Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere profili di metaboliti ad alta risoluzione da estratti di cervello di ratto. Ciò si ottiene raccogliendo prima i cervelli di ratto e congelandoli in azoto liquido. Il secondo passo consiste nell'estrarre i metaboliti cerebrali omogeneizzando i tessuti in acqua di metanolo cloroformio, seguita dalla rimozione delle proteine denaturate e dei solventi organici.

Successivamente, i campioni acquosi vengono liofilizzati e tutti i campioni vengono risolti in solventi ben definiti. Per un'analisi spettroscopica NMR ottimale, il passaggio finale consiste nell'impostare e ottimizzare attentamente gli esperimenti NMR metabolomici. In definitiva, gli spettri NMR sono richiesti in condizioni sperimentali ben definite e valutati utilizzando protocolli di elaborazione dati ottimizzati.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul metabolismo cerebrale, può essere applicato anche ad altri tessuti molli come tumori, fegato, reni e altri organi. Innanzitutto, rimuovere un campione di tessuto cerebrale congelato precedentemente preparato dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Quindi trasferire immediatamente il campione di tessuto in un mortaio parzialmente riempito di azoto liquido.

Usa un pestello freddo ad azoto liquido per rompere il tessuto cerebrale congelato in pezzi più piccoli che si inseriscono facilmente nelle provette utilizzate per l'omogeneizzazione dei tessuti. Dopo questa miscelazione, i piccoli pezzi di tessuto cerebrale congelato pesano accuratamente da 250 a 350 milligrammi di tessuto e lo trasferiscono in una provetta riempita con un totale di quattro millilitri di metanolo ghiacciato. Ogni volta che vengono aggiunti pezzi di tessuto congelato alla provetta, omogeneizzarli immediatamente con l'omogeneizzatore tissutale.

Dopo che l'ultimo pezzo di campione di cervello di ratto congelato è stato aggiunto alla provetta e omogeneizzato, trasferire l'omogeneizzato in una fiala di vetro da 20 millilitri maggiore o uguale. Chiudere il tappo a vite e mettere l'omogeneizzato sul ghiaccio per 15 minuti. Quindi, aggiungere quattro millilitri di cloroformio ghiacciato all'omogeneizzato e agitare accuratamente.

Al termine, mettere l'omogeneizzato sul ghiaccio per 15 minuti. Aggiungere quattro millilitri di acqua all'omogeneizzato dopo aver girato accuratamente, lasciando riposare l'omogeneizzato a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Per la separazione di fase completa, trasferire la soluzione di omogeneizzato di tessuto cerebrale in una provetta da 20 millilitri resistente al cloroformio e centrifugare il campione a 13.000 G e quattro gradi Celsius per 40 minuti.

Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta per pasta per trasferire la fase superiore in un'appropriata provetta resistente al metanolo da 15 millilitri. Quindi utilizzare una pipetta per pasta fresca per trasferire la fase inferiore in una provetta appropriata, maggiore o uguale a una provetta resistente al cloroformio da 15 millilitri, e posizionarla sul ghiaccio mantenendo la provetta con la fase di metanolo dell'acqua sul ghiaccio. Far evaporare il metanolo dirigendo un flusso di azoto secco nella soluzione di estratto.

Terminare il processo di evaporazione quando l'azoto bolle. Non provoca più una riduzione del volume nella soluzione estratta. Dopo aver posizionato la provetta con la fase di cloroformio di metanolo sul ghiaccio, far evaporare il metanolo dirigendo un flusso di azoto secco sulla superficie della soluzione di estratto.

Quando tutto il solvente è evaporato, chiudere la provetta e mantenere il campione a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi NMR. Per preparare la fase acquosa per la liofilizzazione, trasferire il campione acquoso in una provetta da centrifuga da 50 millilitri accuratamente risciacquata. Quindi congelare la soluzione estratta ruotando la provetta da centrifuga in azoto liquido in modo tale che la superficie interna della provetta sia progressivamente coperta dal liquido congelato.

Quando tutto il liquido è congelato, coprire il tubo con un tappo a vite forato per consentire la fuoriuscita del vapore e posizionare il tubo in un flacone con filtro sottovuoto a collo largo. Dopo aver collegato la bottiglia al liofilizzatore, avviare la liofilizzazione, terminare il processo di liofilizzazione. Quando il campione è completamente asciutto, conservarlo a meno 80 gradi Celsius in una provetta chiusa fino a quando non viene utilizzato per l'analisi NMR.

Per l'analisi NMR al fosforo dei fosfolipidi, sciogliere i lipidi essiccati in 700 microlitri di una miscela da cinque a quattro a uno di metanolo cloroformio deuterato e una soluzione acquosa di CDTA da 200 millimolari. Trasferire il campione in una provetta per microcentrifuga utilizzando una micropipetta a spostamento diretto con punta resistente al cloroformio. A questo punto, impostare la regolazione della temperatura della sonda NMR sul valore target desiderato, che di solito è di 25 gradi Celsius centrifuga.

La soluzione di estratto fosfolipidico a quattro gradi Celsius e 11.000 g per 30 minuti per centrifugare i residui solidi nel campione. Al termine, trasferire 600 microlitri di super natin in una provetta NMR di alta qualità con un diametro esterno di cinque millimetri. Preparare lo stelo dell'inserto coassiale appropriato riempito con una soluzione acquosa di 20 millimolari di metilene difosfato a pH 7,0 per il riferimento e la quantificazione dello spostamento chimico.

Inserire questo inserto nella provetta NMR riempita con la soluzione di estratto di fosfolipidi. Quindi, montare il tubo NMR con l'apposito ogiva e trasferirlo sul magnete NMR. Far girare il campione a una velocità compresa tra 15 e 20 hertz dopo aver atteso che il campione si sia adattato alla temperatura impostata.

Ridurre al minimo il campo magnetico in omogeneità attraverso il campione regolando le correnti della bobina di spessore sull'asse e fuori asse, impostare i parametri di acquisizione dello spettro NMR sui valori ottimali, che possono variare in funzione dell'intensità del campo magnetico. Una volta terminata l'acquisizione dello spettro, processare il decadimento dell'induzione libera utilizzando parametri ottimizzati per ottenere i migliori risultati per l'intera gamma di risonanze fosfolipidiche. Ripetere l'elaborazione utilizzando almeno due diverse procedure di filtraggio.

Infine, filtra segnali molto deboli e ampi senza sovrapposizioni significative per aumentare il rapporto segnale/rumore. In questo esperimento, sono state ottenute linee spettrali estremamente strette per tutte le regioni spettrali analizzate anche in regioni molto affollate. I picchi a una distanza inferiore a 0,01 P PP M sono quasi completamente separabili a 400 megahertz.

Di conseguenza, l'analisi qualitativa e quantitativa dei numerosi picchi piccoli, ma attualmente non assegnati, può essere prevista nel futuro restringimento della linea scegliendo 1000 millimolari invece di 200.Millimolare. La CDTA è stata desiderata, ma ha portato alla sovrapposizione del restringimento della linea dei segnali fosfolipidi scegliendo 277 Kelvin invece di 297. Kelvin era desiderato, ma ha anche portato alla sovrapposizione di segnali fosfolipidici.

Una diminuzione della concentrazione di CDTA da 200 millimolari a 50 millimolari si traduce solo in un modesto aumento della larghezza della linea e in quasi nessun cambiamento negli spostamenti chimici. Tuttavia, si noti che la concentrazione tissutale nell'estratto CDTA da 50 millimolari è la metà di quella nell'estratto CDTA da 200 millimolari. Spiegando le linee relativamente strette, è stato rilevato un gran numero di fosfolipidi quantificabili che coprono un intervallo di concentrazione considerevole.

La risoluzione spettrale è persino sufficiente per rilevare regolarmente la suddivisione parziale di determinati picchi. Di conseguenza, in futuro si potrà prevedere un'analisi qualitativa e quantitativa di ulteriori sottogruppi fosfolipidici. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di eseguire ogni singolo passaggio con estrema cura per garantire un'analisi ottimale dei metaboliti.