Name: A Novel In vivo Tecnica Gene Transfer e In vitro test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Scopri una nuova tecnica di trasferimento genico in vivo per la differenziazione degli osteoclasti e i protocolli di coltura cellulare in vitro da cellule di midollo osseo di topo e PBMC umani.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La ricerca è stata in parte supportata dalle sovvenzioni di ricerca NIH R01 AR062173 e SHC 250862 all'IEA. ES è il destinatario della borsa di studio pre-dottorato NIH T32 CTSC.

1. Consegna idrodinamica di sRANKL MC DNA <ol><li> Consegna idrodinamica via Tail Vena del mouse <ol><li> Pesare il mouse prima dell&#39;iniezione coda vena. Diluire sRANKL o proteina fluorescente verde (GFP) MC in soluzione di Ringer (pre-riscaldare a 37 ° C) in un volume totale di circa 10% del peso corporeo del topo. </li><li> Riscaldare il topo in una gabbia per 10 min prima dell&#39;iniezione per dilatare i vasi sanguigni e rendere vene laterali (LV) visibili. Monitorare con attenzione il mouse per evitare la disidratazione e ipertermia. </li><li> Non appena i VL sono dilatati e visibili, trasferire il mouse per il limitatore e inserire la spina abbastanza lontano nel barile per frenare il movimento. Monitorare il mouse per il normale attività come la respirazione. Regolare la spina del dispositivo di immobilizzazione, se necessario. </li><li> Disinfettare la zona di iniezione 3/4 dalla punta della coda con un batuffolo imbevuto di alcool. Utilizzare un ago G 27-30 per l&#39;iniezione coda vena mouse. Tenere la coda saldamente con una mano e inserire l&#39;ago inla vena della coda. Applicare una pressione sulla siringa e completare l&#39;iniezione entro 5-7 sec. </li><li> Rimuovere l&#39;ago dalla vena della coda e applicare una pressione con un batuffolo di cotone sul sito di iniezione per fermare l&#39;emorragia. Monitorare il mouse per 15-30 minuti, quindi trasferire il mouse fino al vivaio una volta che il tasso di respirazione è ridotta al suo tasso normale. </li></ol></li><li> Conferma di espressione sistemica mouse sRANKL e quantificazione dei mouse Serum TRACP5b post Gene Transfer <ol><li> Riscaldare il topo in una gabbia per 5-10 minuti, al fine di dilatare i vasi sanguigni e rendere visibile LV. Monitorare con attenzione il mouse per evitare la disidratazione e ipertermia. </li><li> Fare una piccola incisione con una lama di coda del topo in un sito un quarto dalla punta della coda. </li><li> Raccogliere circa 100 ml di sangue in provette di siero di separazione. </li><li> Incubare le provette di siero di separazione a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 5 minuti e raccogliere il siero. Store siero in -80 ° C per ulteriori analisi. </li><li> Eseguire sRANKL ELISA e mouse dosaggio TRACP5b siero su campioni di siero utilizzando un kit commerciale disponibile. </li></ol></li></ol> 2. In vitro Osteoclasta generazione di mouse BMMs <ol><li> Isolamento e Coltura di BMMs <ol><li> Isolamento della tibia e femore ossa: Euthanize il mouse donatore con CO 2, e disinfettare le gambe con il 70% di etanolo. Sezionare dal pube all&#39;osso calcagno, per rimuovere femore e tibia ossa intatte. </li><li> Rimuovere la pelle ei muscoli attenzione senza danneggiare l&#39;osso. Posizionare femore e tibia trasformati in una capsula di Petri contenente tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Rimozione di midollo osseo: Tagliare la punta su un lato del femore e della tibia ossa e lavare il midollo osseo in una provetta da 50 ml con una siringa da 1 ml con un ago G 25, caricato con α-MEM contenente 1% di penicillina / streptomicina (osteoclasti cultura medio / OCM). </li><li&gt; Processo midollo osseo: Mescolare e trasferire sospensione midollo osseo in un tubo da 50 ml facendola passare attraverso un filtro 70 micron cella nylon. Centrifugare le cellule a 300 xg e risospendere in α-MEM contenente 1% di penicillina / streptomicina e 10% FBS (Osteoclasta colturale / OCM (+)). </li></ol></li><li> Cultura dei macrofagi <ol><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatico. </li><li> Piastra 1 x 10 6 cellule per bene per un 6-pozzetti o 3 x 10 5 cellule per vetrino (5 mm) o fette di dentina collocati in piastra a 96 pozzetti ed incubare a 37 ° C. </li><li> Aspirare tutti i supporti contenenti cellule non aderenti e Incubare le cellule a 37 ° C con OCM fresco (+) contenente topo 25 ng / ml M-CSF per 48 ore. </li><li> Aspirare tutti i media e incubare le cellule a 37 ° C con nuova OCM (+) supporti contenenti il ​​mouse 25 ng / ml M-CSF e 30 ng / ml il mouse sRANKL per avviare osteoclastogenesis. Rifornire i media ogni 3 giorni come richiesto. </li><li> Crescere celluleper circa 6-8 giorni per formare celle multi-nucleari giganti in grado di riassorbimento osseo. Non appena compaiono le cellule multinucleate, eseguire TRAP (fosfatasi acida tartrato resistente) colorazione utilizzando un kit commerciale disponibile, e quando è completamente maturato, eseguire test funzionali. Visualizza anelli di F-actina su vetrini con macchia phalloidin e immagine le cellule attaccate alla dentina fette da microscopia elettronica a scansione (SEM), come descritto in precedenza 19. </li></ol></li></ol> 3. In vitro Osteoclasta generazione da PBMC umano <ol><li> Isolamento di PBMC umano <ol><li> Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato Histopaque-1077 in una provetta da 50 ml. </li><li> Filtro leucociti vuoto ottenuto dalla banca del sangue con PBS sterile in una provetta da 50 ml (rapporto 1:1 di sangue con PBS). Strato il sangue diluito su tutto la soluzione HISTOPAQUE molto lentamente, facendo in modo che il sangue non si mescola con il HISTOPAQUE. </li><li> Centrifugare i campioni a 1000 xg per 20 min a 18 ° C. Seguireing centrifugazione, isolare attentamente il buffy bianco strato di rivestimento contenente i globuli bianchi e le trasferisce in un nuovo tubo da 50 ml. </li><li> Diluire le cellule con PBS e centrifugare di nuovo a 650 xg per 5 minuti per raccogliere le cellule. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in OCM (-) i media e contare le cellule utilizzando contatore di cellule. </li></ol></li><li> Placcatura e Coltura PBMC <ol><li> Risospendere le cellule in OCM (+) Media e piastra 8 x 10 6 cellule / ml per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti o 1 x 10 6 cellule / ml per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. Cellule piastra su vetrini (5 mm) come richiesto per l&#39;imaging immunofluorescenza nonché sulle fette di osso adatti per saggi di riassorbimento osseo come precedentemente descritto 20. </li><li> Cambia terreni di coltura, rifornire le cellule umane con M-CSF ogni 2-3 giorni o secondo necessità. Quindi procedere alla differenziazione passo il giorno 5 aggiungendo 30 ng / ml di sRANKL umana con 25 ng / ml M-CSF umano nella OCM (+) mezzi di avviare osteoclastogenesè. </li><li> Crescere cellule per circa 14 a 21 giorni per formare cellule multi-nucleari giganti. Non appena compaiono le cellule multinucleate, queste cellule possono quindi essere etichettati per TRAP, e quando è completamente maturato, test funzionali possono essere eseguiti. Anelli di F-actina possono essere visualizzati su vetrini con macchia falloidina. La morfologia cellulare può essere esaminato in cellule attaccate alla dentina fette mediante SEM. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+of+musculoskeletal+diseases%3A+impact+of+work+disability+and+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+rheumatology.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li>
<li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoclast%2C+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li>
<li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+%28sODF%29+exhibit+severe+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li>
<li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li>
<li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+tissue+international%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li>
<li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trabecular+bone+turnover%2C+bone+marrow+cell+development%2C+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li>
<li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+medicine%22%5BJournal%5D)">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li>
<li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+menopausal+transition%3A+analysis+of+LH%2C+FSH%2C+estradiol%2C+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li>
<li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li>
<li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenotropic%2C+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors%3A+dissociation+from+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li>
<li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li>
<li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li>
<li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+deficiency+and+bone+loss%3A+an+inflammatory+tale%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li>
<li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li>
<li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li>
<li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+%28ODF%29+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+researc.%2C+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).</li>
<li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis%2C+osteoporosis%2C+cancer%2C+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li>
<li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+osteoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li>
<li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+design%2C+development+and+therapy%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li>
<li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li>
<li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li>
<li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li>
<li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b%3A+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis%2C+osteoclast+formation%2C+and+maintenance+of+bone+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li>
<li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+reviews%22%5BJournal%5D)">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li>
<li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+%28RANK%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li>
<li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicin%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li>
<li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoclast+biology%3A+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li>
<li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Condizioni muscolo-scheletriche sono le cause principali di morbilità e di disabilità e sono composti da oltre 150 malattie e sindromi; che colpisce circa 90 milioni di americani oggi. L&#39;infiammazione articolare e la distruzione ossea sono caratteristiche predominanti di disturbi muscolo-scheletrici, tra cui l&#39;artrite e l&#39;osteoporosi. L&#39;osteoporosi è una condizione che indebolisce l&#39;integrità ossea, causando spesso fratture delle ossa. L&#39;artrite è una malattia cronica, debilitante malattia caratt...

Malattie muscolo-scheletriche colpiscono milioni di persone negli Stati Uniti e presentare gravi conseguenze per i sistemi sanitari nazionali e locali 1. Questi disturbi sono caratterizzati da perdita di osso e funzione articolare che richiedono un trattamento estensivo e lunghi periodi di recupero. Comunemente, un relativo aumento del numero e / o attività di osteoclasti, cellule specializzate a riassorbire osso, osteoporosi ed artrite si osserva 2. In condizioni fisiologiche il numero e l&#39;attività degli osteoclasti è regolata da attivatore del recettore del fattore nucleare κ-B ligando (RANKL), che è prodotto dagli osteoblasti. Osteoprotegerina (OPG), un recettore decoy per RANKL è anche prodotta dagli osteoblasti 3 In modelli animali in vivo che coinvolgono la sovraespressione sistemica di sRANKL, o la cancellazione di OPG sono molto prezioso nella ricerca sull&#39;osteoporosi.; Tuttavia, questi metodi richiedono la generazione di topi transgenici 4,5. Qui, una nuova alternativametodo di iperespressione sRANKL per lo studio dei disturbi muscoloscheletrici legati è descritto. In particolare, minicircle (MC) tecnologia del DNA e metodi di consegna idrodinamiche sono stati usati per conseguire trasferimento genico di sRANKL in vivo e iperespressione del mouse sRANKL sistemicamente 6. Questo metodo è anche complementare ad altri modelli in vivo di osteoporosi, come la modulazione ormonale degli osteoclasti seguenti ovariectomia 7 e intervento dietetico da basso contenuto di calcio dieta 8. Questi modelli sono molto utili per studiare diversi aspetti dei disturbi muscoloscheletrici legati tuttavia essi richiedono procedure chirurgiche e può richiedere fino a diversi mesi, ad un costo significativo 9. Ovariectomizzate (OVX) modello di roditore è un modello animale sperimentale in cui la rimozione delle ovaie porta alla mancanza di estrogeni mimando così postmenopausale umano 10. Umano post-menopausa osteoporosi, una condizione in cui gli estrogeni deficirenza porta ad un aumento del rischio di fratture ossee e l&#39;osteoporosi colpisce circa otto milioni di donne negli Stati Uniti da soli. Anche se il modello OVX è utile per l&#39;osteoporosi post-menopausale che offre vantaggi limitati a studiare l&#39;osteoporosi in generale. Estrogeni sopprime perdita ossea, inducendo osteoclasti e osteoblasti inibizione dell&#39;apoptosi, quindi in sua assenza un aumento dell&#39;attività degli osteoclasti si osserva 10-12. Un rapporto di squilibrio RANKL-OPG che favorisce riassorbimento osseo si osserva anche 13. Tuttavia, la carenza di estrogeni in vivo è accompagnato anche da una diminuzione dei livelli di fattore di crescita trasformante β (TGF β), aumento della interleuchina-7 (IL-7) e TNF, IL-1 e IL-6 14,15. Poiché queste citochine hanno conosciuto funzioni modulatori rimodellamento osseo indipendente dal percorso che RANKL, è impossibile attribuire qualsiasi osteoclasti esclusivamente all&#39;asse RANKL-RANK. Il modello descritto in questo documento consente ai ricercatori di studiare in vivo l&#39;asse RANKL-RANK in osteoclastogenesi e la perdita di osso senza citochine pro-infiammatorie rispetto ai modelli di roditori OVX. Inoltre, le tecniche osteoclastogenesi in vitro sono strumenti essenziali per studiare l&#39;attivazione degli osteoclasti per i potenziali trattamenti terapeutici delle malattie muscolo-scheletriche. Precedenti studi hanno inoltre dimostrato che la coltura di midollo osseo di topo macrofagi derivati ​​(BMMs) con il mouse macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) e il mouse sRANKL può portare a osteoclasti differenziazione 3,16,17. Qui sono descritti i protocolli per generare cellule osteoclasti come multinucleate da midollo osseo di topo e di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) in vitro 18. I saggi cellulari necessari per definire un maturo osteoclasti terminalmente differenziate e pienamente funzionale sono anche descritte brevemente. Queste tecniche in vitro completano il romanzo di approccio vivo e insieme fungono da pstrumenti investigativi owerful per studiare la differenziazione degli osteoclasti e l&#39;attivazione. L&#39;utilizzo di questi sistemi, gli scienziati sono in grado di generare osteoclasti in vivo e in vitro e definire gli stimoli e segnali necessari per la proliferazione e l&#39;attivazione e testare l&#39;efficacia di inibitori farmacologici e biologici.

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Umano M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Human RANK-Ligand -</td><td>solubile Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Mouse RANK-Ligand - solubile</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Resrain per topi</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Kit ELISA Quantikine&nbsp;</td><td>R& D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Kit leucocitario (TRAP)</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP assay&nbsp;</td><td>sistema immunodiagnostico</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vivo tecnica gene transfer e in vitro test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

La differenziazione e l'attivazione degli osteoclasti svolgono un ruolo chiave nello sviluppo delle malattie muscoloscheletriche poiché queste cellule sono principalmente coinvolte nel riassorbimento osseo. Gli osteoclasti possono essere generati in vitro da cellule precursori di monociti/macrofagi in presenza di alcune citochine, che promuovono la sopravvivenza e la differenziazione. Qui vengono dimostrate tecniche sia in vivo che in vitro, che consentono agli scienziati di studiare diversi contributi delle citochine alla differenziazione, alla segnalazione e all'attivazione degli osteoclasti. Il sistema di trasferimento genico minicircle DNA delivery fornisce un metodo alternativo per stabilire un modello correlato all'osteoporosi ed è particolarmente utile per studiare l'efficacia di vari inibitori farmacologici in vivo. Allo stesso modo, i protocolli di coltura in vitro per la produzione di osteoclasti da cellule precursori umane in presenza di citochine specifiche consentono agli scienziati di studiare l'osteoclastogenesi nelle cellule umane per applicazioni traslazionali. Combinate, queste tecniche hanno il potenziale per accelerare gli sforzi di scoperta di farmaci per terapie mirate specifiche per gli osteoclasti, che possono giovare a milioni di pazienti affetti da osteoporosi e artrite in tutto il mondo.

Qui, una tecnica di trasferimento nuovo gene per la differenziazione degli osteoclasti in vivo e protocolli di coltura cellulare per differenziare le cellule precursori in osteoclasti in vitro come metodo per studiare gli effetti di citochine sulla osteoclastogenesis sono descritti. In Figura 1, sono mostrati i risultati rappresentativi di successo trasferimento genico di GFP e mouse sRANKL MC nei topi. Nella figura 2, vengono mostrate le immagini rappresentative del m...

La differenziazione delle cellule precursori in osteoclasti è regolata da citochine e fattori di crescita. Qui vengono descritti una nuova tecnica di trasferimento genico per la differenziazione degli osteoclasti in vivo e protocolli di coltura cellulare per differenziare le cellule precursori in osteoclasti in vitro come metodo per studiare gli effetti delle citochine sull'osteoclastogenesi.

A Novel In vivo Tecnica Gene Transfer e In vitro test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

L'obiettivo generale è quello di riportare una nuova tecnica di trasferimento genico per il differenziamento degli osteoclasti in vivo. Descriviamo anche i protocolli di coltura cellulare per differenziare i macrofagi del midollo osseo di topo di pbmc umano in osteoclasti. Questo video sarà suddiviso in tre parti.Uno, consegna idrodinamica di mini cerchio di licheni di rango, DNA, due generazioni di osteoclasti in vitro da topo, macrofagi del midollo osseo e tre generazioni di osteoclasti in vitro da pbmc umano. Prima parte, consegna idrodinamica del mini cerchio di licheni di rango, DNA. L'animazione seguente mostra una breve panoramica della somministrazione idrodinamica tramite iniezione nella vena della coda del topo.Per prima cosa posizionare il mouse sotto una mappa di calore per 10 minuti prima dell'iniezione. Questo dilata i vasi sanguigni e rende più visibili le vene laterali. Quindi individuare il sito di iniezione e procedere con l'iniezione, assicurandosi di completare l'iniezione entro cinque-sette secondi.La prossima parte di questo video mostrerà un resoconto più dettagliato delle procedure coinvolte nel parto idrodinamico attraverso la vena della coda di topo. Raccogliere i materiali per un'iniezione. Riscaldare il topo in una gabbia per 10 minuti prima dell'iniezione.Monitorare attentamente il mouse per evitare disidratazione e ipotermia. Il riscaldamento del topo dilata i vasi sanguigni e rende più visibili le vene laterali. Una volta che le vene sono visibili, trasferisci il mouse su un sistema di ritenuta e inserisci uno stantuffo per limitare il movimento del mouse.Disinfettare il sito di iniezione con una salvietta imbevuta di alcol. Utilizzando un ago da 27 a 30 gauge per l'iniezione della coda di topo con ligando di rango diluito o mini cerchio GFP nella soluzione di suoneria Prewarm. Tenere saldamente la coda con una mano e inserire l'ago nella vena caudale .Applicare pressione sulla siringa e completare l'iniezione entro cinque-sette secondi. Successivamente, rimuovere l'ago dalla coda della vena e applicare pressione con il batuffolo di cotone sul sito di iniezione per fermare qualsiasi sanguinamento. Deve essere osservato un aumento della frequenza respiratoria dovuto al sangue diluito e le iniezioni devono essere riuscite a ripetersi.Monitorare le bocche per 15-30 minuti, quindi trasferirle nuovamente nel bario. Una volta che il topo cucina la normale frequenza respiratoria, la consegna genica idrodinamica utilizza la pressione idrodinamica generata da una rapida iniezione di fluido di grande volume in un vaso sanguigno per superare le barriere fisiche della membrana cellulare dell'endotelio che impedisce al DNA di entrare nelle cellule del parenchima. Le cellule del parenchima vengono trasfettate perché la vicinanza all'endotelio capillare consente l'accesso immediato al DNA.Una volta che la barriera endoteliale è stata interrotta. Seconda parte, generazione di osteoclasti in vitro da macrofagi del midollo osseo di topo, il primo passo consiste nel sacrificare le ossa isolate della tibia e del femore del topo. Sciacquare il midollo osseo utilizzando una siringa caricata con PBS, quindi contare le cellule e quindi piastrarle brevemente.Dopo l'eutanasia del topo donatore e la rimozione delle ossa del femore e della tibia, il midollo osseo viene lavato in una provetta da 50 millilitri. Utilizzando una siringa da un millilitro con un ago da 25 gauge caricato con PBS, mescolare e quindi trasferire la sospensione di midollo osseo in una nuova provetta da 50 millilitri facendola passare attraverso un colino cellulare di nylon. Dopo aver fatto passare la sospensione del midollo osseo attraverso un filtro cellulare di nylon, centrifugare le cellule e sospenderle in un terreno di coltura per osteoclasti, preparare una piastra a 96 pozzetti utilizzando fette di dentina da cinque millimetri.Allo stesso modo, è possibile preparare una piastra da 96 pozzetti utilizzando vetrini di vetro da cinque millimetri. Si noti la fetta di dentina a sinistra e il vetrino di copertura a destra utilizzando un emometro, un citometro o un contatore di cellule automatizzato, contare le cellule e quindi placcare 300.000 cellule in vetrini di copertura o fette di ammaccatura posizionate nella piastra a 96 pozzetti e incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius. Rimuovere tutti i terreni contenenti tutte le cellule non aderenti e aggiungere nuovi terreni di classe integrati con MCSF per 48 ore.Dopo 48 ore, rimuovere tutti i terreni e quindi aggiungere i terreni osteoclasti contenenti MCSF di topo e rango di topo per avviare l'osteoclastogenesi, rimuovere e reintegrare i terreni ogni tre giorni secondo necessità. Classe osteo matura definita dalla formazione di cellule trappola positive multinucleate. F formazione attiva e riassorbimento sulla dentina parte terza.In vitro anche generazione di classe da pbmc umano. Aggiungere 10 millilitri di prewarm histo pack in una provetta da 50 millilitri del filtro leucocitario ottenuto da una banca del sangue con PBS in una provetta da 50 millilitri. Quindi sovrapporre il sangue sulla soluzione dell'histo pack molto lentamente, assicurandosi che il sangue non si mescoli con la soluzione dell'histo pack.Si noti come il sangue viene stratificato sopra i campioni di centrifuga della soluzione histo pack a 2, 250 giri/min per 20 minuti a 18 gradi Celsius. Nota lo strato di Buffy coat al centro dei tre strati. Dopo la centrifugazione, isolare lo strato di buffy coat bianco contenente i globuli bianchi e trasferirlo in una nuova provetta da 50 millilitri.Quindi, dopo il completamento della fase, diluire le celle con PBS e centrifugare nuovamente a 1800 giri/min per cinque minuti per raccogliere le cellule. Dopo la centrifugazione, rimuovere il super nome. Risospendere le cellule nei terreni di coltura degli osteoclasti, mescolare e agitare insieme le cellule e i terreni.Contare le cellule con emo, citometro o contatore di cellule Preparare una piastra a 96 pozzetti con fette ammaccate o vetrini di copertura in vetro, come dimostrato in precedenza in questo video. Quindi piastra 1 milione di cellule per pozzetto su vetrini di copertura o fette ammaccate 24 ore dopo la placcatura. Aggiungere MCSF umano nei terreni di coltura.Cambiare i terreni di coltura, reintegrando le cellule con MCSF umano ogni due o tre giorni, se necessario. Quindi procedere alla fase di differenziazione aggiungendo un ligando di rango umano integrato con MCSF umano e terreni osteoclasti per avviare l'osteoclastogenesi, osteoclasti maturi definiti dalla formazione di cellule positive alla trappola multinucleata, formazione di anelli di actina F e risultati di riassorbimento sulla dentina. Qui descriviamo il nostro modello murino di osteoclastogenesi in vivo utilizzando la somministrazione idrodinamica del mini cerchio del ligando di rango solubile, il DNA, nonché la coltura e la differenziazione in vitro di cellule precursori.Agli osteoclasti. La prima figura mostra il successo del trasferimento genico di GFP e del mini cerchio del ligando di rango nei topi, la seconda figura mostra immagini rappresentative del midollo osseo di topo o delle colture di differenziazione delle cellule PBMC di cellule precursori di osteoclasti mediante microscopia in campo chiaro. La figura tre mostra immagini rappresentative di tre metodi indipendenti per la caratterizzazione dell'osteoclasta derivato dal midollo osseo di topo. Dimostriamo che la presenza di un ligando solubile attiva l'espressione e il rilascio della trappola di figura tre A e B, la formazione di anelli di actina F.Figura tre C e D.Mostriamo anche mediante microscopia elettronica a scansione che il lichene di rango solubile induce la formazione di pozzi di riassorbimento sulla dentina figura tre E e F.La figura quattro mostra gli stessi metodi di caratterizzazione su osteoclasti derivati da PBMC. Ancora una volta, la presenza di un ligando di rango solubile attiva l'espressione e il rilascio della trappola figura quattro A e B.La formazione di anelli di actina F Figura quattro C e D e ligando di rango solubile induce la formazione di pozzi di riassorbimento sulla dentina figura quattro E e F.Insieme queste tecniche formano potenti strumenti di ricerca per la differenziazione e l'attivazione della classe osteo. Utilizzando questi sistemi, siamo in grado di generare osteo class in vivo e in vitro e definire gli stimoli e i segnali necessari per la proliferazione e l'attivazione, nonché testare l'efficacia di inibitori farmacologici e biologici.

a-novel-vivo-gene-transfer-technique-vitro-cell-based-assays-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Un esame longitudinale di perdita ossea nel femore e la tibia di topi adulti è stata eseguita dopo un trauma al midollo spinale con sequenziale a basso dosaggio di raggi X scansioni. Perdita di massa ossea della tibia è stato rilevato nel corso dello studio, mentre la perdita ossea nel femore non è stata rilevata fino a 40 messaggi lesioni giorni.

La valutazione longitudinale di perdita dell&#39;arto posteriore ossea del mouse dopo la lesione del midollo spinale tramite Novel, In vivo, Metodologia

I modelli animali sono spesso utilizzati per studiare metastasi alle ossa. In questo protocollo si descrivono due metodi comuni di inoculo del tumore per gli studi di metastasi ossee e descrivere brevemente alcune delle analisi utilizzati per monitorare e quantificare questi modelli.

Modelli di metastasi ossee

La misurazione quantitativa della funzione progenitrici del midollo in guarigione della frattura richiede una tecnologia di imaging seriale ad alta risoluzione. Qui, sono ottenute utilizzando protocolli per microscopia intravitale e inseguimento osteo-lineage sequenzialmente immagine e quantificare la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali endogene osteogenico / progenitrici nel processo di riparazione di fratture ossee.

Sequenziale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

Combinato imaging ottico e μCT in un modello murino di infezione impianto ortopedico, utilizzando un ceppo ingegnerizzato bioluminescente di Staphylococcus aureus, purché la capacità di monitorare in maniera non invasiva e longitudinalmente la dinamica della infezione batterica, così come la risposta infiammatoria corrispondente e cambiamenti anatomici nel osso.

Combinato<em&gt; In vivo</em&gt; Optical e μCT Imaging Monitor per infezione, infiammazione, e Bone Anatomy in una infezione ortopedica impianto in topi

Il protocollo descrive un nuovo modello di camera a finestra del femore murino che può essere utilizzato per tracciare il movimento delle cellule nel midollo osseo femorale in vivo. La microscopia a fluorescenza multifotone intravitale viene utilizzata per visualizzare tre componenti del midollo osseo femorale (vascolarizzazione, matrice di collagene e neutrofili) nel tempo.

Femore finestra del modello Camera per<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino

Descriviamo un protocollo in vivo per misurare la dorsiflessione del piede in seguito alla stimolazione del nervo peroneo e alla contrazione del compartimento crurale anteriore dell'arto posteriore del ratto. Tali misurazioni sono uno strumento traslazionale indispensabile per valutare la patologia del muscolo scheletrico e gli approcci di ingegneria tissutale alla riparazione e alla rigenerazione muscolare.

applicazioni di<em&gt; In Vivo</em&gt; Test funzionale del Topo tibiale anteriore per la valutazione di ingegneria tessutale muscolo scheletrico di riparazione

Piccoli pesci da laboratorio sono diventati modelli popolari per la ricerca sulle ossa sui meccanismi alla base dei disturbi ossei umani e per lo screening di farmaci modulanti le ossa. In questo rapporto, descriviamo un protocollo per valutare l'effetto dell'alendronato sulle cellule ossee nelle larve di medaka con lesioni osteoporotiche.

Il trattamento di droga e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi

L'obiettivo del presente protocollo è quello di generare un modello di frattura di compressione vertebrale correlate all'osteoporosi del ratto nudo che possa essere valutati longitudinalmente in vivo utilizzando una semiautomatica microtomografia basati su tomografia quantitativa analisi strutturale.

Semiautomatica longitudinale basati su Microcomputed tomografia quantitativa analisi strutturale di un modello di relazione con l'osteoporosi fratture vertebrali del ratto nudo

Il protocollo proposto prevede un approccio globale per valutare la formazione ossea nel contesto della rigenerazione ossea utilizzando analisi multimodali. Ha lo scopo di fornire informazioni qualitative e quantitative sulla formazione di nuovo osso, migliorando il rigore e la validità delle indagini di base e precliniche.

Caratterizzazione completa della mineralizzazione tissutale in un modello ex vivo

Il modello di lesione del midollo osseo murino è uno strumento utile per studiare l'osteogenesi postnatale attraverso l'ossificazione intramembranosa. Questo protocollo chirurgico semplificato descrive la procedura di ablazione del midollo osseo per la valutazione a valle della formazione di nuovo osso e delle risposte cellulari dopo la lesione.

Metodologia migliorata per lo studio dell'osteogenesi postnatale tramite ossificazione intramembranosa in un modello di lesione del midollo osseo murino

Qui, presentiamo un approccio di terapia genica che somministra chitosano rivestito di ABE direttamente al midollo osseo mediante iniezione intraossea.

Miglioramento della consegna e dell'espressione genica mediante iniezione intraossea di plasmidi editor di base adenina incapsulati con nanoparticelle di chitosano

Scopri una nuova tecnica di trasferimento genico in vivo per la differenziazione degli osteoclasti e i protocolli di coltura cellulare in vitro da cellule di midollo osseo di topo e PBMC umani.

A Novel In vivo Tecnica Gene Transfer e In vitro test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici (Video) | JoVE Journal

A Novel In vivo Tecnica Gene Transfer e In vitro test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici

Esplora altri video