Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare l'instabilità genomica nei linfociti B di topo. Ciò si ottiene isolando prima le cellule B per la coltura cellulare primaria. Successivamente, le cellule vengono fissate facilitando la preparazione delle diffusioni di metafase.

Infine, viene eseguito il pesce PNA dei telomeri per la visualizzazione dei telomeri marcati in fluorescenza. In definitiva, il livello di vari tipi di aberrazioni cromosomiche può essere quantificato mediante microscopia a fluorescenza. Le implicazioni di questa tecnica possono ampliare la nostra comprensione delle vie di riparazione del DNA, in quanto può aiutare a identificare i geni che promuovono la stabilità genomica nei nostri modelli murini mirati.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle rotture cromosomiche e su altri grandi riarrangiamenti cromosomici, può anche essere adattato per misurare altre forme di instabilità genomica come le traslocazioni. Per isolare le cellule B, iniziare posizionando una milza appena isolata in una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri contenente due millilitri di tampone di lavaggio in una cappa a flusso laminare. Quindi utilizzare la parte posteriore dello stantuffo di una siringa da cinque millilitri per macerare delicatamente la milza.

Successivamente, filtrare l'impasto tissutale attraverso un colino a rete di nylon da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri utilizzando lo stantuffo per premere delicatamente i pezzi di tessuto più grandi attraverso il colino. Sciacquare la piastra e la siringa con otto millilitri di tampone di lavaggio e filtrare il lavaggio attraverso il colino. Quindi, dopo aver fatto girare le cellule, pipettare il pellet su e giù alcune volte in tre millilitri di un tampone di lisi CK.

Dopo cinque minuti, interrompere la reazione con 10 millilitri di tampone di lavaggio. Quindi, dopo aver fatto girare nuovamente le celle, picchiettare il fondo del tubo per risospendere il pellet e aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio alle celle. Successivamente, incubare le cellule con 50 microlitri di micro perle anti CD 43 max su ghiaccio.

Dopo 30 minuti, lavare delicatamente le cellule in 10 millilitri di tampone di lavaggio. Durante la centrifugazione, posizionare una colonna minimax sul magnete e un tubo conico da 15 millilitri etichettato sotto la colonna. Quindi aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio alla colonna, raccogliendo l'EIT nel tubo.

Risospendere il pellet di cella in un millilitro di tampone di lavaggio, quindi caricare le celle sulla colonna Dopo che il campione è stato analizzato, sciacquare la colonna con un millilitro di tampone di lavaggio e aggiungere sette millilitri di tampone di lavaggio direttamente al campione raccolto. Dopo aver contato le cellule raccolte, trasferirle in una provetta da 50 millilitri per la centrifugazione. Quindi, per attivare le cellule B, sospendere nuovamente il pellet in una volta 10 delle sei cellule per millilitro in un terreno di cellule B integrato e incubare le cellule in piastre a sei pozzetti a cinque millilitri di cellule per pozzetto in un incubatore per coltura cellulare umidificato a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per fissare le cellule B.

Successivamente a 50 microlitri di smid a ciascuno dei pozzetti. Dopo un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius, trasferire le cellule B in una provetta da 15 millilitri etichettata. Copri l'etichetta con del nastro adesivo e gira le celle.

Quindi aspirare tutto tranne un millilitro di surnatante e risospendere il pellet mediante pipettaggio. Aggiungi cinque millilitri di cloruro di potassio a 37 gradi Celsius, goccia a goccia mentre impulsi su un vortice. Quindi aggiungere altri 10 millilitri di cloruro di potassio e mescolare la soluzione cellulare per inversione.

Quindi, incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere quindi cinque gocce di fissativo fresco mescolando ancora una volta invertendo. Quindi centrifugare le cellule dopo aver sospeso il pellet in un millilitro di surnatante, aggiungere cinque millilitri di fissativo fresco, goccia a goccia pulsando su un vortice e incubare le cellule e altri 10 millilitri di fissativo a temperatura ambiente.

Dopo 30 minuti, pellettare le celle e rimuovere tutto tranne un millilitro di fissativo. Quindi, dopo aver lavato le celle, altre due volte in 15 millilitri di fissativo, sospendere nuovamente il pellet negli ultimi 70 microlitri del surnatante. Ora posiziona i vetrini etichettati con un angolo di 35 gradi in una camera di umidità impostata su 22,9 gradi Celsius e 52% di umidità.

Far cadere 35 microlitri di cellule B risospese su ciascun vetrino, preparando due vetrini per campione. Quindi, dopo aver lasciato asciugare i vetrini nella camera di umidità per 30 minuti, conservarli in una scatola per vetrini a 37 gradi Celsius fino a completa asciugatura. Una volta asciutto, utilizzare una penna a diamante per contrassegnare un'area di 18 x 18 millimetri per l'ibridazione sul retro di ogni vetrino per denaturare i vetrini per i pesci.

Quindi, applicare 120 microlitri di ammide in forma deionizzata al 70% su vetrini coprioggetti da 24 millimetri per 60 millimetri, quindi toccare ogni vetrino su un vetrino coprioggetti. Denaturare i vetrini su una piastra riscaldante a 80 gradi Celsius per 90 secondi, quindi sfilare rapidamente e con attenzione i vetrini coprioggetti e consecutivamente. Posizionare i vetrini in etanolo ghiacciato al 70, 90 e 100% ciascuno per tre minuti Dopo che i vetrini si sono asciugati, posizionare i vetrini in una camera umida e applicare la sonda pre-necessaria Mix sulle aree contrassegnate sui vetrini.

Coprire la miscela della sonda con un vetrino coprioggetti da 18 x 18 millimetri e incubare i vetrini a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi lavare i vetrini in due XSSC pre-avvertiti con agitazione. Dopo cinque minuti, applicare 35 microlitri di terreno di montaggio moyal sui vetrini.

Coprire il supporto con vetrini coprioggetti da 24 millimetri per 60 millimetri e conservare i vetrini a quattro gradi Celsius. Infine, analizzare i vetrini in metafase utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard. I cromosomi in metafase derivati da una cellula di topo dovrebbero formare un cluster discreto contenente 40 cromosomi.

Ogni cromosoma ha un centromero a un'estremità, vicino a due segnali telomeri, così come due segnali telomeri aggiuntivi all'altra estremità del cromosoma. Le rotture dei cromatidi sono rotture in uno dei due cromatidi fratelli che compongono ciascun cromosoma in metafase. In alcuni casi, l'estremità rotta del cromosoma può essere osservata come un frammento con segnali telomerici nella stessa diffusione di metafase.

I radiocromosomi sono riarrangiamenti complessi che coinvolgono due cromosomi. I cromosomi possono anche unirsi per formare cromosomi discentrici, che appaiono come fusioni end-to-end di cromosomi con centromeri ad entrambe le estremità. Le traslocazioni robertsoniane sono un tipo di traslocazione tra i centromeri di due cromosomi, che appaiono come quattro bracci di cromatico fratelli attaccati a un singolo centromero.

In quest'ultima immagine viene mostrata una metafase che non presenta segnali telomeri. L'assenza di segnali dei telomeri può verificarsi a causa di errori nella preparazione della sonda o di bolle d'aria sotto il vetrino coprioggetto durante l'ibridazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi del ciclo cellulare e le informazioni sul colon per rispondere a ulteriori domande, come se l'aumento dell'instabilità genomica influisca sulla vitalità cellulare.