Name: Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Impara a quantificare l'instabilità genomica nei linfociti B di topo mediante PNA-FISH su spread metafasici. Questo protocollo consente di visualizzare i telomeri e rilevare aberrazioni cromosomiche per studiare i meccanismi di riparazione del DNA.

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Questo lavoro è sostenuto da NIH concedere R00 CA160574 (SFB) e da una borsa di studio del programma di formazione Biotecnologie Rutgers (a SMM).

Questa procedura è stata approvata dal Comitato di cura e l&#39;uso degli animali Istituzionale presso la Rutgers, l&#39;Università statale del New Jersey. I topi sono stati trattati in conformità con la guida NIH per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. Gli scienziati dovrebbero consultare i loro organizzazioni nazionali ed istituzionali animali per linee guida stabilite e approvate. Prima di iniziare, preparare le soluzioni elencate nella tabella 1. 1 B Isolamento cellulare e attivazione Euthanize un mouse utilizzando CO 2 seguita da dislocazione cervicale. Posizionare il mouse in modo che il lato sinistro del corpo è alto e spruzzare il mouse con etanolo al 70% fino a quando il pelo è umido. Sezionare la milza e posto in un piatto di coltura tissutale 35 mm con tampone di lavaggio 2 ml. In una cappa a flusso laminare, delicatamente rompere la milza nel piatto di coltura di tessuti utilizzando la parte piatta di una siringa da 5 ml. <ol><li> Inserire una rete di nylon di 70 micron in un 50Tubo ml e trasferire il campione milza in 2 ml tampone di lavaggio nella rete di nylon. Interrompere delicatamente la milza nella rete utilizzando la parte piatta della siringa. </li><li> Risciacquare retro della siringa e la placca 35 mm, con 8 ml di tampone di lavaggio e filtrata attraverso la maglia di nylon 70 micron. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di tampone di lisi ACK. Pipettare su e giù brevemente per interrompere grumi e incubare per 5 min. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet toccando il fondo della provetta poi pipettando in 1 ml di tampone di lavaggio. Aggiungere 50 ml di anti-CD43 MACS micro-perline e incubare in ghiaccio per 30 min. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio, mescolare delicatamente e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio, mescolare delicatamente e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Impostare unMini-MACS colonna posizionando una colonna sul magnete MACS. Posizionare un marcato tubo da 15 ml di sotto della colonna. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio alla colonna e lasciar correre attraverso il tubo da 15 ml. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio. Caricare il campione nella colonna dopo che il tampone di lavaggio è eseguito attraverso. </li><li> Dopo che il campione è percorrere la colonna, aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio per lavare la colonna. Aggiungere 7 ml di tampone di lavaggio direttamente al campione prelevato nella provetta da 15 ml. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Trasferire il volume richiesto di cellule necessarie per 5.000.000 cellule / pozzetto in una provetta da 50 ml. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Supplemento medio delle cellule B con LPS 1: 500 e IL4 1: 1.000. </li><li> Aspirare il surnatante e aggiungere il volume appropriato di supporto integrato delle cellule B necessaria per la concentrazione finale di 1.000.000 cellule / ml. </li><li> Cellule piastra in piastre da 6 pozzetti con 5 ml di cellule a 1.000.000 cellule / ml e posto in un umidifiEd coltura cellulare incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. </li></ol> 2 B Cella di fissaggio <ol><li> Aggiungere 50 ml di Colcemid al pozzo contenente 5 ml di cellule B (per una concentrazione finale di 100 ng / ml) e incubare 1 ora a 37 ° C. Preriscaldare soluzione KCl 75 mM in un bagno di 37 ° C Acque. Trasferire le cellule B ad una etichetta tubo 15 ml. Coprire l&#39;etichetta con nastro e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nella provetta e risospendere il pellet pipettando. Aggiungere 5 ml della preriscaldata KCl goccia a goccia, mentre toccando o pulsare in un vortice. </li><li> Aggiungere 10 ml di KCl e mescolare capovolgendo. Incubare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per 15 min. Aggiungere 5 gocce di fissativo fresco e mescolare capovolgendo. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nella provetta e risospendere pellet pipettando su e giù. </li><li> Aggiungere 5 ml di fissativo fresco goccia a goccia, mentre toccando o pulsante su un VORtex. Aggiungere altri 10 ml di fissativo e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante lasciando 1 ml in provetta e risospendere da pipettaggio. Aggiungere 14 ml di fissativo fresco e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Ripetere il punto 2.7 altre due volte. </li><li> Aggiungere 14 ml di fissativo fresco. Sigillare i tappi con Parafilm e conservare una notte a -20 ° C. </li></ol> 3 Preparazione di metafase spread cromosomi <ol><li> Impostare una camera ambientale regolata a 22,9 ° C e 52% di umidità. </li><li> Centrifugare le cellule B fissato a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare fissativo lasciando 70 microlitri nel tubo e risospendere da pipettaggio. </li><li> Posizionare i vetrini etichettati in camera umida con un angolo di 35 °. Goccia 35 ml di cellule B risospese su un vetrino e rilasciare due scivoli per campione. Lasciare i vetrini si asciughino in camera umida per 30 minuti poi memorizzare le diapositivein una scatola di diapositive a 37 ° C. </li></ol> 4. telomeri PNA FISH <ol><li> Preparazione della sonda <ol><li> Pre-caldo formammide deionizzata a 37 ° C. Mescolare 2 ml di sonda PNA telomeri con 7 microlitri formammide deionizzata preriscaldata e incubare a 37 ° C con agitazione per 1 ora. </li><li> Pre-caldo mix FISH maestro a 37 ° C. Aggiungere 7 ml di pre-riscaldato mix FISH maestro alla miscela dal punto 4.1.1 e incubare a 37 ° C per 1-3 ore. </li><li> Denaturare la miscela sonda per 8 minuti a 80 ° C. Pre-temprare la sonda per 1 ora a 37 ° C. </li></ol></li><li> Pretrattamento dei vetrini cromosomi <ol><li> Pre-riscaldare un barattolo di vetro scorrevole colorazione contenente 50 ml di HCl 0,01 M a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Collocare i vetrini in un altro vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente 2x SSC per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2 ml di pepsina magazzino al vetro pre-riscaldato slide-colorazione barattolo e mescolare capovolgendo. Trasferire i vetrini di questo vetro sljar ide-colorazione e incubare 90 sec a 37 ° C. </li><li> Lavare i vetrini 2x in un altro vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente 1x PBS per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente, agitando. Quindi lavare i vetrini per 5 min in PBS 1x / MgCl 2 a temperatura ambiente, agitando. </li><li> Trasferire i vetrini in un vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente appena preparato 1% di formaldeide / 1x PBS / MgCl 2 per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini per 5 min in un altro vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente 1x PBS a temperatura ambiente, agitando. </li><li> Preparare una serie di disidratazione di etanolo avendo in vetro separata vasetti di slide-colorazione contenenti il ​​70%, 90% e il 100% di etanolo. </li><li> Trasferire i vetrini per ogni barattolo per 3 min, iniziando con etanolo al 70%, quindi il 90% di etanolo, e poi il 100% di etanolo. Posizionare vasetti etanolo a -20 ° C una volta terminato. </li><li> Lasciare i vetrini all&#39;aria secca toccando eccesso di etanolo su un tovagliolo di carta e puntellare le diapositive con un angolo di 35 °. Una volta asciutto, mark un&#39;area 18 x 18 mm per ibridazione sul retro delle diapositive utilizzando una penna diamante. </li></ol></li><li> Denaturazione delle diapositive per FISH <ol><li> Applicare 120 microlitri formammide 70% deionizzata / 2X SSC a un coprioggetto 24 x 60 mm. Toccare la diapositiva per il coprioggetto. Denaturare il vetrino a 80 ° C su una piastra calda per 90 sec. </li><li> Far scorrere velocemente e con cura il vetrino e porre il vetrino in ghiaccio freddo etanolo al 70% per 3 minuti, seguito da 90% di etanolo, e il 100% di etanolo ciascuno per 3 min. Lasciare i vetrini all&#39;aria secca. </li><li> Preparare una camera umida allineando una scatola di plastica con un coperchio stretto e carta velina bagnata. La carta deve essere umido, ma non saturo d&#39;acqua. </li><li> In una camera umida, applicare la miscela pre-ricotto sonda dal passo 4.1.3 per l&#39;area contrassegnata sul vetrino, coprire con un coperchio 18 x 18 mm, antiscivolo e incubare a 37 ° C per 1 ora. </li></ol></li><li> Lavaggi post-incubazione <ol><li> Preriscaldare il 50% formammide / 2x SSC, SSC 1x, 4x e SSC / 0,1% Tween-20 in un 45 °; C bagnomaria. </li><li> Rimuovere con attenzione il coprioggetto e lavare i vetrini in pre-riscaldato 50% formammide / 2x SSC 3xfor 5 minuti ciascuna nel buio e agitando. Lavare i vetrini in pre-riscaldato 1x SSC 3xfor 5 minuti ciascuno, tremante. Infine, lavare i vetrini in pre-riscaldato 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor 5 minuti ciascuno. </li><li> Colorare i vetrini per 3 min in DAPI in una luce protetta vetrino-colorazione vaso. </li><li> Lavare i vetrini per 5 min in 2x SSC, tremante. Applicare 35 ml di mezzo di montaggio Mowiol, coprire con 24 x 60 mm coprioggetto e conservare le diapositive a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5 Analisi microscopica di cromosomi <ol><li> Analizzare le diapositive metafase utilizzando un microscopio a fluorescenza standard. Utilizzare una piattaforma di imaging con una fase automatizzata, ad esempio la piattaforma METASYSTEMS Metafer per ottenere migliori risultati. Per ogni spread metafase, raccogliere un&#39;immagine per DAPI fluorescenza di visualizzare cromosomi, e un&#39;immagine per il segnale fluorescente dal telomero probe. (Ad esempio, Cy3- altri fluors sono disponibili e funzionano altrettanto bene.) </li><li> Sovrapponete le immagini con un programma di analisi di immagine e analizzare. </li></ol>

<ol><li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li>
<li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells%2C+ageing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+IgH-TCRalpha%2Fdelta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).</li>
<li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li>
<li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+SS+%22Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%22">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH)</a>. Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).</li>
<li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li>
<li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi contrastanti.

Considerando che i linfociti B attivati ​​sono particolarmente adatti alla preparazione degli spread cromosomi mitotici, possono essere utilizzati anche altri tipi di cellule. Linfociti T condividere molti dei vantaggi delle cellule B, in quanto possono essere purificati dai nodi milza o linfonodi, e hanno un elevato indice mitotico, quando stimolato dalla crescita in terreno contenente mitogeni appropriate 8. Le cellule staminali embrionali (cellule ES) sono adatti anche per l&#39;analisi della metafase crom...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Il cancro è causato da un accumulo di mutazioni che interessano i geni che regolano la crescita delle cellule normali. La mutazione è una conseguenza di modifiche alla struttura e la sequenza del genoma causato da danni al DNA. Danno al DNA può avvenire attraverso una varietà di processi, compresi gli agenti esogeni come radiazioni ionizzanti, e come un sottoprodotto del normale metabolismo cellulare, come deaminazione spontanea di basi nucleotidiche o danni che si verificano per contatto con le specie reattive dell&#39;ossigeno 1. Anche se le cellule di mammifero in possesso di una serie di attività di riparazione che può invertire il danno del DNA o ripristinare la sequenza in siti rottura, le mutazioni si accumulano comunque per tutta la durata di una cella. Danno al DNA può contribuire inoltre alla senescenza e la perdita di efficacia delle cellule staminali, due processi che sono associati con la malattia associata all&#39;invecchiamento 2. Comprendere la riparazione dei danni al DNA è quindi di fondamentale importanza per affrontare due segnoquestioni ificant nella salute pubblica. Una crescente evidenza suggerisce che mammiferi percorsi di riparazione del DNA possono contribuire all&#39;evoluzione del genoma delle cellule di cancro 3,4, il che rende ancora più indispensabile per capire i processi coinvolti nella soppressione mutazione a livello molecolare. Visualizzazione diretta di aberrazioni cromosomiche è un potente e quantitativi mezzi per determinare il grado di instabilità genomica in un particolare tipo di cellula. Cromosomi abbreviato da cellule in metafase possono essere isolate e ispezionati utilizzando la luce o la microscopia a fluorescenza. Tali approcci citogenetiche sono stati in pratica per diversi decenni e può essere utilizzato per dimostrare l&#39;aspetto di traslocazioni o specifici tipi di aberrazioni cromosomiche associate alla perdita di attività di riparazione del DNA. Il protocollo si presta a diversi potenziali estensioni: i cromosomi possono essere etichettati con sonde per cariotipo spettrale (SKY) o multicolor fluorescente in situ ibridazione(MFISH) per identificare traslocazioni 5,6. Queste tecniche permettono anche la frequenza di traslocazioni cromosomiche e la struttura di traslocazioni cromosomiche complesse da determinare, che fornisce informazioni aggiuntive di là di quanto è possibile con questo protocollo. In alternativa, sonde sequenza-specifiche possono essere generati e utilizzati per testare la frequenza di rottura del DNA in siti genomici selezionati 7. In questo protocollo, si descrive la preparazione del cromosoma metafase diffonde da linfociti B. Un peptide acido nucleico (PNA) sonda fluorescenza marcata per le ripetizioni telomeriche viene utilizzato, che segna in modo efficiente telomeri in metafase cromosoma si diffonde Questo protocollo ha diversi vantaggi. Cellule B possono essere indotte a crescere ad alto indice mitotico in modo che gli spread di alta qualità possono essere prodotti in modo coerente. Cellule B da topi geneticamente modificati sono anche molto meno probabile che contengono mutazioni genetiche secondarie che possono confondere l&#39;analisi del contributodi geni specifici per l&#39;integrità genomica. L&#39;approccio PNA-FISH può essere completato in un giorno, e permette il punteggio più accurata delle rotture cromosomiche. Usando questo approccio, in particolare in combinazione con attrezzature specifiche descritte in questo protocollo, è possibile produrre molto consistenti, spread alta qualità e analizzare rapidamente la velocità e il tipo di instabilità genomica.

<table><tbody><tr><td>50% destrano solfato</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>Formamide deionizzata</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &mu; g)</td><td>Sigma</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA Telomere Probe</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) microsfere</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 Camera di essiccazione citogenetica</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti b mouse da pna-fish

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Riparazione del DNA difettoso porta ad una maggiore instabilità genomica, che è la causa principale delle mutazioni che portano alla tumorigenesi. Analisi della frequenza e il tipo di aberrazioni cromosomiche in diversi tipi cellulari permette difetti nei percorsi di riparazione del DNA da chiarire. Comprensione mammiferi riparazione del DNA biologia è stato molto aiutato dalla produzione di topi con ko in geni specifici. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l&#39;instabilità genomica nei linfociti B del mouse. Etichettatura dei telomeri con sonde PNA-FISH (peptide di acido nucleico - ibridazione fluorescente in situ) facilita l&#39;analisi rapida di instabilità genomica degli spread metafase cromosomiche. Cellule B hanno vantaggi specifici relativi ai fibroblasti, perché hanno ploidia normale e un indice mitotico superiore. Cultura a breve termine di cellule B consente quindi la misurazione precisa di instabilità genomica in una popolazione di cellule primarie, che rischia di avere mutazione genetica secondaria menos di quello che è tipicamente presenti nei fibroblasti trasformati o linee cellulari di pazienti.

Cromosomi in metafase derivati ​​da una cella dovrebbe formare un cluster discreto contenente 40 cromosomi (se si utilizza cellule di topo) (Figura 1A). Ogni cromosoma ha un centromero ad una estremità, che è visibile come una sfera azzurro. In cromosomi normali, due segnali telomeri sono visti alla fine dei cromatidi e due segnali di ciascun centromero. Nuclei in interfase saranno presenti sul vetrino pure. Questi saranno visibili come sfere blu, con segnali telomeri rosse, ma non cromosomi condensati ...

Percorsi di riparazione del DNA sono essenziali per il mantenimento dell&#39;integrità genomica e prevenire la mutazione e il cancro. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l&#39;instabilità genomica mediante l&#39;osservazione diretta di aberrazioni cromosomiche in metafase si diffonde dalle cellule B del mouse utilizzando ibridazione in situ fluorescente (FISH) per ripetizioni telomeriche del DNA.

Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare l'instabilità genomica nei linfociti B di topo. Ciò si ottiene isolando prima le cellule B per la coltura cellulare primaria. Successivamente, le cellule vengono fissate facilitando la preparazione delle diffusioni di metafase.Infine, viene eseguito il pesce PNA dei telomeri per la visualizzazione dei telomeri marcati in fluorescenza. In definitiva, il livello di vari tipi di aberrazioni cromosomiche può essere quantificato mediante microscopia a fluorescenza. Le implicazioni di questa tecnica possono ampliare la nostra comprensione delle vie di riparazione del DNA, in quanto può aiutare a identificare i geni che promuovono la stabilità genomica nei nostri modelli murini mirati.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle rotture cromosomiche e su altri grandi riarrangiamenti cromosomici, può anche essere adattato per misurare altre forme di instabilità genomica come le traslocazioni. Per isolare le cellule B, iniziare posizionando una milza appena isolata in una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri contenente due millilitri di tampone di lavaggio in una cappa a flusso laminare. Quindi utilizzare la par

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Immunologia e Infezioni

Questo articolo descrive la scelta di sonde adatte per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla diagnosi genetica pre-impianto (PGD) in ambito clinico.

FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

Chromosomics: Rilevamento delle alterazioni numeriche e strutturali in tutti i 24 cromosomi umani simultaneamente utilizzando un nuovo metodo di analisi FISH OctoChrome

I cromosomi possono essere isolate da cellule vive come linfociti o fibroblasti cutanei, e da organismi compresi gli esseri umani o topi. Queste preparazioni cromosomiche possono essere ulteriormente utilizzati per routine di G-banding e le procedure di citogenetica molecolare quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY).

Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette la rilevazione di acidi nucleici nel loro ambiente nativo all'interno delle cellule. Noi descriviamo qui un protocollo per la, rilevazione simultanea combinata di RNA e DNA mediante FISH, che può essere usato per studiare inattivazione del cromosoma X in cellule staminali embrionali di topo.

DNA-RNA combinato fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per studiare inattivazione del cromosoma X nelle cellule staminali embrionali di topo differenziata Femminile

Questo protocollo descrive le tecniche per la quantificazione e la caratterizzazione delle aberrazioni cromosomiche in vitro in RAW264.7 macrofagi di topo dopo il trattamento con particolato nell'aria ambiente.

L&#39;analisi del particolato ambientale indotto aberrazioni cromosomiche L&#39;utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; sistema

Il presente protocollo descrive l'utilità dell'ibridazione in situ a fluorescenza multipla (mFISH) e del cariotipo spettrale (SKY) nell'identificare aberrazioni stabili intercromosomiche nelle cellule del midollo osseo dei topi dopo l'esposizione all'irradiazione corporea totale.

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati

L'obiettivo di questa tecnica di squash del tubulo è quello di valutare velocemente le caratteristiche citologiche di sviluppare spermatociti di mouse, preservando l'integrità cellulare. Questo metodo consente lo studio di tutte le fasi della spermatogenesi e può essere facilmente implementato al fianco di altri approcci biologici biochimici e molecolari per lo studio di meiosi del mouse.

Una tecnica di Squash tubulo seminifero per l'analisi citologica della spermatogenesi utilizzando il modello di Mouse

Le creme nucleari sono uno strumento indispensabile per studiare gli eventi cromosomici durante la meiosi. Qui dimostriamo un metodo per preparare e visualizzare cromosomi meiotici durante la profase I dagli spermatociti del pesce zebra.

Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Qui viene presentato un saggio per quantificare l'ipermutazione somatica all'interno del locus genico a catena pesante dell'immunoglobulina usando cellule B centro germinali dalle macchie del peyer del topo.

Analisi dell'ipermutazione somatica nell'introne JH4 delle cellule del Centro Germinale B dalle patch di Mouse Peyer

L'errore nella segregazione cromosomica è una caratteristica comune negli ovociti. Pertanto, lo studio del punto di controllo dell'assemblaggio del fuso fornisce importanti indizi sui meccanismi necessari per produrre uova sane. Il presente protocollo descrive tre saggi complementari per valutare l'integrità del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti di topo.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Gli errori meiotici nelle sinapsi e nella ricombinazione sono comuni agli ovociti dei mammiferi. Un'analisi rigorosa delle proteine coinvolte in questi processi è essenziale per capire come e perché l'oogenesi spesso va male. Le tecniche qui presentate consentono un monitoraggio completo della ricombinazione e delle sinapsi per valutare la qualità degli ovociti nei topi.

Preparazione di diffusioni cromosomiche meiotiche da ovociti di topo per la valutazione della sinapsi e della ricombinazione

Impara a quantificare l'instabilità genomica nei linfociti B di topo mediante PNA-FISH su spread metafasici. Questo protocollo consente di visualizzare i telomeri e rilevare aberrazioni cromosomiche per studiare i meccanismi di riparazione del DNA.

Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

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