Name: Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Scopri la microscopia TIRF per visualizzare la dinamica dei singoli invaginati rivestiti di clatrina nelle cellule viventi. Questo metodo consente di studiare l'endocitosi mediata da recettori accoppiati a proteine G.

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Gli autori desiderano ringraziare i dottori C. Szalinski, H. Teng e M. Bruchez per l'aiuto con Imaris, R. Vistein e D. Shiwarski per l'aiuto tecnico e i consigli, e il dottor M von Zastrow, il dottor T Kirchhausen, il dottor D Drubin e il dottor W Almers per i reagenti e l'utile discussione. I finanziamenti forniti dalla sovvenzione T32 NS007433 a SLB e NIH DA024698 e DA036086 a MAP.

<ol><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Design+for+the+Clathrin-+and+Actin-Mediated+Endocytosis+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery.</a> Cell. 123 (2), (2005).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biology. 9 (3), (2011).</li>
<li>Ungewickell, E., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+units+of+clathrin+coats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly units of clathrin coats.</a> Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).</li>
<li>Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-like+protein+encoded+by+the+Drosophila+shibire+gene+associated+with+vesicular+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic.</a> Nature. 351 (6325), (1991).</li>
<li>Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+self-assembles+into+rings+suggesting+a+mechanism+for+coated+vesicle+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding.</a> Nature. 374 (6518), (1995).</li>
<li>Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+Clathrin-Coated-Pit+Invagination%2C+Cortactin+Recruitment%2C+and+Membrane+Scission+Observed+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells.</a> Cell. 121 (4), 593-606 (2005).</li>
<li>Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SH3+domain+of+amphiphysin+binds+the+proline-rich+domain+of+dynamin+at+a+single+site+that+defines+a+new+SH3+binding+consensus+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence.</a> The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).</li>
<li>Tosoni, D., Puri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTP+Specifically+Regulates+the+Internalization+of+the+Transferrin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor.</a> Cell. 123 (5), 875-888 (2005).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+Regulates+Clathrin-Coated+Pit+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics.</a> Cell. 127 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+modes+for+cargo-mediated+control+of+clathrin-coated+pit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).</li>
<li>Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+endocytosis+by+phosphatidylinositol-3%2C4-bisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+accessory+proteins+are+functionally+distinguished+by+their+differential+effects+on+the+maturation+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).</li>
<li>Loerke, D., Mettlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+and+dynamin+regulate+clathrin-coated+pit+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation.</a> PLoS Biology. 7 (3), (2009).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+actin+and+dynamin+recruitment+during+invagination+of+single+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits.</a> Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).</li>
<li>Ehrlich, M., Boll, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+by+random+initiation+and+stabilization+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits.</a> Cell. 118 (5), 591-605 (2004).</li>
<li>Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+actin+cytoskeleton+functions+at+multiple+stages+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).</li>
<li>Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+clathrin+and+adaptor+proteins+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis.</a> American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).</li>
<li>Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li>
<li>Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Short+Polypeptide+Marker+Sequence+Useful+for+Recombinant+Protein+Identification+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Dynamics+of+Endocytic+Clathrin-Coated+Pits+and+Coated+Plaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques.</a> PLoS Biology. 7 (9), (2009).</li>
<li>Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-Mediated+Regulation+of+a+Rapid+Rab4-Dependent+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).</li>
<li>Batchelder, E. M., Yarar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+for+Clathrin-dependent+Endocytosis+at+Sites+of+Cell-Substrate+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Single+Endocytic+Events+Reveals+Diversity+in+Clathrin%2C+Dynamin+and+Vesicle+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics.</a> Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).</li>
<li>Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+low+signal-to-noise+images+link+dynamin+and+AP2+to+the+functions+of+an+endocytic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint.</a> Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).</li>
<li>Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+caveolae+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution of caveolae during mitosis.</a> J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).</li>
<li>Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+in+bacteria+and+archaea%3A+versatile+small+RNAs+for+adaptive+defense+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.</a> Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).</li>
<li>Boch, J., Scholze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Code+of+DNA+Binding+Specificity+of+TAL-Type%5BTitle%5D)+AND+%22III+Effectors.+Science%22%5BJournal%5D)">Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type.</a> III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui si descrive l&#39;uso di TIRFM per visualizzare clatrina-mediata endocitosi (CME), a livello di singole controparti centrali in cellule viventi in tempo reale. CME è un evento rapido e altamente dinamico mediato dall&#39;effetto cumulativo di molti spazialmente e temporalmente separati singoli eventi. La maggior parte dei test che sono attualmente utilizzati, come le misurazioni biochimiche di interiorizzazione con biotinilazione superficie o di legame ligando, citometria a flusso o cellule dosaggi fissi di misura q...

Il processo di endocitosi clatrina-mediata (CME) dipende l&#39;arrivo tempestivo delle tante componenti del macchinario endocitosi clatrina-mediata per raccogliere il carico e manipolare la membrana plasmatica in vescicole 1-3. CME è avviata da membrana deformazione e di carico-adattatore proteine ​​che si uniscono in siti nascenti di endocitosi 1. Queste proteine ​​reclutano la clatrina proteina di rivestimento, che assembla in una struttura a gabbia che forma la fossa clatrina rivestite (CCP) 4. Una volta che il PCC è completamente assemblato in una forma sferica, membrana scissione, soprattutto attraverso l&#39;azione del grande GTPasi, dynamin, genera vescicole libere clatrina rivestite (CCV) 5,6. Questa interiorizzazione innesca un rapido smontaggio del mantello clatrina, permettendo componenti di essere riutilizzati per più cicli di CME. La scoperta e la caratterizzazione delle proteine ​​coinvolte nella CME è stata radicata nella Bioch tradizionaleemical, e le tecniche di microscopia genetiche 4-6,8. Questi test hanno chiarito i ruoli e punti di interazione di questi componenti endocitiche. Anche se molto utile per definire i componenti essenziali di macchinari traffico, questi test sono molto limitati a catturare il comportamento dinamico dei componenti CME o concentrazione del carico. Questa è una limitazione fondamentale, dal momento che CME è guidato dalla assemblea coreografia di serie di moduli proteici in passi definiti, e dal momento che i piccoli cambiamenti nelle dinamiche dei singoli eventi endocitiche può avere grandi conseguenze cumulative di endocitosi. Inoltre, dati recenti indicano che le singole controparti centrali possono differire sia nella composizione e nel comportamento, suggerendo che la regolazione fisiologica di questo processo è altamente spazialmente e temporalmente vincolato 9-14. Visualizzare singoli eventi endocitiche, dunque, è essenziale per capire il motivo per cui ci sono più proteine ​​ridondanti coinvolte nel CME e b come queste proteine ​​possano essere controllatisegnali fisiologici y per regolare il carico internalizzazione. Qui si descrive l&#39;uso di Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) per osservare CME a livello della dinamica dei singoli CCP in cellule viventi. TIRFM si basa sulla differenza di indice di rifrazione tra il vetrino di vetro e l&#39;ambiente fluido di cellule 15,16. Quando la luce di eccitazione è diretto verso le cellule in oltre l&#39;angolo critico, si riflette internamente, creando un&#39;onda evanescente che mantiene un campo sottile di illuminazione che si estende a circa 100 nm sopra il vetrino. Questo assicura che solo le molecole fluorescenti all&#39;interno di questo ristretto campo sono entusiasti. In pratica, questo permette l&#39;eccitazione di molecole fluorescenti sopra o vicino alla membrana plasmatica, e riduce al minimo la fluorescenza dalle parti interne della cellula. Ciò fornisce un rapporto segnale-rumore e asse z risoluzione significativamente superiore per visualizzare gli eventi alla membrana plasmatica, compared a modi di trasporto più comunemente utilizzati, come epifluorescenza convenzionale o microscopia a fluorescenza confocale. Abbiamo anche descrivono, ad un livello introduttivo e pratico, l&#39;uso di un&#39;immagine piattaforma di analisi comunemente usato per analizzare e quantizzare semplici caratteristiche morfologiche e dinamiche dei singoli eventi cargo endocitiche.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Alto glucosio con L-glutammina e piruvato di sodio</td><td>Fisher Scientific.</td><td></td><td></td>SH3024301</tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio</td><td>Gibco, di Life Technologies</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Free Acid</td><td>Amresco</td><td>0322-500G</td><td></td></tr><tr><td>Gibco di siero fetale bovino</td><td>, di Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, senza rosso fenolo</td><td>Gibco, di Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco, di Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CellPURE di Fisher Scientific</td><td>BP2937-100</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>25 mm vetro di copertura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche trattate per colture cellulari Corning, 25 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One, di VWR</td><td>82050-896</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonale ANTI-FLAG M1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3040-5MG</td><td></td></tr><tr><td>[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetato sale (DAMGO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7384-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Kit</td> <td>di etichettatura delle proteineLife Technologies</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>BitPLane</td><td></td><td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris, per l'analisi</td></tr><tr><td>automatizzata Microscopio invertito Nikon Eclipse Ti e accessori necessari, tra cui cubi filtranti e filtri</td><td>Braccio Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon TIRF con adattatori necessari per Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>Per la regolazione dell'angolo di incidenza</td></tr><tr><td>iXon+ EMCCD fotocamera e adattatori</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione clathrin endocitosi mediata da g recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia tirf

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Molti importanti recettori di segnalazione vengono internalizzati attraverso il ben studiato processo di endocitosi mediata dalla clatrina (CME). I saggi biologici cellulari tradizionali, che misurano i cambiamenti globali nell'endocitosi, hanno identificato oltre 30 componenti noti che partecipano all'ECM e gli studi biochimici hanno generato una mappa di interazione di molti di questi componenti. Sta diventando sempre più chiaro, tuttavia, che l'ECM è un processo altamente dinamico la cui regolazione è complessa e delicata. In questo manoscritto, descriviamo l'uso della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare direttamente la dinamica dei componenti del macchinario endocitico mediato dalla clatrina, in tempo reale nelle cellule viventi, a livello di singoli eventi che mediano questo processo. Questo approccio è essenziale per chiarire i sottili cambiamenti che possono alterare l'endocitosi senza bloccarla globalmente, come si vede con la regolazione fisiologica. Ci concentreremo sull'utilizzo di questa tecnica per analizzare un'area di interesse emergente, il ruolo della composizione del carico nella modulazione della dinamica di distinte fosse rivestite di clatrina (CCP). Questo protocollo è compatibile con una varietà di sonde di fluorescenza ampiamente disponibili e può essere applicato alla visualizzazione della dinamica di molte molecole di carico che vengono internalizzate dalla superficie cellulare.

Utilizzando live-cella TIRF microscopia abbiamo registrato le dinamiche endocitiche del μ-oppioidi-recettore (MOR), un recettore accoppiati a proteine ​​G (GPCR) e la sua endocitica proteina adattatrice β-arrestina. Il costrutto β-arrestina stato trasfettate in una linea cellulare che esprime stabilmente MOR usando il protocollo descritto nella figura 1, e ripreso 96 ore dopo. Il MOR nella linea cellulare stabile è N-terminale contrassegnato con GFP sensibile al pH. Questa proteina fluorescente reagisce...

Endocitosi mediata dalla clatrina, un processo rapido e altamente dinamico, internalizza molte proteine, compresi i recettori di segnalazione. Il protocollo qui descritto visualizza direttamente la cinetica dei singoli eventi endocitici. Questo è essenziale per capire come i membri principali del macchinario endocitico si coordinano tra loro e come il carico proteico influenza questo processo.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e quantificare la dinamica dei singoli noccioli rivestiti di clatrina in cellule vive. Ciò si ottiene effettuando prima il sezionamento di proteine endocitiche e cargo marcate in fluorescenza in una linea cellulare di aderenza. Il passo successivo consiste nell'visualizzare le cellule con la microscopia a riflessione interna totale, a fluorescenza o a tappeto erboso.La durata di vita di piccoli set di noccioli rivestiti di clatrina viene quindi quantificata manualmente utilizzando un programma di elaborazione e analisi delle immagini. Il passo finale consiste nel quantificare la durata dei noccioli rivestiti di clatrina mediante rilevamento e analisi automatizzati oggettivi. In definitiva, la microscopia del tappeto erboso viene utilizzata per quantificare la dinamica delle singole fosse rivestite di clatrina alla risoluzione di un singolo evento per studiare l'endocitosi mediata dalla clatrina dei recettori accoppiati a proteine G.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del traffico di membrana, come ad esempio come l'assemblaggio e la dinamica dell'endocitosi possono cambiare in base alle diverse proteine endocitiche e alle proteine cargo presenti. Per iniziare a trasfettare HEC 2 93 cellule con plasmidi che codificano per recettori accoppiati a proteine tag G o GPCR e/o componenti del macchinario Claro. In una piastra a 12 pozzetti, come descritto nel protocollo di testo, il giorno dopo la trasfezione, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS con un millimolare di EDTA a ciascuno.Bene, quindi posizionare tre colpi sterili da 25 millimetri in pozzetti separati di un sei. Piastra a pozzetti Riempire ogni pozzetto con due millilitri di terreno. Spingere delicatamente il vetrino coprioggetto verso il basso fino al fondo del pozzetto per evitare che le cellule crescano sul lato inferiore del vetrino coprioggetti.Quindi, agitare manualmente un pozzetto della piastra a 12 pozzetti per sollevare le celle dal fondo del pozzetto. Aggiungere un millilitro di DM EM con il 10% di FBS per inviare nuovamente. Quindi distribuire uniformemente le celle sollevate da un pozzetto tra i tre vetrini coprioggetti.Lasciare che le cellule crescano sui vetrini coprioggetti per almeno 48 ore prima dell'imaging. Assicurarsi inoltre che le celle siano distribuite e piatte per l'imaging della fossa rivestita di clatrina e delle dinamiche del carico. Innanzitutto, pre-incubare le cellule con gli anticorpi come descritto nel protocollo di testo.Quindi prepararsi a trasferire il vetrino coprioggetto in una camera di imaging per cellule vive utilizzando un paio di pinze e un ago calibro 25 piegato sulla punta in un gancio. Tieni il paio di pinze nella mano dominante. Tieni l'ago piegato nell'altro.Ruotare l'ago fino a quando il gancio non si curva verso il basso verso il vetro. Trascinare delicatamente il gancio dell'ago con il lato rivolto verso il basso sul fondo di una piastra a sei pozzetti finché non si aggancia al vetrino coprioggetti. Fare attenzione a non graffiare la superficie del vetrino coprioggetti in quanto staccherà le celle.Sollevare delicatamente il vetrino di copertura dal fondo del pozzo. Bilanciare il vetrino coprioggetti contro la parete del pozzo per il supporto. Utilizzare la pinza per afferrare vicino al bordo del vetrino coprioggetti e spostare il lato della cella del vetrino coprioggetti verso l'alto verso la camera di imaging.Assemblare la camera e aggiungere 700 microlitri di terreno di imaging preriscaldato. Dopo aver trasferito la camera al microscopio, mettere a fuoco le cellule utilizzando un obiettivo a immersione in olio per tappeti erbosi che visualizza le cellule in modalità di illuminazione epi, fluorescente o confocale convenzionale per identificare le cellule che esprimono i costrutti appropriati come importante precauzione di sicurezza. Prestare sempre attenzione all'angolo del raggio laser e dirigerlo sempre lontano dall'osservatore.Quindi, concentrati sulla superficie inferiore di una cellula che si esprime fino a quando il contorno della membrana plasmatica attorno alla cellula scompare e appare la superficie inferiore della cellula. Ciò è più evidente con una proteina cargo localizzata nella membrana plasmatica come il recettore degli oppioidi mu. Se si utilizzano gli stessi laser per l'imaging in epifluorescenza convenzionale, aumentare l'angolo di incidenza del laser fino a quando non si sfoca.La fluorescenza all'interno della cellula scompare e non si vede alcun contorno della membrana plasmatica intorno alla cellula. Una volta nel tappeto erboso, assicurarsi che il laser di eccitazione si rifletta attraverso l'obiettivo e non sia visibile sopra l'obiettivo. Controllando se il punto laser è visibile, affina la messa a fuoco per ottenere un'immagine nitida.Una volta identificate le cellule, acquisire immagini almeno ogni tre secondi per 10 minuti. Ripeti tutti i passaggi per visualizzare altre celle. Per iniziare l'analisi della dinamica endocitica, aprire il file nell'immagine J.Le immagini vengono memorizzate come un'unica pila di file TIFF.Con canali interfogliari. Converti le immagini in hyper stack selezionando hyper stack di immagini e stack to hyper stack nella finestra pop-up. Inserire il numero di canali acquisiti.Inseriscine uno per Zack e inserisci il numero di fotogrammi del filmato. Il formato hyper stack produce una finestra con due barre di scorrimento. Usa la barra superiore per spostarti tra i canali e la barra inferiore per spostarti nel tempo.Scorrere fino al canale della proteina di cui verrà analizzata la durata. Spostati oltre il primo fotogramma del film per ridurre l'inclusione di pozzi rivestiti di clatrina preesistenti o CCP la cui intera durata non è visibile. Disegna una regione di interesse o ROI attorno a un punto scelto a caso.Conta il numero di fotogrammi in cui un punto è visibile. Per iniziare l'analisi con il riconoscimento degli oggetti, aprire il file di immagine grezza nel software di analisi delle immagini emerso per impostazione predefinita. Viene visualizzata l'immagine a colori.Utilizzare la finestra di regolazione dello schermo per regolare la luminosità di un canale. Fare clic sul nome di un canale per modificare il colore visualizzato. Deseleziona la casella accanto al canale per impedirne la visualizzazione.Crea spot cliccando sull'icona con i punti arancioni. Seleziona una ROI intorno alla cella utilizzandola per escludere le aree che rileveranno in modo errato i bordi iniziali luminosi e le placche. Misurare il diametro di un punto per fornire stime iniziali per l'algoritmo.Passa alla modalità fetta e fai clic sulle estremità polari di un punto per misurarne il diametro. Fallo per quattro o cinque macchie rotonde che sembrano indicative di un CCP al culmine della sua stabilità dopo la formazione prima della cessione, usa queste misurazioni per calcolare il diametro medio fino al 10° di micron più vicino. Per rilevare le macchie e tornare alla modalità superamento, selezionare il canale appropriato per il rilevamento.Inserire il diametro medio misurato, solitamente 0,3 o 0,4 micron. Fare clic sulla freccia blu in avanti per quantificare le macchie. Filtra i punti in base alla qualità regolando il filtro per catturare il maggior numero possibile di punti senza sfondo.Il filtro qualità è selezionato per impostazione predefinita. Utilizzare la curva di qualità come guida per impostare una soglia appropriata. Spostare la soglia inferiore del filtro con il tasto sinistro del mouse su questo primo avvallamento della curva.Questo è un buon punto di partenza per il filtro. Poiché questa posizione di solito affina il rilevamento solo ai punti visibili. Rimuovi i punti arant nel punto di modifica Passa allo schermo per selezionare la modalità e fai clic sul punto Dopo che diventa giallo, fai clic su Elimina.Quindi fare clic sulla freccia blu per continuare a creare l'algoritmo. Misura le tracce impostando le tracce su brownie in movimento. Il CCP non deve mostrare alcun movimento diretto, ma solo una minima deriva attraverso la membrana plasmatica.Questo algoritmo è il più appropriato per quel movimento. Quindi, imposta la distanza massima su un valore piccolo, ad esempio 0,7 micron. L'impostazione di una piccola distanza riduce al minimo la connessione di punti adiacenti e consente comunque il tracciamento continuo di un punto cellulare attraverso il CCP o il movimento della cella.Quindi imposta la dimensione massima dello spazio su uno. Ciò consente alla traccia di continuare se manca solo un fotogramma. In successione, le dimensioni degli spazi di più di tre causano il collegamento errato di tracce diverse.Il prossimo passo è passare alla visualizzazione della traccia a coda di drago. Scorri il filmato osservando la qualità del rilevamento. Se vengono collegati punti adiacenti, ridurre la distanza massima al di sotto di 0,7 micron.Se le macchie vengono spezzate troppo facilmente, aumentare la dimensione massima dello spazio. Fare clic sulla freccia blu per creare le tracce. Questo porta alla schermata della traccia del filtro per filtrare le tracce.Usa un filtro di intensità per rimuovere ulteriori placche luminose. Quindi utilizzare un filtro di spostamento per rimuovere gli endosomi che entrano nel campo del tappeto erboso. Fai attenzione perché anche i punti più lunghi avranno uno spostamento maggiore.Fare clic sulla doppia freccia verde per completare il protocollo. Per esportare i dati, vai alla scheda delle statistiche. Fare clic sull'icona del singolo floppy disk per esportare la statistica selezionata.Fare clic sull'icona che assomiglia a una serie di floppy disk per esportare tutte le statistiche. Concentrandosi sulla membrana plasmatica aderente A e sulla modalità confocale si scopre una cellula piena di fluorescenza fioca. Al contrario, concentrandosi sul centro della cellula si scopre che la membrana plasmatica è un anello di fluorescenza attorno alla cellula.La fluorescenza fuori fuoco diventa evidente quando si passa a epi, fluorescenza o tappeto erboso convenzionale con un'angolazione errata. Quando l'angolo del tappeto erboso è corretto, la membrana plasmatica è molto nitida, chiara e luminosa e fuori fuoco. La fluorescenza non interrompe più l'immagine.Quando la beta arrestina si trova in un pool citosolico, c'è molto poco nel campo del tappeto erboso e appare nebuloso e focalizzato verso l'esterno. Una volta che il MOR viene attivato dall'agonista, beta, l'arrestina viene reclutata nella membrana plasmatica e sia la beta arrestina che il recettore si ridistribuiscono ai CCP. La durata di questi cluster viene quantificata manualmente.Utilizzando i tre parametri per l'endocitosi completa, le macchie che denotano i CCP possono scomparire completamente, lampeggiare e spegnersi o pizzicare una struttura più grande. Qui è mostrato un CCP rilevato utilizzando una MAs Dopo aver filtrato per rimuovere le strutture di placca non dinamiche, le sfere bianche sovrapposte, denotano i punti rilevati, i punti più scuri che non potevano essere rilevati per tutta la loro vita sono stati esclusi anche con il filtro di qualità. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come visualizzare le singole fosse codificate con catetere utilizzando la microscopia per tappeto erboso.

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Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF (Video) | JoVE Journal

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