Combinazione di Microstereolithography e Electrospinning per la Produzione di Membrane Equipaggiato con nicchie per la rigenerazione della cornea

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di introdurre la complessità spaziale 3D all'interno degli scaffold di ingegneria tissutale combinando l'uso di tecniche di produzione additiva e l'elettrofilatura. Ciò si ottiene creando un modello non degradabile in polietilenglicole, D acrl o PEG DA, utilizzando una tecnica di fotopolimerizzazione strato per strato chiamata micro stereolitografia. Come secondo passo.

Le sagome sono fissate a un substrato metallico e viene utilizzata un'elettrofilatura per produrre una membrana biodegradabile che imita la morfologia sottostante. Successivamente, vengono studiate le procedure di imballaggio e la degradazione delle membrane elettrofilate. La degradazione prematura delle membrane immagazzinate viene evitata controllando la temperatura e l'umidità.

La fase finale consiste nel posizionare le membrane biodegradabili su un modello 3D di cornea ferita per studiarne il potenziale utilizzo come dispositivi di rigenerazione corneale. I risultati mostrano la versatilità dell'utilizzo di tecniche di produzione additiva e di elettrofilatura per creare membrane complesse contenenti micro tasche che imitano in una certa misura la nicchia naturale delle cellule staminali. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua versatilità.

Poiché gli stampi non biodegradabili possono essere creati nuovi, utilizzando un'ampia gamma di tecniche di produzione, questo metodo sarebbe di interesse sia nel campo della produzione che in quello della rigenerazione dei tessuti e aiuterebbe a rispondere a domande chiave relative al comportamento delle cellule staminali e alla nicchia delle cellule staminali. Questo metodo di realizzazione di scaffold microfabbricati può fornire informazioni sulla rigenerazione corneale. Può anche essere applicato ad altri tessuti epiteliali con nicchie di cellule staminali come la pelle e la mucosa orale, o per fornire altre funzionalità 3D e scaffold per l'ingegnerizzazione di un'ampia gamma di tessuti.

Sia il leader Ortega che Thomas Patterson dimostreranno la procedura. Iniziate questa procedura creando L uno, il primo strato. Questo diventerà la base della struttura utilizzando qualsiasi programma di disegno adatto per un cerchio nero di 1,2 centimetri.

Quindi, crea L due. Il secondo strato, disegna un altro cerchio nero di 1,2 centimetri, ma include da sei a otto strutture bianche a forma di ferro di cavallo da 0,5 per 0,35 millimetri. Distribuire le piccole forme bianche a ferro di cavallo all'interno della struttura circolare nera.

Salva L uno e L due in formato JPEG per impostare la micro stereolitografia. Innanzitutto, regolare e pulire accuratamente l'ottica del sistema. Mettere 300 microlitri di polietilenglicole di acrl, o miscela PEG D, in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale da 12 pozzetti.

Il pozzetto deve essere pre-rivestito con teflon o altro materiale antiaderente o una facile rimozione della struttura. Dopo l'indurimento, accendere il laser blu e caricare L uno nel software di base ALP tre. Questo software è un'interfaccia USP che fornisce il collegamento tra il PC e il dispositivo digitale a micro specchio.

Irradiare il primo strato per 60 secondi. Aggiungere al pozzo 250 microlitri in più del peg da. Caricare L due e irradiare L due per 60 secondi.

Rimuovere il polimero non polimerizzato e lavare gli anelli con isopropanolo durante la notte Il giorno prima dell'elettrofilatura, creare un collettore elettrofilante statico distribuendo gli anelli PEG DA su un foglio di alluminio elettrolitico di 12 centimetri per 20 centimetri. Fissare gli anelli utilizzando del nastro di carbonio conduttivo. Preparare la soluzione di polilattide co glicole o PLGA e mescolarla per una notte prima dell'uso il giorno successivo.

Posizionare quattro siringhe da cinque millilitri con aghi smussati di diametro interno di 0,8 centimetri su una pompa a siringa. Vengono utilizzate quattro siringhe invece di una singola siringa. Per garantire una più rapida elettrocentrifuga, caricare 2,5 millilitri di soluzione PLGA in ciascuna siringa.

Per il successo di questa procedura, è importante cercare di mantenere le variabili laro pinine il più costanti possibile. Lasciare una distanza tra gli aghi e il raccoglitore di 15 centimetri. Impostare una portata di 30 microlitri al minuto e tensioni che vanno da 12 a 15 kilovolt per l'elettro spinning electro spin per un'ora e 30 minuti.

Al termine dell'elettrofilatura, staccare con cura il foglio di spugna elettronica PLGA dal collettore che supporta gli anelli PEG da. Gli anelli PEG DA possono essere riutilizzati come dime per l'elettrofilatura. Utilizzare un perforatore circolare per tagliare le impalcature elettrospon in cerchi di 22 millimetri di diametro.

Lasciando la struttura ad anello posizionata al centro per preparare le membrane PLGA per lo stoccaggio a lungo termine. Monta ciascuno in un piccolo contenitore come una capsula di Petri di plastica e mettilo all'interno di un sacchetto per uso medico. Metti tre sacchetti di essiccante all'interno del sacchetto per uso medico.

Aggiungi alla borsa una scheda indicatrice di umidità a sei punti disponibile in commercio. Questo rileverà eventuali accumuli di umidità durante il periodo di conservazione. Utilizzare una termosaldatrice sottovuoto per aspirare e sigillare il sacchetto.

Successivamente, le membrane PLGA vengono inviate a un'azienda esterna, i raggi gamma o le radiazioni prima dello stoccaggio. In questo esperimento, le melanzane limbari di coniglio sono isolate da occhi di coniglio ottenuti da una fattoria in cui i conigli vengono allevati per il consumo. Per prima cosa disinfetta gli occhi del coniglio usando una soluzione antisettica al 3%.

Successivamente, pulisci gli occhi rimuovendo il tessuto in eccesso che circonda la cornea. La regione limbare può essere identificata come una sottile area circolare tra la cornea trasparente e la sclera bianca. Separare la regione limbare dal resto della cornea.

Tagliare la regione limbare in segmenti di circa 1,5 centimetri di lunghezza, disinfettare i segmenti limbari in una soluzione antisettica all'1,5% per un minuto. Dopo la disinfezione, utilizzare una lama di bisturi per tagliare i segmenti limbari in piccoli pezzi. Conservare i piccoli pezzi di tessuto in DMEM plus glut max media a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica o al massimo un'ora prima dell'uso.

Per iniziare questa procedura, utilizzare un raschietto cellulare per rivestire le membrane dell'anello con 15 microlitri di colla di fibrillina. Distribuire uniformemente la fibrillina lavorando al microscopio da dissezione. Utilizzare un ago calibro 25 per posizionare gli espianti limbari direttamente sulle micro tasche del PLGA.

Posizionare gli anelli con il tessuto explan su cornee denudate precedentemente preparate. Con l'explan rivolto verso l'alto e in condizioni di interfaccia aria-liquido, l'anello PLGA si bagnerà rapidamente e adotterà la forma del modello di cornea. Mantenere i modelli di coltura degli organi per quattro settimane in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica cambia il terreno ogni due giorni.

La microstereolitografia consente la fabbricazione di anelli PEG DA di diverse dimensioni e l'incorporazione simultanea di micro caratteristiche. Gli anelli possono essere realizzati e riutilizzati in modo riproducibile e sono facilmente attaccati a una lastra di metallo che può essere utilizzata come collettore elettrofilante. In questo esempio, gli anelli contengono micro caratteristiche a ferro di cavallo.

L'elettrofilatura produce quindi repliche di PLGA: l'imballaggio sottovuoto delle membrane PLGA migliora significativamente la loro conservazione a lungo termine anche a 37 gradi Celsius in condizioni deliberatamente umide. Il tipo di sacca utilizzata influisce anche sulla stabilità della membrana, la microscopia elettronica a scansione e l'esame dei tre discanti non mostrano cambiamenti nell'integrità delle fibre o nell'umidità delle fibre intatte. Crescita cellulare da impianti limbari o supportata da anelli PLGA biodegradabili appena realizzati e da anelli dopo sei mesi di conservazione a meno 20 gradi Celsius.

Quando si posizionano le membrane PLGA su modelli 3D di cornea ferita, il trasferimento cellulare è stato ottenuto dopo quattro settimane. Le immagini H ed e mostrano il nuovo epitelio multistrato formato dalle cellule che fuoriescono dagli espianti posti sulle nicchie. Il controllo negativo ha confermato la mancata formazione di un nuovo epitelio in assenza di cellule aggiunte.

Rispetto a un epitelio corneale convenzionale osservato in una cornea di coniglio fresca utilizzata come controllo positivo. L'immunocitochimica ha dimostrato che le cellule che crescono dagli impianti erano cellule epiteliali corneali poiché erano positive per la citocheratina tre, un marcatore di differenziazione corneale. Poiché i collettori elettrofilanti contenenti le sagome non biodegradabili sono riutilizzabili, la produzione degli scaffold può essere effettuata in due ore quando il protocollo è ottimizzato.

Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale di esplorare un nuovo modo di produrre membrane complesse di ingegneria tissutale contenenti micro caratteristiche in cui studiare il comportamento cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare un modello microfabbricato non degradabile utilizzando tecniche di produzione additiva o approcci simili come la modellazione e come utilizzare l'elettrofilatura per aggiungere complessità alle tue impalcature.