Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per Ex Vivo La manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale Imaging in diretta di Sviluppo del villo

La tecnologia di imaging migliorata consente l'imaging tridimensionale degli organi durante lo sviluppo. Qui descriviamo un intero sistema di coltura di organi che consente l'imaging dal vivo dei villi in via di sviluppo nell'intestino fetale del topo.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere ex vivo colture di interi organi di intestini embrionali di topo, consentendo così la modulazione delle vie di segnalazione cellulare. Ciò si ottiene prelevando prima l'intestino di topo dai feti tra il giorno embrionale 12,5 e 18,5. Il secondo passo consiste nel posizionare l'intestino in una coltura transwell o in una piastra di coltura per immagini dal vivo.

Successivamente, trattare l'intestino con terreni preparati con gli inibitori farmacologici delle vie o dei luoghi di segnalazione cellulare. L'aro accelera imbevuto di proteine ricombinanti per alterare la segnalazione cellulare sulla parte superiore dell'intestino. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare gli intestini in coltura in sezioni di vioma spesse o con montaggio a foro.

In definitiva, l'imaging confocale seguito dalla ricostruzione tridimensionale, viene utilizzato per visualizzare come la modulazione delle vie di segnalazione cellulare abbia influenzato lo sviluppo degli strati tissutali durante la formazione dei villi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto il tessuto embrionale è molto delicato e richiede grande cura durante la dissezione e la manipolazione. Per prepararsi alla dissezione, immergere gli strumenti di dissezione in etanolo al 70%.

Posizionare la piastra di coltura a sei pozzetti e le piastre Petri da 10 centimetri con terreno BGJB sul ghiaccio. Quindi rimuovere l'intestino dai feti soppressi. Sezionali uno per uno in uno X-D-P-B-S.

Rimuovere con cautela la milza dallo stomaco, quindi il pancreas dallo stomaco e il duodeno superiore. Dopodiché, separa delicatamente l'omento, lasciandolo attaccato il più possibile e separando le connessioni solo quanto basta per consentire il raddrizzamento dell'intestino. Quindi posizionare i campioni in una piastra di Petri da 10 centimetri con terreno BGJB di lavoro.

Quindi, utilizzare una pipetta orale per trasferire i pezzi intestinali sui pozzetti della piastra di coltura. Rimuovere il supporto da sotto il pozzetto. Quindi aggiungere 700 microlitri di terreno di trattamento sotto il trans.

Successivamente, aggiungere 300 microlitri di terreno di trattamento goccia a goccia sull'intestino e lasciarlo in ammollo attraverso il pozzetto. Sostituire i terreni di trattamento almeno una volta al giorno o più spesso a seconda dell'emivita del reagente di trattamento. In alternativa, posizionare delicatamente le perle di agro sull'intestino utilizzando una pipetta orale con ago capillare tirato.

Posizionare le perline con estrema cautela poiché una manipolazione brusca danneggerà l'intestino e impedirà lo sviluppo dei villi nell'area lesa. In questa procedura, incorporare l'intestino al 7% in piccoli stampi di plastica e lasciare raffreddare e solidificare i blocchi di aros. Successivamente, rimuovere i blocchi di aros dagli stampi di plastica.

Incollare i blocchi aros al palco di raccolta Vibram con colla istantanea. Quindi, riempi la fase di raccolta con uno X-D-P-B-S. ghiacciato. Tagliare le sezioni con uno spessore compreso tra 100 e 150 micrometri.

Quindi trasferire le sezioni dalla fase di raccolta in un pozzetto della piastra a sei pozzetti per lo stoccaggio a quattro gradi Celsius. Per preparare le guide per il montaggio, posizionare del nastro biadesivo lungo la guida lunga di ciascuna diapositiva. Metti una goccia di un XPBS su di esso.

Quindi posizionare con cura da cinque a 10 sezioni sul vetrino. Aprire tutte le sezioni e stenderle su un unico strato. Dall'altra parte dello scivolo.

Rimuovere eventuali parti in eccesso o irregolari che impedirebbero al vetrino coprioggetto di rimanere piatto. Utilizzare con attenzione un fazzoletto di laboratorio per assorbire l'eccesso di XPBS intorno alle sezioni. Successivamente, a una goccia di mezzo di montaggio acquoso sopra le sezioni.

Quindi posizionare il vetrino coprinte su di esso e sigillarlo sul vetrino con vap fuso. Successivamente, visualizzare le sezioni del vioma su un microscopio confocale verticale o invertito. Ora usa la colla istantanea per far aderire una singola membrana in policarbonato a uno schermo a maglia fine.

Posiziona lo schermo a rete nel pozzetto centrale di una piastra di coltura. Quindi posizionare l'intestino sezionato sulla membrana in policarbonato e aggiungere una goccia di colla istantanea su ciascuna delle estremità. Quindi, aggiungere i terreni di coltura privi di rosso fenolo sotto la membrana in policarbonato nel pozzetto centrale della piastra di coltura.

Aggiungere acqua al bordo esterno della piastra di coltura per fornire umidità. Poiché l'intestino fetale subisce onde di contrazione simili a quelle peristaltiche in coltura, aggiungere 100 microlitri di soluzione di xilazina a tre millilitri di terreno nel pozzetto centrale della piastra per controllare il movimento dell'intestino durante l'imaging. Condurre l'imaging dal vivo utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale a due fotoni su un supporto verticale.

Qui sono mostrate le sezioni trasversali del tessuto duodenale E 14, E 15 ed E 16 appena raccolto colorato con ecat e dpi. Questo segmento intestinale è stato raccolto a E 14 e coltivato per due giorni. Alla E 14, l'epitelio non modellato era ancora pseudo stratificato.

Dopo due giorni in coltura sono visibili VII, anche se sono leggermente in ritardo rispetto a VII. A E 16, ecco la ricostruzione tridimensionale delle sezioni ottiche del sistema vascolare colorato con pcam nel duodeno E 14, e questa figura mostra le ricostruzioni tridimensionali di immagini confocali da intestini sezionati con vioma E 15.5 che sono stati colorati con immunofluorescenza anticorpale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare il tessuto embrionale, impostare l'intestino per la coltura dell'intero organo e preparare il tessuto per l'imaging tridimensionale di alta qualità.