Name: Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Scopri l'analisi metabolomica ad alta risoluzione del cervello di ratto mediante spettroscopia NMR. Questo metodo consente di profilare i metaboliti cerebrali per studiare le alterazioni neurochimiche nelle malattie neurologiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il sostegno del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 e 7339) è ringraziato.

<ol><li>Manger, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+21st+century+neuroscience+too+focused+on+the+rat%2Fmouse+model+of+brain+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction.</a> Front Neuroanat. 2, 5(2008).</li>
<li>Buxbaum, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+phenotyping+of+rodent+ASD+models+enrichment+analysis+of+mouse+and+human+neurobiological+phenotypes+associated+with+high-risk+autism+genes+identifies+morphological%2C+electrophysiological%2C+neurological%2C+and+behavioral+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features.</a> Mol Autism. 3, 1(2012).</li>
<li>Papaioannou, V., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPapaioannou%2C+V+%22Mouse+Phenotypes+A+Handbook+of+Mutation+Analysis%22">Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).</li>
<li>Yu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sodium+current+in+GABAergic+interneurons+in+a+mouse+model+of+severe+myoclonic+epilepsy+in+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy.</a> Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).</li>
<li>Mallolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymorphism+in+the+EAAT2+promoter+is+associated+with+higher+glutamate+concentrations+and+higher+frequency+of+progressing+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).</li>
<li>Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrusio%2C+WE+%22Behavioral+Genetics+of+the+Mouse+Genetics+of+Behavioral+Phenotypes%22">Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes</a>. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+fingerprints+of+altered+brain+growth%2C+osmoregulation+and+neurotransmission+in+a+Rett+syndrome+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model.</a> PLoS ONE. 2, e157(2007).</li>
<li>Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+drug+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in drug target discovery.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWishart%2C+DS+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+freezing+conditions+for+cerebral+metabolites+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats.</a> Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).</li>
<li>Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+isotopomer+analysis+in+the+rat+brain+in+vivo+automatic+quantitation+of+13C+NMR+spectra+using+LCModel%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel.</a> NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts+2+Line+width+and+spectral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution.</a> Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts.+1.+Chemical+shift+and+signal+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation.</a> Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+biochemical+pathways+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+adjuvant+arthritis+a+comparative+metabolomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study.</a> PLoS ONE. 8, e56101(2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+multiparametric+optimization+for+phospholipidomics+by+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy.</a> Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).</li>
<li>Pearson, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearson%2C+GA+%22Shimming+an+NMR+magnet%22">Shimming an NMR magnet</a>. , University of Iowa. Iowa City. (1991).</li>
<li>Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+AN+%22Biophysical+tools+for+biologists%22">Biophysical tools for biologists</a>. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).</li>
<li>Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+study+of+regional+metabolism+after+forebrain+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats.</a> Stroke. 20, 633-640 (1989).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Spettroscopia NMR è un metodo efficiente per la misurazione delle concentrazioni di composti chimici in soluzione in modo molto accurato e riproducibile. Tuttavia, per ottenere dati di alta qualità, è necessario rispettare alcune norme in materia di preparazione e analisi del campione. Nella determinazione di concentrazioni di metaboliti mediante spettroscopia NMR, né la generazione né la ricezione del segnale NMR domina l&#39;errore di quantificazione, a meno che l&#39;intensità di un segnale osservato avvicina alla so...

Modelli murini sono stati utilizzati estesamente nella ricerca sul cervello 1. Correlazioni genotipo-fenotipo sono stati studiati nel topo e ratto cervello studiando l&#39;espressione genica a RNA e / o livelli di proteine ​​da un lato, e fenotipi morfologici, funzionali, elettrofisiologiche e / o comportamentali dall&#39;altro 2-6. Tuttavia, per comprendere completamente i meccanismi che collegano fenotipo al genotipo, è indispensabile studiare gli eventi molecolari a valle di espressione della proteina, cioè. il metabolismo dei substrati biochimici su cui agiscono gli enzimi 7. Questa esigenza ha portato, nel corso degli ultimi 10 o 15 anni, a una rinascita della ricerca metabolica in molti rami della biologia 8,9. Mentre studi metabolici classici si sono spesso concentrati su dettagli di specifici percorsi, il nuovo approccio metabolomica è orientata verso un&#39;indagine onnicomprensiva del profilo metabolico globale del tessuto in esame.Una conseguenza di questo concetto è un evidente bisogno di strumenti analitici che riducono al minimo pregiudizio verso specifici percorsi e / o classi di composti metabolici. Tuttavia, un saggio biochimico classica è basata su una particolare reazione chimica di un analita che deve essere specificato prima di eseguire il test. Per contro, tecniche spettroscopiche come la risonanza magnetica (NMR) nucleare e la spettrometria di massa (MS) (i) sono basati su particolari (fisici) proprietà molecolari di composti biochimici, ciascuna delle quali dà luogo ad uno o più segnali distinti in uno spettro rilevato nel corso di un esperimento; e (ii) rilevare un gran numero di diversi composti per esperimento. Così, ogni spettro contiene le informazioni combinate di tutta una serie di metaboliti. Per questo motivo, i metodi spettroscopici sono strumenti adeguati per la metabolomica, in quanto nessuna selezione preventiva deve essere fatta per quanto riguarda la natura dell&#39;analita da misurare 8 </sup&gt;. Di conseguenza, queste tecniche naturalmente si prestano a studi esplorativi perché notevolmente facilitano l&#39;individuazione di cambiamenti metabolici inaspettati. Anche se la spettroscopia NMR e MS possono essere usati in modo intercambiabile per l&#39;analisi di molti metaboliti, ogni metodo possiede vantaggi e gli svantaggi che sono stati recentemente recensito 10 specifici. In breve, la spettroscopia NMR di solito può essere eseguita da estratti grezzi e non richiede la separazione cromatografica di composti del campione prima dell&#39;analisi. Al contrario, MS funziona con gas o cromatografia liquida (GC o LC) separazione, ad eccezione di particolari sviluppi recenti come l&#39;imaging spettrometria di massa. In alcuni casi particolari, come l&#39;analisi degli zuccheri, separazione LC può diventare una necessità per la spettroscopia NMR così, perché le linee di risonanza di zuccheri diversi si sovrappongono in modo significativo nel protone (1 H) spettri NMR. Tuttavia, spettroscopia 1 H NMR senza chrseparazione omatographic rimane il più popolare quasi universalmente applicata metodo NMR metabolomica,. In generale, la preparazione del campione è più lungo e complesso per MS di quanto lo sia per la spettroscopia NMR. Gravi problemi dovuti agli effetti della matrice sono molto meno comuni in spettroscopia NMR che in Stati membri in cui essi possono condurre a segnali notevolmente attenuati. Metabolita quantificazione può essere ottenuto con entrambi i metodi. Tuttavia, sono necessari più composti standard per la SM a causa di variazioni di effetti matrice e l&#39;efficienza di ionizzazione tra metaboliti. Al contrario, è necessario un solo standard per ogni campione per l&#39;analisi spettroscopica NMR perché in condizioni di misura adeguate, il secondo metodo è intrinsecamente quantitative grazie alla risposta NMR strettamente lineare dai nuclei osservati. Un grave inconveniente di NMR è la sua relativamente bassa sensibilità. MS, in particolare, LC-MS, è più sensibile NMR di diversi ordini di grandezza; per questo motivo, MS è da preferire NMR per laanalisi dei composti presenti a concentrazioni molto basse. D&#39;altra parte, la natura non distruttiva dell&#39;esperimento NMR è un chiaro vantaggio rispetto MS; in questo modo, NMR può essere eseguita più volte sullo stesso campione, ad esempio, per i diversi nuclei NMR attivo come 1 H, fosforo-31 (31 P), carbonio-13 (13 C), fluoro-19 (19 F) etc., in quanto nessun materiale viene consumato da NMR rispetto alle misurazioni MS. Sia NMR e MS possono essere impiegati in modi differenti, ognuno dei quali è ottimale per la rivelazione di composti con particolari caratteristiche chimiche. Per esempio, 31 P NMR è spesso più adatto di 1 H NMR per l&#39;analisi di composti fosforilati moderatamente concentrati, sebbene metaboliti fosforilati quasi tutti contengono anche protoni. Tuttavia, i loro segnali 1 H NMR possono essere oscurate da 1 H NMR i segnali provenienti da altri composti, non fosforilata, mentre il secondoovviamente non causano segnali di fondo in 31 P NMR. In una situazione analogico, analisi 19 F NMR è da preferire per i composti fluorurati, ad esempio, farmaci fluorurati (nessun segnale di fondo di metaboliti endogeni), mentre il caso speciale di 13 C NMR è di interesse quasi esclusivamente se il destino di 13 C deve essere seguita, a causa della estremamente bassa abbondanza naturale dell&#39;isotopo 13 C (circa 1%) etichettati precursori metabolici esogeni. Molti spettrometri di massa operano in modalità ioni negativi o in modalità ioni positivi. Pertanto, è importante conoscere in anticipo l&#39;analisi se gli ioni da osservare sono caricati negativamente o positivamente. Ci concentriamo qui su un protocollo per l&#39;analisi del metabolome tessuto cerebrale da 1 H e 31 spettroscopia NMR P perché questo metodo produce un gran numero di importanti concentrazioni di metaboliti a basso costo, in termini di (i) il tempo necessario per la preparazione del campione unnd (ii) lo sforzo richiesto per metabolita quantificazione. Tutti gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando l&#39;attrezzatura di un laboratorio standard di wet-chimica e una struttura di spettroscopia NMR ad alta risoluzione. Ulteriori requisiti sono descritti nella sezione Protocollo di seguito.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Virbac</td><td>Vetflurano</td><td>Anestetico per animali</td></tr><tr><td>Vaporizzatore di isoflurano</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td><td>Modello più recente disponibile: Isotec 4</td></tr><tr><td>Bisturi, forbici, pinze, morsetti</td><td>Harvard Apparatus Fisher Scientific</td><td>various varie</td><td>Attrezzature chirurgiche per animali</td></tr><tr><td>Freeze-clamp tool</td><td>homebuilt</td><td>n/a</td><td>Pinza con piastre in alluminio, da inserire in azoto liquido per raffreddamento</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>Aria Liquida</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Azoto gassoso</td><td>Aria Liquida</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore di azoto</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>Può essere sostituito da un dispositivo autocostruito</td></tr><tr><td>Mortar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Z247472</tr><tr><td>Pestello</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore tissutale</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>Con raccordo per provette albero omogeneizzatore</td></tr><tr><td>Bilancia elettronica</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga in vetro</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, provetta da 30 ml</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax provetta da 2 ml; sostituire la provetta "Eppendorf" se compatibile con il rotore della centrifuga</td></tr><tr><td>Pipette in polistirene</td><td>Costar Corning</td><td>Stripettes</td><td>volumi da 5 e 10 ml</td></tr><tr><td>Deuterocloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>deuterato al 99,96%</td></tr><tr><td>Ossido di deuterio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>99,96% deuterato</td></tr><tr><td>Cloruro di deuterio</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>20% in ossido di deuterio</td></tr><tr><td>Deuterossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>30% in ossido di deuterio</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Cristo</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a freddo</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di cesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>provette NMR</td><td>Wilmad</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>Inserto coassiale con stelo</td><td>NMR Sigma-Aldrich</td><td>Z278513</td><td>By Wilmad</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>NMR Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>Con puntali per volumi da 0,5 a 1.000 &mu; l</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Spettrometro</td> NMR Drummond <td>XP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td><td>con sonda e altri accessori</td></tr><tr><td>Software NMR</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>versione più recente disponibile: Topspin 3.2</td></tr><tr><td>Composti standard solubili in acqua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>composti</td> <td>standard fosfolipidiAvanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>vari vari vari</td><td>Fonte per plasmalogeni, ma può essere < 70 - 80% di purezza</td></tr><tr><td>Metilenedifosfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi metabolomica di cervello di ratto da alta risoluzione spettroscopia di risonanza magnetica nucleare di estratti di tessuto

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Gli studi sull'espressione genica sui livelli di RNA e proteine sono stati a lungo utilizzati per esplorare i processi biologici alla base della malattia. Più recentemente, la genomica e la proteomica sono state integrate da un'analisi quantitativa completa del pool di metaboliti presenti nei sistemi biologici. Questa strategia, chiamata metabolomica, mira a fornire una caratterizzazione globale del complemento di piccole molecole coinvolto nel metabolismo. Mentre il genoma e il proteoma definiscono i compiti che le cellule possono svolgere, il metaboloma fa parte del fenotipo vero e proprio. Tra i metodi attualmente utilizzati in metabolomica, le tecniche spettroscopiche sono di particolare interesse perché consentono di analizzare simultaneamente un gran numero di metaboliti senza una selezione preventiva per specifiche vie biochimiche, consentendo così un approccio ampio e imparziale. Qui viene presentato un protocollo sperimentale ottimizzato per l'analisi metabolomica mediante spettroscopia NMR ad alta risoluzione, che è il metodo di scelta per una quantificazione efficiente dei metaboliti tissutali. Importanti punti di forza di questo metodo sono (i) l'uso di estratti grezzi, senza la necessità di purificare il campione e/o separare i metaboliti; ii) la natura intrinsecamente quantitativa della RMN, che consente la quantificazione di tutti i metaboliti rappresentati da uno spettro NMR con un solo composto di riferimento; e iii) la natura non distruttiva della RMN che consente l'uso ripetuto dello stesso campione per misurazioni multiple. L'intervallo dinamico delle concentrazioni di metaboliti che possono essere coperte è considerevole a causa della risposta lineare dei segnali NMR, sebbene i metaboliti che si verificano a concentrazioni estremamente basse possano essere difficili da rilevare. Per i composti meno abbondanti, il metodo della spettrometria di massa altamente sensibile può essere vantaggioso, sebbene questa tecnica richieda procedure di preparazione e quantificazione del campione più complesse rispetto alla spettroscopia NMR. Presentiamo qui un protocollo NMR adattato all'analisi del cervello di ratto; Tuttavia, lo stesso protocollo può essere applicato ad altri tessuti con piccole modifiche.

Per ottenere la migliore risoluzione in metabolica spettri NMR di cervello e di altri estratti tissutali, è stato a lungo una pratica comune per rimuovere o ioni metallici (maschera più importante: ioni paramagnetici) presenti nelle soluzioni di estratto. Ciò è stato ottenuto mediante aggiunta di un agente chelante come EDTA o CDTA all'estratto 19, o facendo passare l'estratto attraverso una resina a scambio ionico, come Chelex-100 20. I risultati presentati in Figura 1, dimostrano...

La neurochimica del cervello dei mammiferi è cambiata in molte malattie neurologiche e sistemiche. I profili caratteristici dei metaboliti cerebrali possono essere ottenuti in modo efficiente sulla base di estratti grezzi di tessuto cerebrale. A tal fine, viene impiegata la spettroscopia NMR ad alta risoluzione, che consente un'analisi quantitativa dettagliata delle concentrazioni di metaboliti (metabolomica).

Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere profili di metaboliti ad alta risoluzione da estratti di cervello di ratto. Ciò si ottiene raccogliendo prima i cervelli di ratto e congelandoli in azoto liquido. Il secondo passo consiste nell'estrarre i metaboliti cerebrali omogeneizzando i tessuti in acqua di metanolo cloroformio, seguita dalla rimozione delle proteine denaturate e dei solventi organici.Successivamente, i campioni acquosi vengono liofilizzati e tutti i campioni vengono risolti in solventi ben definiti. Per un'analisi spettroscopica NMR ottimale, il passaggio finale consiste nell'impostare e ottimizzare attentamente gli esperimenti NMR metabolomici. In definitiva, gli spettri NMR sono richiesti in condizioni sperimentali ben definite e valutati utilizzando protocolli di elaborazione dati ottimizzati.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul metabolismo cerebrale, può essere applicato anche ad altri tessuti molli come tumori, fegato, reni e altri organi. Innanzitutto, rimuovere un campione di tessuto cerebrale congelato precedentemente preparato dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Quindi trasferire immediatamente il campione di tessuto i

metabolomic-analysis-rat-brain-high-resolution-nuclear-magnetic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Un metodo per l'estrazione metabolita da parte delle comunità microbiche planctonici è presentato. Campionamento intera comunità si realizza mediante filtrazione su filtri appositamente preparati. Dopo liofilizzazione, acquoso-solubili metaboliti vengono estratti. Questo approccio consente per l'applicazione della metabolomica ambientali trans-omiche indagini di comunità microbiche naturali o sperimentali.

Concentrazione dei metaboliti a bassa densità Comunità planctoniche per Metabolomica ambientali utilizzando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare

Descriviamo un modello murino del disturbo post traumatico da stress (PTSD) che rivela le alterazioni persistenti della funzione neuroendocrina e del ritardato a lungo termine, di risposta paura esagerata, caratteristici dei pazienti con PTSD. Il modello animale e metodi descritti qui sono utili per correlare biomarcatori nei nuclei del cervello, che sono meccanicistica ma non possono essere misurati nei pazienti, con biomarcatori nelle periferie globuli bianchi, che può.

Biomarcatori in un modello animale per Rivelare correlati neurali, ematologiche, e comportamentali di PTSD

Una procedura di progressiva colonizzazione è descritto per valutare ulteriormente il suo impatto sul metabolismo epatico ospitante. La colonizzazione è monitorato non invasivo, valutando l'escrezione urinaria di co-metaboliti microbici da NMR basati su profili metabolici, mentre il metabolismo epatico viene valutata ad alta risoluzione Angle Spinning Magic (MAS HR) profilazione NMR di intatto biopsia.

Valutare alterazioni metaboliche epatiche durante la colonizzazione progressiva di Germe senza mouse da 1 H spettroscopia NMR

La dopamina è distintamente regolata nel mesencefalo nuclei, che contengono la cella corpi e dendriti dei neuroni dopaminergici. Qui si descrive un approccio di dissezione e di manipolazione dei campioni per massimizzare i risultati e, quindi, le conclusioni e le intuizioni, sulla regolamentazione dopamina nel mesencefalo nuclei della substantia nigra (SN) e la zona ventrale tegmentale (VTA) in roditori.

Profiling completa del regolamento dopamina nel substantia nigra e ventrale tegmentale Area

Fonte: Blanc, J., et al. Spettroscopia di risonanza magnetica funzionale a 7 t nella corteccia del barile di ratto durante l'attivazione dei baffi. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra il metodo di analisi dei cambiamenti metabolici nella corteccia del barile di ratto utilizzando la spettroscopia di risonanza magnetica funzionale durante la stimolazione dei baffi. Gli spettri dei metaboliti al basale vengono confrontati con gli spettri stimolati per rilevare l'aumento del lattato nella...

Spettroscopia di risonanza magnetica funzionale della corteccia del fusto di ratto durante la stimolazione dei baffi

La tomografia a emissione di positroni per piccoli animali consente di valutare i due principali substrati energetici del cervello: glucosio e chetoni. Nel presente metodo, 11C-acetoacetato e 18F-fluorodesossiglucosio vengono iniettati in sequenza in ciascun animale e il loro assorbimento viene misurato quantitativamente in specifiche regioni cerebrali determinate dalle immagini di risonanza magnetica.

Un protocollo PET-MRI a doppio tracciante per la misura quantitativa dell'assorbimento dei substrati energetici cerebrali regionali nel ratto

Dopo aver controllato di sangue-ossigeno-livello-dipendente funzionale imaging a risonanza magnetica (fMRI grassetto) che la corrispondente zona della corteccia somatosensoriale barile campo (chiamata S1BF) è correttamente attivato, il principale obiettivo di questo studio è quello di quantificare il contenuto del lattato fluttuazioni nei cervelli del ratto attivati dalla spettroscopia di risonanza magnetica del protone localizzata (1H-MRS) a 7 T.

Spettroscopia di risonanza magnetica funzionale a 7 T nella corteccia di canna del ratto durante l'attivazione Whisker

Descriviamo le procedure per l'elaborazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici ad alta risoluzione per l'analisi morfolometrica della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi. I micrografi ottenuti con questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia di un certo numero di altri componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali.

Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere dati stabili di risonanza magnetica funzionale (rs-fMRI) allo stato di riposo da un ratto utilizzando isoflurano a basso dosaggio in combinazione con dexmedetomidina a basso dosaggio.

Acquisizione dei dati di risonanza magnetica funzionale a riposo nel ratto

Questo articolo presenta l'uso di PSYCHE e SAPPHIRE-PSYCHE nella profilazione metabolica delle piante e include procedure dettagliate per la preparazione del campione e la registrazione ottimale degli spettri NMR Pure Shift. Vengono discussi esempi attraverso i quali il guadagno in risoluzione ottenuto dal disaccoppiamento omonucleare consente una comprensione più completa del sistema.

Risonanza magnetica nucleare Pure Shift: un nuovo strumento per la metabolomica delle piante

L'acquisizione di dati di tomografia dinamica a emissione di positroni (PET) e la ricostruzione in intervalli di tempo consente l'analisi della connettività cerebrale metabolica a livello di singolo soggetto. Descriviamo un metodo per acquisire dati PET dinamici [18F]FDG del cervello di ratto e ottenere una matrice di connettività attraverso l'estrazione di curve tempo-attività di volumi di interesse.

Studio della connettività cerebrale metabolica utilizzando la tomografia a emissione di positroni dinamica 2-deossi-2-[18F]Fluoro-D-glucosio a livello di singolo soggetto

Scopri l'analisi metabolomica ad alta risoluzione del cervello di ratto mediante spettroscopia NMR. Questo metodo consente di profilare i metaboliti cerebrali per studiare le alterazioni neurochimiche nelle malattie neurologiche.

Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto (Video) | JoVE Journal

Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto

Esplora altri video