Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e quantificare la dinamica dei singoli noccioli rivestiti di clatrina in cellule vive. Ciò si ottiene effettuando prima il sezionamento di proteine endocitiche e cargo marcate in fluorescenza in una linea cellulare di aderenza. Il passo successivo consiste nell'visualizzare le cellule con la microscopia a riflessione interna totale, a fluorescenza o a tappeto erboso.

La durata di vita di piccoli set di noccioli rivestiti di clatrina viene quindi quantificata manualmente utilizzando un programma di elaborazione e analisi delle immagini. Il passo finale consiste nel quantificare la durata dei noccioli rivestiti di clatrina mediante rilevamento e analisi automatizzati oggettivi. In definitiva, la microscopia del tappeto erboso viene utilizzata per quantificare la dinamica delle singole fosse rivestite di clatrina alla risoluzione di un singolo evento per studiare l'endocitosi mediata dalla clatrina dei recettori accoppiati a proteine G.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del traffico di membrana, come ad esempio come l'assemblaggio e la dinamica dell'endocitosi possono cambiare in base alle diverse proteine endocitiche e alle proteine cargo presenti. Per iniziare a trasfettare HEC 2 93 cellule con plasmidi che codificano per recettori accoppiati a proteine tag G o GPCR e/o componenti del macchinario Claro. In una piastra a 12 pozzetti, come descritto nel protocollo di testo, il giorno dopo la trasfezione, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS con un millimolare di EDTA a ciascuno.

Bene, quindi posizionare tre colpi sterili da 25 millimetri in pozzetti separati di un sei. Piastra a pozzetti Riempire ogni pozzetto con due millilitri di terreno. Spingere delicatamente il vetrino coprioggetto verso il basso fino al fondo del pozzetto per evitare che le cellule crescano sul lato inferiore del vetrino coprioggetti.

Quindi, agitare manualmente un pozzetto della piastra a 12 pozzetti per sollevare le celle dal fondo del pozzetto. Aggiungere un millilitro di DM EM con il 10% di FBS per inviare nuovamente. Quindi distribuire uniformemente le celle sollevate da un pozzetto tra i tre vetrini coprioggetti.

Lasciare che le cellule crescano sui vetrini coprioggetti per almeno 48 ore prima dell'imaging. Assicurarsi inoltre che le celle siano distribuite e piatte per l'imaging della fossa rivestita di clatrina e delle dinamiche del carico. Innanzitutto, pre-incubare le cellule con gli anticorpi come descritto nel protocollo di testo.

Quindi prepararsi a trasferire il vetrino coprioggetto in una camera di imaging per cellule vive utilizzando un paio di pinze e un ago calibro 25 piegato sulla punta in un gancio. Tieni il paio di pinze nella mano dominante. Tieni l'ago piegato nell'altro.

Ruotare l'ago fino a quando il gancio non si curva verso il basso verso il vetro. Trascinare delicatamente il gancio dell'ago con il lato rivolto verso il basso sul fondo di una piastra a sei pozzetti finché non si aggancia al vetrino coprioggetti. Fare attenzione a non graffiare la superficie del vetrino coprioggetti in quanto staccherà le celle.

Sollevare delicatamente il vetrino di copertura dal fondo del pozzo. Bilanciare il vetrino coprioggetti contro la parete del pozzo per il supporto. Utilizzare la pinza per afferrare vicino al bordo del vetrino coprioggetti e spostare il lato della cella del vetrino coprioggetti verso l'alto verso la camera di imaging.

Assemblare la camera e aggiungere 700 microlitri di terreno di imaging preriscaldato. Dopo aver trasferito la camera al microscopio, mettere a fuoco le cellule utilizzando un obiettivo a immersione in olio per tappeti erbosi che visualizza le cellule in modalità di illuminazione epi, fluorescente o confocale convenzionale per identificare le cellule che esprimono i costrutti appropriati come importante precauzione di sicurezza. Prestare sempre attenzione all'angolo del raggio laser e dirigerlo sempre lontano dall'osservatore.

Quindi, concentrati sulla superficie inferiore di una cellula che si esprime fino a quando il contorno della membrana plasmatica attorno alla cellula scompare e appare la superficie inferiore della cellula. Ciò è più evidente con una proteina cargo localizzata nella membrana plasmatica come il recettore degli oppioidi mu. Se si utilizzano gli stessi laser per l'imaging in epifluorescenza convenzionale, aumentare l'angolo di incidenza del laser fino a quando non si sfoca.

La fluorescenza all'interno della cellula scompare e non si vede alcun contorno della membrana plasmatica intorno alla cellula. Una volta nel tappeto erboso, assicurarsi che il laser di eccitazione si rifletta attraverso l'obiettivo e non sia visibile sopra l'obiettivo. Controllando se il punto laser è visibile, affina la messa a fuoco per ottenere un'immagine nitida.

Una volta identificate le cellule, acquisire immagini almeno ogni tre secondi per 10 minuti. Ripeti tutti i passaggi per visualizzare altre celle. Per iniziare l'analisi della dinamica endocitica, aprire il file nell'immagine J.Le immagini vengono memorizzate come un'unica pila di file TIFF.

Con canali interfogliari. Converti le immagini in hyper stack selezionando hyper stack di immagini e stack to hyper stack nella finestra pop-up. Inserire il numero di canali acquisiti.

Inseriscine uno per Zack e inserisci il numero di fotogrammi del filmato. Il formato hyper stack produce una finestra con due barre di scorrimento. Usa la barra superiore per spostarti tra i canali e la barra inferiore per spostarti nel tempo.

Scorrere fino al canale della proteina di cui verrà analizzata la durata. Spostati oltre il primo fotogramma del film per ridurre l'inclusione di pozzi rivestiti di clatrina preesistenti o CCP la cui intera durata non è visibile. Disegna una regione di interesse o ROI attorno a un punto scelto a caso.

Conta il numero di fotogrammi in cui un punto è visibile. Per iniziare l'analisi con il riconoscimento degli oggetti, aprire il file di immagine grezza nel software di analisi delle immagini emerso per impostazione predefinita. Viene visualizzata l'immagine a colori.

Utilizzare la finestra di regolazione dello schermo per regolare la luminosità di un canale. Fare clic sul nome di un canale per modificare il colore visualizzato. Deseleziona la casella accanto al canale per impedirne la visualizzazione.

Crea spot cliccando sull'icona con i punti arancioni. Seleziona una ROI intorno alla cella utilizzandola per escludere le aree che rileveranno in modo errato i bordi iniziali luminosi e le placche. Misurare il diametro di un punto per fornire stime iniziali per l'algoritmo.

Passa alla modalità fetta e fai clic sulle estremità polari di un punto per misurarne il diametro. Fallo per quattro o cinque macchie rotonde che sembrano indicative di un CCP al culmine della sua stabilità dopo la formazione prima della cessione, usa queste misurazioni per calcolare il diametro medio fino al 10° di micron più vicino. Per rilevare le macchie e tornare alla modalità superamento, selezionare il canale appropriato per il rilevamento.

Inserire il diametro medio misurato, solitamente 0,3 o 0,4 micron. Fare clic sulla freccia blu in avanti per quantificare le macchie. Filtra i punti in base alla qualità regolando il filtro per catturare il maggior numero possibile di punti senza sfondo.

Il filtro qualità è selezionato per impostazione predefinita. Utilizzare la curva di qualità come guida per impostare una soglia appropriata. Spostare la soglia inferiore del filtro con il tasto sinistro del mouse su questo primo avvallamento della curva.

Questo è un buon punto di partenza per il filtro. Poiché questa posizione di solito affina il rilevamento solo ai punti visibili. Rimuovi i punti arant nel punto di modifica Passa allo schermo per selezionare la modalità e fai clic sul punto Dopo che diventa giallo, fai clic su Elimina.

Quindi fare clic sulla freccia blu per continuare a creare l'algoritmo. Misura le tracce impostando le tracce su brownie in movimento. Il CCP non deve mostrare alcun movimento diretto, ma solo una minima deriva attraverso la membrana plasmatica.

Questo algoritmo è il più appropriato per quel movimento. Quindi, imposta la distanza massima su un valore piccolo, ad esempio 0,7 micron. L'impostazione di una piccola distanza riduce al minimo la connessione di punti adiacenti e consente comunque il tracciamento continuo di un punto cellulare attraverso il CCP o il movimento della cella.

Quindi imposta la dimensione massima dello spazio su uno. Ciò consente alla traccia di continuare se manca solo un fotogramma. In successione, le dimensioni degli spazi di più di tre causano il collegamento errato di tracce diverse.

Il prossimo passo è passare alla visualizzazione della traccia a coda di drago. Scorri il filmato osservando la qualità del rilevamento. Se vengono collegati punti adiacenti, ridurre la distanza massima al di sotto di 0,7 micron.

Se le macchie vengono spezzate troppo facilmente, aumentare la dimensione massima dello spazio. Fare clic sulla freccia blu per creare le tracce. Questo porta alla schermata della traccia del filtro per filtrare le tracce.

Usa un filtro di intensità per rimuovere ulteriori placche luminose. Quindi utilizzare un filtro di spostamento per rimuovere gli endosomi che entrano nel campo del tappeto erboso. Fai attenzione perché anche i punti più lunghi avranno uno spostamento maggiore.

Fare clic sulla doppia freccia verde per completare il protocollo. Per esportare i dati, vai alla scheda delle statistiche. Fare clic sull'icona del singolo floppy disk per esportare la statistica selezionata.

Fare clic sull'icona che assomiglia a una serie di floppy disk per esportare tutte le statistiche. Concentrandosi sulla membrana plasmatica aderente A e sulla modalità confocale si scopre una cellula piena di fluorescenza fioca. Al contrario, concentrandosi sul centro della cellula si scopre che la membrana plasmatica è un anello di fluorescenza attorno alla cellula.

La fluorescenza fuori fuoco diventa evidente quando si passa a epi, fluorescenza o tappeto erboso convenzionale con un'angolazione errata. Quando l'angolo del tappeto erboso è corretto, la membrana plasmatica è molto nitida, chiara e luminosa e fuori fuoco. La fluorescenza non interrompe più l'immagine.

Quando la beta arrestina si trova in un pool citosolico, c'è molto poco nel campo del tappeto erboso e appare nebuloso e focalizzato verso l'esterno. Una volta che il MOR viene attivato dall'agonista, beta, l'arrestina viene reclutata nella membrana plasmatica e sia la beta arrestina che il recettore si ridistribuiscono ai CCP. La durata di questi cluster viene quantificata manualmente.

Utilizzando i tre parametri per l'endocitosi completa, le macchie che denotano i CCP possono scomparire completamente, lampeggiare e spegnersi o pizzicare una struttura più grande. Qui è mostrato un CCP rilevato utilizzando una MAs Dopo aver filtrato per rimuovere le strutture di placca non dinamiche, le sfere bianche sovrapposte, denotano i punti rilevati, i punti più scuri che non potevano essere rilevati per tutta la loro vita sono stati esclusi anche con il filtro di qualità. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come visualizzare le singole fosse codificate con catetere utilizzando la microscopia per tappeto erboso.