Name: Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per Ex Vivo La manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale Imaging in diretta di Sviluppo del villo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Scopri la coltura di organi interi dell'intestino fetale di topo per studiare lo sviluppo dei villi ex vivo. Questo metodo consente la modulazione delle vie di segnalazione e l'imaging tridimensionale in tempo reale.

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Ringraziamo la Dott.ssa Deborah L. Gumucio come nostra consulente e per il suo inestimabile supporto nella definizione della cultura e dei metodi di imaging. Ringraziamo anche il Dr. Jim Brodie, il Dr. Hong-Xiang Lu, la Dr. Charlotte Müstretta e la Dr. Ann Grosse per il loro contributo allo sviluppo dell'intero sistema di coltura degli organi intestinali. Utili discussioni sull'imaging hanno fornito ottimi consigli dal Dr. Chip Montrose, Michael Czerwinski e Sasha Meshinchi. Tutte le immagini sono state eseguite nel laboratorio di microscopia e analisi delle immagini dell'Università del Michigan. Il sostegno finanziario è stato fornito da NIH R01 DK065850.

NOTA: Tutti i topi sono stati trattati umanamente utilizzando protocolli approvati dalla University of Michigan Medical School Unità per la Medicina di Laboratorio animali e secondo le linee guida della Commissione di Ateneo per l&#39;uso e la cura degli animali. 1. intero sistema Cultura Organo <ol><li> Preparazione dei supporti e piastre di coltura <ol><li> In una cappa di coltura tissutale, rimuovere 5 ml di BGJb supporto dalla bottiglia stock e aggiungere 5 ml di Pen / Strep. Preparare uno stock di lavoro di media in un tubo conico da 50 ml, con l&#39;aggiunta di 1 ml di 5 mg / ml di acido ascorbico a 49 ml di BGJb media (con Pen / Strep). </li><li> Preparare una piastra di coltura ben 6 con l&#39;aggiunta di 1 ml di sotto ciascuna delle transwells. NOTA: Se non si utilizzano tutti i 6 transwells, spostare transwells in più in una sterile piatto 6 e fresco per un uso successivo. Aggiungere 3 ml di lavorare BGJb media per ciascuna delle tre piastre di Petri sterili 10 centimetri. </li></ol></li><li> Preparazione per la dissezione <ol><li> Immergere gli strumenti di dissezione nel 70% etanolo perNol ed essere sicuri di mantenere gli strumenti puliti durante il lavoro. </li><li> Impostare l&#39;area dissezione con un grande secchio di ghiaccio e posizionare la piastra di coltura ben 6 e 10 centimetri di Petri con BGJb multimediale su ghiaccio. Lavorare sul ghiaccio il più possibile mentre dissezione e preparare l&#39;intestino per la cultura. </li><li> Anestetizzare adulto topi femmina in una camera con isofluorane (100 ml) prima euthanization da dislocazione cervicale per la raccolta di intestino fetale. </li><li> Dopo la raccolta i feti dalla madre, in scena ogni feto con attenzione secondo la Theiler messa in scena tabella 13. Non fare affidamento nei giorni post-coito per determinare l&#39;età di ogni feto come variazioni fino a 24 ore in fase di sviluppo sono abitualmente osservati all&#39;interno di una singola cucciolata. </li></ol></li><li> Dissezione di intestini fetali <ol><li> Euthanize feti di decapitazione prima della rimozione di intestino. </li><li> Sezionare ogni intestino di 1x Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) e poi place in una piastra di Petri 10 centimetri con il lavoro BGJb media. </li><li> Rimuovere con cautela la milza dallo stomaco e il pancreas dallo stomaco e duodeno superiore. </li><li> Separare delicatamente il omento avendo cura di lasciare il omento divisoria per quanto possibile e separare connessioni solo sufficiente a permettere l&#39;intestino da raddrizzare. NOTA: Per intestini di età superiore a E14.5 o quelli in coltura più di 24 ore, separare delicatamente l&#39;intestino in 3 segmenti uguali per consentire contenuto luminale di fluire attraverso l&#39;intestino ed essere espulsi dalle estremità tagliate. Tuttavia, per le culture iniziato prima E13.5, attendere fino a dopo 24 ore di coltura prima di separare i tre segmenti di intestino per permettere la sierosa di crescere correttamente sulla lunghezza dell&#39;intestino. </li><li> Utilizzare una pipetta bocca per trasferire i pezzi intestinali sui transwells della piastra di coltura (1.1.2). </li><li> Riposizionare delicatamente l&#39;intestino, se necessario in modo che siano dritti alla transwell. NOTA: Una volta che gli intestini cominciano muoversi contenuto luminale attraverso il tubo, eventuali pieghe a livello intestinale causerà un backup e danni per l&#39;intestino. </li></ol></li><li> Cultura e trattamento <ol><li> Rimuovere il supporto da sotto il transwell, aggiungere 700 ml di mezzi di trattamento (dei media che lavorano con l&#39;aggiunta di proteine ​​ricombinanti o inibitori farmacologici) sotto il transwell. </li><li> Aggiungere 300 ml di supporti trattamento goccia a goccia sulla parte superiore dell&#39;intestino e lasciare in ammollo attraverso il transwell. Riposizionare l&#39;intestino, se necessario. </li><li> Cambiare mezzi trattamento almeno una volta al giorno o più spesso a seconda del tempo di dimezzamento del reagente trattamento. </li></ol></li><li> Preparazione di proteine ​​imbevuto agarosio perline per una fonte localizzata di reagente trattamento <ol><li> Risospendere le perline agarosio nel loro contenitore e trasferire 100 ml di perline agarosio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Riempire il volume rimanente del tubo con sterile 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) e mescolare le perle di lavarli. Collocare la provetta da microcentrifuga in un rack per alcuni minuti per consentire le perle di depositarsi sul fondo e poi pipettare fuori dalla PBS in cima alle perline. Riempire la provetta per microcentrifuga con 1x PBS sterile e ripetere il processo di lavaggio altre due volte. </li><li> Preparare la proteina di interesse a due volte la concentrazione desiderata per il trattamento. </li><li> Mescolare 5 ml di perline agarosio lavato con 5 ml di proteina magazzino 2x e agitare delicatamente le perline nella proteina. Porre la provetta in ghiaccio per 1 ora, mescolando delicatamente ogni 10-15 min. </li><li> Sciacquare le perline brevemente sterile 1x PBS prima di mettere le perline su intestini. </li></ol></li><li> Posizionamento di perline agarosio <ol><li> Posizionare delicatamente le perline agarosio sulla parte superiore dell&#39;intestino utilizzando una pipetta bocca con aghi capillari tirato. Posizionare le perle con estrema cautela in quanto un trasporto sicuro danneggia l&#39;intestino e prevenire lo sviluppo dei villi nella zona lesa. </li><li> Posizionare il doppio delle perle come sono necessari per l&#39;analisi in quanto l&#39;intestino saranno sottoposti a movimenti peristaltici e circa la metà delle perline poste rotolerà fuori degli intestini oltre il tempo di coltura. </li></ol></li><li> Fissazione di intestino in coltura <ol><li> Rimuovere con cautela il supporto di trattamento da sotto la transwell e permettere l&#39;intestino di aria secca per 3 min. </li><li> Aggiungere 1 ml di fissativo sotto la transwell per 2 minuti, quindi coprire la parte superiore dell&#39;intestino con 2 ml di fissativo per il resto del tempo di fissazione. Fissare con 4% paraformaldeide O / N a 4 ° C o per 2 ore a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 2 Imaging di Intestino fisse <ol><li> Immagini Wholemount <ol><li> Posizionare l&#39;intero intestino (con fluorescenza endogena) su un vetrino con 100 ml di 1x DPBS. Usare pinze per organizzare delicatamente l&#39;intestino. </li><li> Utilizzare un tessuto laboratorio per rimuovere con attenzione i DPBS e immediatamente aggiungere 100 ml di glicerolo 70% per rendere il mo tessutiri trasparente e aumentare la possibile profondità di imaging. NOTA: Se si desidera ulteriore penetrazione dell&#39;intestino, invece di montare l&#39;intestino in 70% glicerolo, immergere l&#39;intestino in poche gocce di soluzione di messa a fuoco libero per 10-30 min. Pipettare fuori la soluzione messa a fuoco chiara e montare l&#39;intestino con il Monte Chiaro. </li><li> Immergere ciascuno dei quattro angoli di un coprioggetto in creta e raccogliere una piccola quantità di argilla da utilizzare come distanziatori tra il vetrino e coprioggetto per mantenere il coprioggetto da appiattimento dell&#39;intestino. </li><li> Sigillare il coprioggetto sul vetrino con VALAP fusa applicato con un batuffolo di cotone. </li><li> Immagine l&#39;intestino su entrambi un microscopio confocale in posizione verticale o invertita. Si prega di fare riferimento alla discussione per ulteriori dettagli. </li></ol></li><li> Vibratome sezionamento di intestino fissi (per la vista in sezione trasversale di strutture intestinali) <ol><li> Intestini incorporare nel 7% di agarosio in piccoli stampi di plastica (10 x 10 x 15 mm) e consentire i blocchi di agarosio araffreddare e solidificare. </li><li> Rimuovere i blocchi di agarosio dagli stampi di plastica e blocchi di colla di agarosio alla fase di raccolta vibratome con colla istantanea. </li><li> Riempire la fase della raccolta con il freddo ghiaccio 1x DPBS. </li><li> Tagliare sezioni ad uno spessore compreso tra 100-150 micron. Per le sezioni più spesse utilizzano le soluzioni di compensazione (descritti nella sezione 2.1.2) per visualizzare più in profondità la sezione trasversale. </li><li> Versare vibratome sezioni dalla fase di raccolta in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti per la conservazione a 4 ° C. </li></ol></li><li> Immunofluorescenza colorazione dei tessuti, vibratome sezionati fissi <ol><li> Posizionare 5-12 sezioni vibratome per bene in un 24-pozzetti con 1x DPBS. </li><li> Rimuovere 1x DPBS e aggiungere 500 ml di soluzione di permeabilizzazione per pozzetto. Agitare delicatamente i campioni per 25 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo permeabilizzazione, lavare i campioni 3 volte con PBS 1x. </li><li> Bloccare i campioni per almeno 30 minuti in 500 ml di Blocking Solution. </li><li> Dopo il blocco, exchange la soluzione di saturazione con 500 ml di anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante e mantenere i campioni a 4 ° CO / N. NOTA: Le diluizioni degli anticorpi primari che funzionano bene su sezioni congelate e paraffina generalmente funzionano bene su vibratome sezioni troppo, ma gli anticorpi che richiede il recupero dell&#39;antigene nucleare in genere non funzionano bene con questo protocollo (ad esempio, BrdU). </li><li> Il giorno seguente, lavare i campioni 3 volte per 15 minuti ogni volta con soluzione bloccante. </li><li> Dopo il lavaggio, applicare 500 ml di anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante. Avvolgere la piastra di 24 pozzetti in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori dalla luce e rock i campioni per 45 minuti a 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i campioni 3 volte con PBS 1x per 15 minuti ciascuno e montare le sezioni vibratome su vetrini come descritto nella Sezione 2.4. </li></ol></li><li> Montaggio vibratome sezioni <ol><li> Preparare i vetrini per vibratome il montaggio tagliando fette sottili di double-stinastro ck e metterli lungo i lati lunghi delle diapositive. </li><li> Posizionare con cura 5-10 sezioni vibratome tra il nastro biadesivo sulle diapositive in una goccia di 100 microlitri di PBS 1x. </li><li> Aprire tutte le sezioni e diffondere fuori in un unico livello in tutta la diapositiva. </li><li> Rimuovere eventuali agarosio eccesso o pezzi irregolari che potrebbero impedire un coprioggetto da seduta piatta. </li><li> Utilizzare con cautela un tessuto laboratorio per assorbire l&#39;eccesso di PBS 1x attorno alle sezioni vibratome. </li><li> Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio acquoso sulla cima delle sezioni vibratome e poi coprioggetto. </li><li> Sigillare i coprioggetti sui vetrini con fuso VALAP applicato con un batuffolo di cotone. </li><li> Immagine sezioni vibratome su entrambi un microscopio confocale diritta o capovolta. Si prega di fare riferimento alla discussione per ulteriori dettagli sulla selezione di un sistema di imaging. </li></ol></li></ol> 3 Immagini dal vivo di Intestino interi Intestino raccolte da fetuses dopo E12.5, con l&#39;omento collegato lasciato intatto, sviluppare con successo villi in coltura utilizzando il sistema di cui sopra. Pertanto, questo sistema ex vivo permette la cattura di immagini z-sezione live dell&#39;intestino sviluppo che possono essere ricostruite per una vista tridimensionale della morfogenesi nel tempo. <ol><li> Impostazione di immagini dal vivo <ol><li> Utilizzare colla istantanea di aderire una membrana di policarbonato individuo a uno schermo a maglia fine. Questo fornisce un&#39;impalcatura di sostegno per tenere l&#39;intestino in posizione sotto la lente immersione del microscopio confocale montante. Si prega di consultare la sezione di discussione per ulteriori dettagli sulla selezione di microscopi di imaging dal vivo. </li><li> Posizionare lo schermo a rete al centro e di una piastra di coltura. </li><li> Posizionare l&#39;intestino sezionato sulla membrana di policarbonato e aggiungere una goccia di colla istantanea alle due estremità. Utilizzare solo abbastanza colla per apporre l&#39;intestino, ma non ricoprirlo! </li><li> Aggiungi terreni di coltura privo di fenolo rosso sotto il policarbonatomembrana nel centro pozzetto della piastra di coltura. </li><li> Aggiungere acqua al bordo esterno della piastra di coltura per fornire umidità. </li><li> Dal momento che l&#39;intestino fetale subisce onde peristaltiche simili di contrazione nella cultura, aggiungere 100 ml di una soluzione 1: 5 di xilazina in 1x PBS a 3 ml di media per controllare il movimento dell&#39;intestino durante l&#39;imaging. Questo dosaggio controllerà i movimenti intestinali per circa 8-10 ore senza compromettere lo sviluppo dei villi. </li><li> Per una vista trasversale dell&#39;intestino, incorporare gli intestini vivi in ​​una soluzione di agarosio 3-4% e tagliare sezioni spesse (150-500 micron) su un vibratome. Abbinare la rigidità del agarosio con la rigidità dell&#39;intestino essere tagliati ed empiricamente determinata fase di sviluppo. In generale, una soluzione di agarosio al 3% funziona bene per l&#39;intestino di età inferiore E14.5 e una soluzione al 4% funziona bene per l&#39;intestino E15-E16. </li><li> Incollare le sezioni vibratome ad una membrana di policarbonato, apposto su un schermo di maglia (come al punto 3.1.1) ecultura come descritto nella sezione 3.1.2-3.1.6. </li><li> Condurre l&#39;imaging dal vivo utilizzando un microscopio confocale a due fotoni (laser di eccitazione tra 690-1,040 nm) su un supporto verticale con un tavolo sintonizzabile. </li><li> Laser a due fotoni sintonizzato a 900 nm fornisce penetrazione profonda con la migliore risoluzione per i segnali GFP. Riduce i danni ai tessuti durante l&#39;imaging. Inoltre, impostando la potenza del laser per l&#39;emissione più bassa riduce il danno tissutale. Tipicamente per ottenere una buona eccitazione di GFP, utilizzare potenza 12% sul laser a due fotoni. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno conflitti finanziari da rivelare.

La natura dinamica e le interazioni complesse dei tessuti dell&#39;intestino in via di sviluppo richiede la visualizzazione 3D per avere una comprensione completa di questi eventi morfogenetici. Con la continua evoluzione tecnologia di imaging, la capacità di esaminare villi morfogenesi in dettaglio si sta sviluppando / miglioramento e con esso, la comprensione della comunicazione spaziale e l&#39;interazione durante l&#39;organogenesi è notevolmente migliorata. Metodi di coltura intestini i...

Ogni villo intestinale è composto da due principali compartimenti tissutali: uno strato superficiale epiteliale e un nucleo mesenchimale. L'intestino tenue del topo si forma al giorno 10 dell'embrione quando un foglio di endoderma si chiude e si sigilla per formare un tubo di epitelio circondato da cellule mesenchimali3. Questo tubo piatto di epitelio subisce una rapida proliferazione, crescendo sia in lunghezza che in circonferenza e subisce drammatici riarrangiamenti che comportano cambiamenti dinamici della forma cellulare1. Allo stesso tempo, il mesenchima circostante subisce anche molti processi di sviluppo tra cui la formazione del plesso vascolare, la differenziazione della muscolatura liscia e il reclutamento di neuroni enterici4. Nell'intestino tenue prossimale al giorno embrionale 14,5, iniziano a formarsi condensazioni (cluster) di cellule responsive a Hedgehog e PDGF adiacenti all'epitelio2,5. La formazione di cluster mesenchimali continua a diffondersi lungo la lunghezza dell'intestino in modo da coprire l'intero intestino tenue entro il giorno embrionale 16.52. Quando si formano i cluster mesenchimali, le cellule epiteliali più vicine ai cluster iniziano a ritirarsi dal ciclo cellulare, mentre le altre cellule epiteliali continuano a proliferare. Quelle cellule direttamente sopra il cluster mesenchimale che si sono ritirate dal ciclo cellulare iniziano a cambiare forma quando i villi emergenti si piegano nel lume. L'ulteriore crescita dei villi è guidata in parte dalla continua proliferazione dell'epitelio tra i villi emergenti. I cluster mesenchimali rimangono strettamente aderenti all'epitelio dei villi in crescita e continuano ad esprimere una varietà di molecole di segnalazione. L'ondata di emergenza dei villi si propaga lungo la lunghezza dell'intestino tenue in seguito alla formazione di ammassi mesenchimali. Man mano che l'intestino continua a crescere e la regione dell'interviglio si estende tra i villi emergenti, si formano nuovi cluster mesenchimali adiacenti all'epitelio intervigliare e ne conseguono ulteriori cicli di emersione e crescita dei villi6.
Lo sviluppo sincronizzato dell'epitelio e del mesenchima è essenziale per la morfogenesi dei villi. Le molecole di segnalazione vengono secrete da uno strato all'altro dove i recettori ricevono e trasducono il messaggio di segnale al fine di coordinare lo sviluppo tra l'epitelio e il mesenchima. I cluster mesenchimali fungono da centri di segnalazione ed esprimono una varietà di morfogeni dello sviluppo7-10. L'interruzione della formazione o del pattern dei cluster provoca la perdita dell'emergenza e del pattern dei villi. L'inibizione della segnalazione PDGF si traduce in un minor numero di cluster e meno villi e quei villi che si formano sono deformi a seguito dei cluster anomali11. La perdita del segnale di Hedgehog provoca la completa perdita della formazione di grappoli e il fallimento dell'emergenza dei villi2,12. Insieme, questi dati dimostrano che i cluster coordinano lo sviluppo dell'epitelio dei villi con il suo nucleo mesenchimale.
Utilizzando questo intero sistema di coltura di organi, siamo in grado di alterare la segnalazione coinvolta nel cross-talk a grappolo epitelio-mesenchimale per determinare il ruolo di tali segnali nella morfogenesi dei villi. Il sezionamento ottico confocale a due fotoni e la ricostruzione offrono la possibilità di visualizzare la formazione degli ammassi e l'emergere dei villi in tre dimensioni e di comprendere meglio le relazioni spaziali tra gli ammassi mesenchimali e il loro epitelio sovrastante. Estendendo il sistema di coltura a quattro dimensioni, possiamo catturare z-stack di cluster e villi in via di sviluppo nel tempo e osservare queste interazioni. In definitiva, la capacità di seguire lo sviluppo dei villi in questo modo e osservare i cambiamenti che si verificano con la segnalazione alterata rivoluzionerà la comprensione delle interazioni mesenchimali epiteliali nella morfogenesi dei villi.

<table><tbody><tr><td>Pinze da dissezione fine&nbsp;</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>&nbsp; 11254-20</td><td>2 paia</td></tr> di <tr><td>etanolo</td><td></td><td></td><td></td>al 70%</tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco sterile (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td>Piastre da 500 ml</td></tr><tr><td>a 6 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 60 x 15 mm</td><td>Falco</td><td> </td><td></td>451007</tr><tr><td>Piastre Transwell, inserti da 24 mm, membrane in policarbonato da 8,0 mm</td><td>Corning Costar&nbsp;</td><td>3428</td><td>6 inserti per piastra</td></tr><tr><td>BGJb media</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>PenStrep (10.000 U/ml Penicillina; 10.000 mg/ml di streptomicina)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 15140</td><td></td></tr><tr><td>Acido Ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td>fare 5 mg/ml di stoccare, filtrare, aliquotare e conservare a -20 gradi C</td></tr><tr><td>Pipetta per bocca (gruppo tubo aspiratore Drummond 1-15 pollici)</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; 21-180-10</td><td>Rimuovere il gruppo aspiratore e sostituirlo con un 1.000 &micro; l. puntale della pipetta che funge da adattatore per collegare una pipetta Pasteur in vetro da 6 pollici.</td></tr><tr>Pipette <td></td><td></td><td></td><td>pasteur in vetro da 6 pollici</td></tr><tr><td>Tubi capillari</td><td>Strumenti di precisione del mondo&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>tirare agli aghi</td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide</td><td></td><td></td><td>realizzato in 1 x PBS, pH a 7,3</td></tr><tr><td>Piastre di coltura</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353037</tr><tr><td>Schermo in acciaio inossidabile a maglia fine</td><td>acquisto presso ferramenta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrane in policarbonato</td><td>Thomas scientific&nbsp;</td><td>4663H25</td><td>in alternativa, tagliare le membrane Corning Costar 3428 dai supporti transwell</td></tr><tr><td>Acquisto istantaneo di colla</td><td>presso il negozio di ferramenta</td><td>a base di gel preferibilmente</td><td></td></tr><tr><td>piastre da 35 x 10 mm</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>7% agarosio</td><td>Sigma</td><td> A9414</td><td>preparare w / v in 1x DPBS, riscaldamento per sciogliere in un bagno d'acqua</td></tr><tr><td>minutien pins</td><td>Strumenti di scienza fine&nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Terreni privi di rosso fenolo (DMEM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (100 mg/ml)</td><td>AnaSed&nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>matrice di membrana basale, fattore di crescita ridotto, fenolo rosso libero</td></tr><tr><td>3-4% agarosio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9414</td><td>preparare w/v in 1x DPBS, riscaldamento per sciogliere in un bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Imaging di intestini</td><td></td><td></td><td></td>fissi</tr><tr><td>Nome del materiale/attrezzatura</td><td></td><td>Azienda Numero di catalogo</td><td>Commenti/Descrizione</td></tr><tr><td>acquisto di vaselina</td><td>in farmacia</td><td></td><td>utilizzato per fare VALAP: parti uguali di vaselina, lanolina, lanolina di paraffina</td></tr><tr><td></td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L7387</td><td>utilizzato per produrre VALAP: parti uguali di vaselina, lanolina, paraffina</td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>utilizzato per produrre VALAP: parti uguali di vaselina, lanolina, paraffina</td></tr><tr><td>70% glicerolo in 1 x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focus clear e Mount Clear</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&nbsp; F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Argilla da modellare</td><td>acquisto presso il negozio</td><td></td><td></td>di forniture d'arte</tr><tr><td>nastro biadesivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>applicatore di cotone tamponi stampi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>in plastica, 10 mm x 10 mm x 5 mm)</td><td>Tessuto Tek&nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>vetrini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>coprioggetti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>salvietta da laboratorio</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>salvietta delicata senza lanugine</td></tr><tr><td>Theiler tabella di stadiazione</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf</a></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Leica SP5X&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Utilizzato per condurre l'imaging dal vivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Supporto Leica DMI 6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Utilizzato per condurre l'imaging dal vivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio acquoso (Prolong Gold)</td><td>Sonde molecolari&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Nome del materiale/attrezzatura</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Commenti/Descrizione</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Costar</td><td>&nbsp; 3524</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td>utilizzato per produrre la soluzione di permeabilizzazione: 0,5% Triton X-100 in 1 x PBS</td></tr><tr><td>Siero</td><td></td><td></td> di capra <td>utilizzato per produrre la soluzione bloccante: 4% siero di capra, 0,1% Tween20 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse fetale whole intestino sistema cultura per ex vivo la manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale imaging in diretta di sviluppo del villo

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

La maggior parte dei processi morfogenetici nell&#39;intestino fetale sono stati dedotto dalle sezioni sottili di tessuti fissati, fornendo istantanee di cambiamenti nel corso stadi di sviluppo. Informazioni tridimensionale da sezioni seriali sottili può essere difficile da interpretare a causa della difficoltà di ricostruire sezioni seriali perfettamente e mantenere il corretto orientamento del tessuto su sezioni seriali. Recenti scoperte di Grosse et al. 2011 sottolineano l&#39;importanza di tre informazioni dimensionali nella comprensione morfogenesi dei villi sviluppo dell&#39;intestino 1. Ricostruzione tridimensionale delle cellule intestinali singolarmente etichettati dimostrato che la maggior parte delle cellule epiteliali intestinali contattare sia le superfici apicali e basali. Inoltre, ricostruzione tridimensionale del citoscheletro actina alla superficie apicale dell&#39;epitelio dimostrato che lume intestinale è continua e che lumen secondarie sono un artefatto di sectioning. Questi due punti, insieme con la dimostrazione della migrazione nucleare interkinetic nell&#39;epitelio intestinale, definita l&#39;epitelio intestinale in via di sviluppo come un epitelio pseudostratificato e non stratificati come si pensava 1. La capacità di osservare l&#39;epitelio tridimensionale è stato seminale per dimostrare questo punto e ridefinendo morfogenesi epiteliale nell&#39;intestino del feto. Con l&#39;evoluzione della tecnologia di imaging multi-fotone e software di ricostruzione tridimensionale, la capacità di visualizzare intatto, lo sviluppo di organi sta rapidamente migliorando. Eccitazione a due fotoni permette la penetrazione meno dannoso più in profondità i tessuti con alta risoluzione. Due fotoni di imaging e la ricostruzione in 3D di tutto il fetali intestini del mouse in Walton et al., 2012 hanno contribuito a definire il modello di villi escrescenza 2. Qui si descrive un intero sistema di coltura d&#39;organo che permette ex vivo sviluppo dei villi e le estensioni di quel sistema di coltura per consentirel&#39;intestino ad essere tridimensionalmente ripreso durante il loro sviluppo.

Cultura di espianti interi di intestini fetali consente per le analisi del luogo, la distribuzione, e la durata delle molecole di segnalazione che coordinano lo sviluppo intestinale, in quanto questo sistema consente la manipolazione della segnalazione con reagenti farmacologici o proteine ​​ricombinanti. Il sistema di coltura transwell (Figura 1A, riprodotto da Walton et al., 2012) 2 fornisce una interfaccia aria-liquido, che permette di posizionare droga o proteine ​​imbevuto di ag...

La tecnologia di imaging migliorata consente l'imaging tridimensionale degli organi durante lo sviluppo. Qui descriviamo un intero sistema di coltura di organi che consente l'imaging dal vivo dei villi in via di sviluppo nell'intestino fetale del topo.

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Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere ex vivo colture di interi organi di intestini embrionali di topo, consentendo così la modulazione delle vie di segnalazione cellulare. Ciò si ottiene prelevando prima l'intestino di topo dai feti tra il giorno embrionale 12,5 e 18,5. Il secondo passo consiste nel posizionare l'intestino in una coltura transwell o in una piastra di coltura per immagini dal vivo.Successivamente, trattare l'intestino con terreni preparati con gli inibitori farmacologici delle vie o dei luoghi di segnalazione cellulare. L'aro accelera imbevuto di proteine ricombinanti per alterare la segnalazione cellulare sulla parte superiore dell'intestino. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare gli intestini in coltura in sezioni di vioma spesse o con montaggio a foro.In definitiva, l'imaging confocale seguito dalla ricostruzione tridimensionale, viene utilizzato per visualizzare come la modulazione delle vie di segnalazione cellulare abbia influenzato lo sviluppo degli strati tissutali durante la formazione dei villi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto il tessuto embrionale è molto delicato e richiede grande cu

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