cell. 123 (5), 875-888 (2005).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+Regulates+Clathrin-Coated+Pit+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics.</a> Cell. 127 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+modes+for+cargo-mediated+control+of+clathrin-coated+pit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).</li>
<li>Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+endocytosis+by+phosphatidylinositol-3%2C4-bisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+accessory+proteins+are+functionally+distinguished+by+their+differential+effects+on+the+maturation+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).</li>
<li>Loerke, D., Mettlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+and+dynamin+regulate+clathrin-coated+pit+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation.</a> PLoS Biology. 7 (3), (2009).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+actin+and+dynamin+recruitment+during+invagination+of+single+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits.</a> Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).</li>
<li>Ehrlich, M., Boll, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+by+random+initiation+and+stabilization+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits.</a> Cell. 118 (5), 591-605 (2004).</li>
<li>Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+actin+cytoskeleton+functions+at+multiple+stages+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).</li>
<li>Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+clathrin+and+adaptor+proteins+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis.</a> American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).</li>
<li>Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li>
<li>Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Short+Polypeptide+Marker+Sequence+Useful+for+Recombinant+Protein+Identification+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Dynamics+of+Endocytic+Clathrin-Coated+Pits+and+Coated+Plaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques.</a> PLoS Biology. 7 (9), (2009).</li>
<li>Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-Mediated+Regulation+of+a+Rapid+Rab4-Dependent+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).</li>
<li>Batchelder, E. M., Yarar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+for+Clathrin-dependent+Endocytosis+at+Sites+of+Cell-Substrate+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Single+Endocytic+Events+Reveals+Diversity+in+Clathrin%2C+Dynamin+and+Vesicle+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics.</a> Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).</li>
<li>Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+low+signal-to-noise+images+link+dynamin+and+AP2+to+the+functions+of+an+endocytic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint.</a> Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).</li>
<li>Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+caveolae+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution of caveolae during mitosis.</a> J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).</li>
<li>Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+in+bacteria+and+archaea%3A+versatile+small+RNAs+for+adaptive+defense+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.</a> Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).</li>
<li>Boch, J., Scholze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Code+of+DNA+Binding+Specificity+of+TAL-Type%5BTitle%5D)+AND+%22III+Effectors.+Science%22%5BJournal%5D)">Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type.</a> III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui si descrive l&#39;uso di TIRFM per visualizzare clatrina-mediata endocitosi (CME), a livello di singole controparti centrali in cellule viventi in tempo reale. CME è un evento rapido e altamente dinamico mediato dall&#39;effetto cumulativo di molti spazialmente e temporalmente separati singoli eventi. La maggior parte dei test che sono attualmente utilizzati, come le misurazioni biochimiche di interiorizzazione con biotinilazione superficie o di legame ligando, citometria a flusso o cellule dosaggi fissi di misura q...

Il processo di endocitosi clatrina-mediata (CME) dipende l&#39;arrivo tempestivo delle tante componenti del macchinario endocitosi clatrina-mediata per raccogliere il carico e manipolare la membrana plasmatica in vescicole 1-3. CME è avviata da membrana deformazione e di carico-adattatore proteine ​​che si uniscono in siti nascenti di endocitosi 1. Queste proteine ​​reclutano la clatrina proteina di rivestimento, che assembla in una struttura a gabbia che forma la fossa clatrina rivestite (CCP) 4. Una volta che il PCC è completamente assemblato in una forma sferica, membrana scissione, soprattutto attraverso l&#39;azione del grande GTPasi, dynamin, genera vescicole libere clatrina rivestite (CCV) 5,6. Questa interiorizzazione innesca un rapido smontaggio del mantello clatrina, permettendo componenti di essere riutilizzati per più cicli di CME. La scoperta e la caratterizzazione delle proteine ​​coinvolte nella CME è stata radicata nella Bioch tradizionaleemical, e le tecniche di microscopia genetiche 4-6,8. Questi test hanno chiarito i ruoli e punti di interazione di questi componenti endocitiche. Anche se molto utile per definire i componenti essenziali di macchinari traffico, questi test sono molto limitati a catturare il comportamento dinamico dei componenti CME o concentrazione del carico. Questa è una limitazione fondamentale, dal momento che CME è guidato dalla assemblea coreografia di serie di moduli proteici in passi definiti, e dal momento che i piccoli cambiamenti nelle dinamiche dei singoli eventi endocitiche può avere grandi conseguenze cumulative di endocitosi. Inoltre, dati recenti indicano che le singole controparti centrali possono differire sia nella composizione e nel comportamento, suggerendo che la regolazione fisiologica di questo processo è altamente spazialmente e temporalmente vincolato 9-14. Visualizzare singoli eventi endocitiche, dunque, è essenziale per capire il motivo per cui ci sono più proteine ​​ridondanti coinvolte nel CME e b come queste proteine ​​possano essere controllatisegnali fisiologici y per regolare il carico internalizzazione. Qui si descrive l&#39;uso di Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) per osservare CME a livello della dinamica dei singoli CCP in cellule viventi. TIRFM si basa sulla differenza di indice di rifrazione tra il vetrino di vetro e l&#39;ambiente fluido di cellule 15,16. Quando la luce di eccitazione è diretto verso le cellule in oltre l&#39;angolo critico, si riflette internamente, creando un&#39;onda evanescente che mantiene un campo sottile di illuminazione che si estende a circa 100 nm sopra il vetrino. Questo assicura che solo le molecole fluorescenti all&#39;interno di questo ristretto campo sono entusiasti. In pratica, questo permette l&#39;eccitazione di molecole fluorescenti sopra o vicino alla membrana plasmatica, e riduce al minimo la fluorescenza dalle parti interne della cellula. Ciò fornisce un rapporto segnale-rumore e asse z risoluzione significativamente superiore per visualizzare gli eventi alla membrana plasmatica, compared a modi di trasporto più comunemente utilizzati, come epifluorescenza convenzionale o microscopia a fluorescenza confocale. Abbiamo anche descrivono, ad un livello introduttivo e pratico, l&#39;uso di un&#39;immagine piattaforma di analisi comunemente usato per analizzare e quantizzare semplici caratteristiche morfologiche e dinamiche dei singoli eventi cargo endocitiche.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Alto glucosio con L-glutammina e piruvato di sodio</td><td>Fisher Scientific.</td><td></td><td></td>SH3024301</tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio</td><td>Gibco, di Life Technologies</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Free Acid</td><td>Amresco</td><td>0322-500G</td><td></td></tr><tr><td>Gibco di siero fetale bovino</td><td>, di Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, senza rosso fenolo</td><td>Gibco, di Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco, di Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CellPURE di Fisher Scientific</td><td>BP2937-100</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>25 mm vetro di copertura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche trattate per colture cellulari Corning, 25 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One, di VWR</td><td>82050-896</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonale ANTI-FLAG M1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3040-5MG</td><td></td></tr><tr><td>[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetato sale (DAMGO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7384-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Kit</td> <td>di etichettatura delle proteineLife Technologies</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>BitPLane</td><td></td><td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris, per l'analisi</td></tr><tr><td>automatizzata Microscopio invertito Nikon Eclipse Ti e accessori necessari, tra cui cubi filtranti e filtri</td><td>Braccio Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon TIRF con adattatori necessari per Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>Per la regolazione dell'angolo di incidenza</td></tr><tr><td>iXon+ EMCCD fotocamera e adattatori</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione clathrin endocitosi mediata da g recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia tirf

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Molti importanti recettori di segnalazione vengono internalizzati attraverso il ben studiato processo di endocitosi mediata dalla clatrina (CME). I saggi biologici cellulari tradizionali, che misurano i cambiamenti globali nell'endocitosi, hanno identificato oltre 30 componenti noti che partecipano all'ECM e gli studi biochimici hanno generato una mappa di interazione di molti di questi componenti. Sta diventando sempre più chiaro, tuttavia, che l'ECM è un processo altamente dinamico la cui regolazione è complessa e delicata. In questo manoscritto, descriviamo l'uso della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare direttamente la dinamica dei componenti del macchinario endocitico mediato dalla clatrina, in tempo reale nelle cellule viventi, a livello di singoli eventi che mediano questo processo. Questo approccio è essenziale per chiarire i sottili cambiamenti che possono alterare l'endocitosi senza bloccarla globalmente, come si vede con la regolazione fisiologica. Ci concentreremo sull'utilizzo di questa tecnica per analizzare un'area di interesse emergente, il ruolo della composizione del carico nella modulazione della dinamica di distinte fosse rivestite di clatrina (CCP). Questo protocollo è compatibile con una varietà di sonde di fluorescenza ampiamente disponibili e può essere applicato alla visualizzazione della dinamica di molte molecole di carico che vengono internalizzate dalla superficie cellulare.

Utilizzando live-cella TIRF microscopia abbiamo registrato le dinamiche endocitiche del μ-oppioidi-recettore (MOR), un recettore accoppiati a proteine ​​G (GPCR) e la sua endocitica proteina adattatrice β-arrestina. Il costrutto β-arrestina stato trasfettate in una linea cellulare che esprime stabilmente MOR usando il protocollo descritto nella figura 1, e ripreso 96 ore dopo. Il MOR nella linea cellulare stabile è N-terminale contrassegnato con GFP sensibile al pH. Questa proteina fluorescente reagisce...

Endocitosi mediata dalla clatrina, un processo rapido e altamente dinamico, internalizza molte proteine, compresi i recettori di segnalazione. Il protocollo qui descritto visualizza direttamente la cinetica dei singoli eventi endocitici. Questo è essenziale per capire come i membri principali del macchinario endocitico si coordinano tra loro e come il carico proteico influenza questo processo.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e quantificare la dinamica dei singoli noccioli rivestiti di clatrina in cellule vive. Ciò si ottiene effettuando prima il sezionamento di proteine endocitiche e cargo marcate in fluorescenza in una linea cellulare di aderenza. Il passo successivo consiste nell'visualizzare le cellule con la microscopia a riflessione interna totale, a fluorescenza o a tappeto erboso.La durata di vita di piccoli set di noccioli rivestiti di clatrina viene quindi quantificata manualmente utilizzando un programma di elaborazione e analisi delle immagini. Il passo finale consiste nel quantificare la durata dei noccioli rivestiti di clatrina mediante rilevamento e analisi automatizzati oggettivi. In definitiva, la microscopia del tappeto erboso viene utilizzata per quantificare la dinamica delle singole fosse rivestite di clatrina alla risoluzione di un singolo evento per studiare l'endocitosi mediata dalla clatrina dei recettori accoppiati a proteine G.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del traffico di membrana, come ad esempio come l'assemblaggio e la dinamica dell'endocitosi possono cambiare in base alle

visualizing-clathrin-mediated-endocytosis-g-protein-coupled-receptors

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La compartimentazione delle proteine ​​sia all'interno della membrana plasmatica o in sedi intracellulari è un meccanismo di regolazione che possono influenzare notevolmente i risultati di segnalazione, di conseguenza, per comprendere la segnalazione è importante studiare il comportamento spaziale e temporale delle proteine ​​coinvolte. Descriviamo qui un sistema basato TIRF microscopia a studiare trasduzione del segnale in cellule T, ma è ampiamente applicabile.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopia è un approccio efficace per osservare le strutture in prossimità della superficie cellulare ad elevato contrasto e risoluzione temporale. Abbiamo dimostrato come TIRF può essere utilizzato per studiare dinamica della proteina alla corteccia di cellule di cellule batteriche e fungine parete chiusi.

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Etichettando i domini extracellulari dei recettori di membrana con pHluorin superecliptic, e da imaging questi recettori di fusione in neuroni di topo in coltura, si può visualizzare direttamente i singoli eventi di inserzione vescicolari dei recettori della membrana plasmatica. Questa tecnica sarà determinante per chiarire i meccanismi molecolari che regolano l'inserimento recettore alla membrana plasmatica.

Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

Questo video descrive TIRF, una tecnica basata sulla microscopia a riflessione interna totale per visualizzare le dinamiche di polimerizzazione dell'actina e dei microtubuli. Il metodo consente l'imaging ad alta risoluzione delle dinamiche di accoppiamento tra actina e microtubuli in tempo reale, che è essenziale per comprendere i crosstalk cellulari.

Microscopia TIRF per visualizzare la dinamica dell'accoppiamento di actina e microtubuli

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizzo di metodologie combinate per definire il ruolo del rilascio della membrana plasmatica durante la ramificazione degli assoni e la morfogenesi neuronale. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per la visualizzazione di eventi esocitici nei neuroni corticali. Un marcatore di proteina fluorescente verde (GFP) sensibile al pH emette fluorescenza dopo la fusione delle vescicole, con eccitazione...

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per la visualizzazione di eventi esocitici 

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Descriviamo una configurazione sperimentale per visualizzare con un'alta risoluzione senza precedenti la formazione e la chiusura di fagosomi in tre dimensioni in macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Consente il monitoraggio della base della coppa fagocitica, degli pseudopodi estensibili e del sito preciso della scissione fagosomiale.

&quot;Phagosome chiusura Assay&quot; per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Qui, presentiamo un protocollo per singola particella monitoraggio analisi delle immagini che permette la valutazione quantitativa dei coefficenti di diffusione, tipi di movimento e cluster di dimensioni delle singole particelle rilevate mediante microscopia a fluorescenza.

Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza

Presentiamo un protocollo per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza e della microscopia a riflessione totale interna-fluorescenza per l'imaging simultaneo di microtubuli dinamici e proteine associate a microtubuli marcati fluorescenti.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Questo protocollo è una guida per la visualizzazione dinamica di actina e microtubuli utilizzando un test di microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF) in vitro .

Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Scopri la microscopia TIRF per visualizzare la dinamica dei singoli invaginati rivestiti di clatrina nelle cellule viventi. Questo metodo consente di studiare l'endocitosi mediata da recettori accoppiati a proteine G.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF (Video) | JoVE Journal

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

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