Name: In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri l'imaging in vivo del rimodellamento neuronale specifico dello stadio dauer in Caenorhabditis elegans. Questo metodo combina estrazione di feromone, induzione controllata e microscopia a fluorescenza per studiare la neuroplasticità.

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Ringrazio la dottoressa Maureen Barr, sotto la cui supervisione è stato inizialmente caratterizzato il fenotipo di rimodellamento di IL2. Grazie al Dr. C. Britt Carlson per la lettura critica del manoscritto. I finanziamenti nel laboratorio di Barr provenivano dal NIH (5R01DK59418) e da borse di studio post-dottorato dall'USDA (2010-65106-20587) e dalla New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). L'attuale finanziamento per questo lavoro proviene da una sovvenzione FIRE dell'Università dell'Illinois Urbana-Champaign College of ACES.

1 Crude Dauer feromone Produzione <ol><li> Grow OP50 E. coli da una singola colonia O / N a 37 ° C sotto agitazione in 100 ml di brodo LB a 200 rpm. NOTA: Questo / cultura O N può essere fatta in anticipo e conservato a 4 ° C. </li><li> Grow N2 C. elegans il 15-20 Giugno piatti cm Petri con NGM agar (vedi ricetta nella tabella 1), testa di serie con 50 ml di OP50 E. coli fino a quando il batterio è quasi esaurito 19. </li><li> Fai 5x 250 ml di S supporti (vedi ricetta nella tabella 1) in 1 L beute 19. NOTA: Questa soluzione può essere effettuato in anticipo. </li><li> Coltivare una cultura di OP50 E. coli in 4 l di brodo LB O / N inoculando con 1 ml di OP50 in E. coli e agitazione a 37 ° C per 16 ore. </li><li> Lavare i nematodi da piastre (passo 1.2) con 1 ml di soluzione S basale (vedi ricetta nella tabella 1) e di trasferimento nematodi 4-5 piastre in ciascuna delle 4 1 L Erlenmeyer palloni con i media S preparata al punto 1.3 (a 4 5 piattiper ogni pallone) 19. </li><li> Centrifugare la OP50 dal punto 1.4 a 650 xg per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere ogni pellet batterico in 10 ml di soluzione S basale. Trasferire la stessa quantità di batteri risospese ad ogni pallone di nematodi. </li><li> Collocare i flaconi in un agitatore orbitale a temperatura ambiente (20 - 25 ° C) e 100 - 150 rpm per 4 - 5 giorni fino a quando la soluzione inizia a cancellare, indicando una deplezione di cibo. </li><li> Una volta che il cibo è esaurito, crescerà un&#39;altra cultura O / N di OP50 E. coli in 4x 1 l di brodo LB. Centrifugare i batteri a 650 xg per 10 minuti e aggiungere una pallina da un pallone a ciascuno dei palloni S multimediali con nematodi. Restituire i palloni S media per l&#39;agitatore orbitale, come al punto 1.7, per altri 3-4 giorni fino a quando il cibo si esaurisce di nuovo. </li><li> Dai ~ 1 ml aliquota della soluzione da ciascuna beuta e stimare la concentrazione nematode da sub-campionamento 1 microlitri da ogni 1 ml aliquota e contando il numero di nematodi. NOTA: L&#39;popolazione di nematodi dovrebbe essere 50.000 - 75.000 nematodi / ml. A questa concentrazione la maggior parte dei nematodi sono dauers. </li><li> Eliminare eventuali fiaschi contaminati. NOTA: La contaminazione si manifesta frequentemente come ife fungine visto durante la fase 1.9. </li><li> Nematodi Centrifugare a 4000 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il pellet nematode e conservare il surnatante. In alternativa, consultare la discussione per l&#39;utilizzo di questi animali per fare un feromone a bassa potenza. </li><li> Filtrare il surnatante con # 1 carta da filtro Whatman. NOTA: Una boccetta di vuoto sarà accelerare questo processo. </li><li> Inoltre Filtrare il surnatante con unità di filtrazione a vuoto sterile 0,45 micron. NOTA: filtrato può essere conservato O / N a 4 ° C o procedere a 1.14. </li><li> Aggiungere il filtrato in un becher da 2 L con un ancoretta. Mettere in una cappa su una piastra riscaldante scalpore. Portate ad ebollizione mescolando ed evaporare a circa 200 ml. Trasferire la soluzione in un becher da 500 ml. Continuare l&#39;ebollizione fino a circa 50 ml sono left. NOTA: Si deve prestare attenzione durante questa fase in quanto è possibile per la soluzione a bollire sopra. Il colore finale 50 ml è un marrone scuro. In qualsiasi momento durante il processo di cottura, il calore può essere spento e il filtrato O / N conservato a temperatura ambiente oa 4 ° C. </li><li> Lasciate raffreddare e centrifugare per 5 minuti a 1000 x g. Versare il surnatante in un becher da 100 ml e scartare il pellet. </li><li> Lessare il surnatante verso il basso per una crosta marrone. Togliere dal fuoco e rompere la crosta con una spatola. Aggiungere sufficiente etanolo 200 prova a coprire la crosta. Coprire il becher con Parafilm e lasciate riposare O / N a RT. Eliminare l&#39;etanolo in un bicchiere pulito e messo a lato. Aggiungere etanolo fresco per coprire la crosta. Ripetere estrazioni O / N 3 volte. Si riuniscono gli estratti. </li><li> Utilizzare una pompa a vuoto per asciugare gli estratti di etanolo. Se una pompa a vuoto non è disponibile, aggiungere l&#39;estratto etanolico di un becher pulito e caldo a 50 ° C sotto agitazione in una cappa aspirante. NOTA: Una volta che l&#39;etanolo è evaporato un residuo appiccicoso di light colore marrone deve rimanere. Se si usa il riscaldamento, la cura dovrebbe essere presa per non bruciare la soluzione di riscaldamento per troppo tempo. </li><li> Disciogliere il residuo in 10 ml di acqua distillata sterile. Filtro sterilizzare questa soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron e conservare a -20 ° C in aliquote di 1 ml. NOTA: 1 ml di acqua viene utilizzata per sciogliere il residuo per ogni 100 ml di coltura nematode liquido originale. Ad esempio, se una delle fiasche di coltura liquido viene scartato a causa della contaminazione, quindi regolare la quantità di acqua utilizzata per sciogliere il residuo. </li></ol> 2 Determinazione del feromone Dose Response <ol><li> Preparare dauer feromone facendo 6x 5 ml di NGM media con Noble agar senza peptone, e integrato con 50 mg / ml di streptomicina solfato e una serie di dauer feromone (vedi ricetta in Tabella 1) 4, 19. Miscelare i componenti in un 13x100 mm provetta di vetro, bollire sopra un becco Bunsen, e poi versare in tre centimetri piastre di Petri. </li><li> Pesare amtubo icrocentrifuge. Aggiungere 1 ml di O / N coltura di E. coli OP50 al tubo e centrifugare a ~ 17.000 xg in una provetta. Rimuovere tutto il surnatante. Pesare nuovamente il tubo e determinare il peso del pellet batterico. Risospendere il pellet con tampone M9 (vedi ricetta in Tabella 1) per una concentrazione finale di 4% (w / v). Aliquotare 10 microlitri della sospensione batterica sul centro di ciascuna piastra feromone 4. Conservare le piastre O / N a RT. </li><li> Scegli 10-15 gravide N2 wild-type ermafroditi un giorno dopo la muta in età adulta sulle piastre feromoni 4. Conservare le piastre a 25 ° C per 3 - 4 ore. </li><li> Scegli fuori tutti i ermafroditi adulti. Registrare il numero di uova deposte per ogni piatto. Sigillare le piastre con parafilm e ritornare a 25 ° C per 3 giorni 17. </li><li> Contare la percentuale di dauers (Figura 2). Nota: Per entrambi i metodi, è importante notare che dauers (e ad un ex minoretenda non dauers) salirà sulle pareti e sul coperchio delle piastre di Petri. E &#39;quindi importante esaminare tutte le superfici del piatto per nematodi. </li><li> Montare i dati ad una curva dose-risposta e stimare la concentrazione CE 90 del feromone (feromone sufficiente ad indurre il 90% degli animali per formare dauers) come mostrato in Figura 3 Nota:. Usiamo tipicamente un modello di regressione logistica per stimare la CE 90 , ma diversi pacchetti software statistici possono avere metodi alternativi che producono stime simili. </li></ol> 3 Immagini dal vivo di Dauer IL2 neuroni <ol><li> Preparare piatti dauer feromoni come nel protocollo 2 utilizzando il valore EC 90 determinata al punto 2.6. </li><li> Indurre dauers utilizzando i metodi del protocollo 2 con un ceppo che trasporta un giornalista transgene integrato IL2 (myIs13 [P klp-6 :: GFP], myIs14 [P klp-6 :: GFP], myIs16 [P <em&gt; KLP-6 :: tdTomato] o qIs56 [P lag-2 :: GFP]) 12, 20, 21. NOTA: Se si utilizza q Is56, espressione di GFP non sarà visibile nei IL2Qs fino a diverse ore nel molt dauer e alcuni degli eventi di rimodellamento iniziali non saranno visibili. Inoltre, mentre il segnale fluorescente dalla P lag-2 :: GFP transgene è in definitiva più luminoso nelle IL2s durante dauer rispetto ai 6 KLP-reporter fluorescenti P, la P lag-2 :: transgene GFP esprime anche debolmente nei muscoli della testa che può mascherare i bei rami IL2. </li><li> Dopo la deposizione delle uova, rimuovere gli ermafroditi adulti, sigillare le piastre con Parafilm e incubare per 34 ore a 25 ° C 17. NOTA: La lunghezza del tempo per la muta dauer varia leggermente da individuo a individuo. La rapida periodo più di dendrite arborizzazione inizia 4-5 ore dopo l&#39;inizio della muta dauer (39-44hr dopo la deposizione delle uova a 25 ° C) 12. </li><li> Il giorno prima di imaging, costituiscono una soluzione di 10% (w / v) agarosio in tampone M9 con dauer feromone alla concentrazione CE 90. Aliquota circa 100 ml di agarosio su un vetrino da microscopio e rapidamente, ma delicatamente, posizionare un&#39;altra diapositiva in alto per creare una superficie piana agarosio. Dopo l&#39;agarosio si è solidificato, avvolgere le diapositive saran wrap e conservare in una camera umida (scatola punta della pipetta con tovaglioli di carta bagnati). </li><li> Dopo il periodo di incubazione 34 ore, esaminare le piastre di feromone per nematodi che hanno smesso faringeo pompaggio. Scivoli separati in modo tale che una sola superficie di un vetrino ha agarosio su di esso. Scegli uno o più nematodi su un pad agarosio del 10% e 1 μ l di 0,1 micron sferette di polistirene 22. NOTA: Con una popolazione ben sincronizzato, la maggior parte dei nematodi sul piatto entrerà nella muta da L2D a dauer. Tuttavia, ci possono essere variazioni tra individuals. E &#39;quindi importante notare funzionalità aggiuntive (stoma occlusione, faringeo rimodellamento) per stimare la quantità di tempo che gli animali sono stati all&#39;interno della muta dauer (vedi risultati rappresentativi per esempio). </li><li> Determinare l&#39;orientamento (sinistra / destra, dorsale / ventrale) del nematode. Cattura immagini di Z-stack di un dendrite IL2Q ad ingrandimento 100X con la possibile intensità di fluorescenza più basso ogni 15 minuti o quando necessario per l&#39;esperimento specifico. Continuare a catturare immagini fino a quando il nematode ha separato dalla cuticola L2D e immobilizzazione è impossibile o se l&#39;animale si riprende da dauer (faringe comincia pompaggio). Quando non l&#39;imaging attivamente, posizionare il vetrino in una camera umida. NOTA: Usiamo un microscopio epifluorescente con un contrasto di interferenza differenziale di fase e motorizzato (DIC) ottica. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Un esame della neuroplasticità specifici per dauer e altri cambiamenti morfologici Dauer-associata richiede controllata e affidabile di formazione dauers sia attraverso la mutazione genetica (cioè mutanti, DAF-C) o in caso di esposizione di wild-type animali a feromone. Mentre l&#39;uso di una mutazione genetica per indurre dauers è conveniente, può confondere risultati. Pertanto, i dati raccolti con mutazioni daf-c devono essere successivamente confermati con wild-type animali indotti ad entrare nella...

Plasticità fenotipica, tra cui plasticità evolutiva e comportamentale, è importante per adattamenti alle condizioni ambientali avverse ed è considerato una forza trainante nell&#39;evoluzione 1. C. elegans è un organismo modello utilizzato frequentemente per gli studi di sviluppo e neurobiologia. In condizioni ideali, C. elegans si sviluppa attraverso quattro stadi larvali prima di entrare nella fase riproduttiva adulto. Tuttavia, in condizioni di scarsa disponibilità di cibo e di alta densità di popolazione, C. elegans può subire un interruttore di sviluppo e di entrare in una fase di lunga durata e resistente alle sollecitazioni dauer 2. Dauers mostrano molte differenze morfologiche e comportamentali da non dauers che probabilmente mediano questa resistenza allo stress. Gli stimoli ambientali e percorsi genetici che regolano l&#39;ingresso dauer sono stati ampiamente descritti 3, 4, 5, 6, 7. Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano le singole modifiche fenotipiche che si verificano durante formazione dauer sono meno ben compreso. L&#39;esame di fenotipi specifici-Dauer richiede la produzione di animali Dauer. Questo può essere realizzato in tre modi: 1) Picking da una cultura affamato di C. elegans, 2) Uso della formazione dauer costitutiva (daf-c) mutanti, 3) induzione della formazione dauer attraverso feromone purificato. E &#39;relativamente semplice per scegliere dauers da una piastra standard NGM con una C. popolazione elegans che ha esaurito il suo batterica di approvvigionamento alimentare. Nelle nostre mani, una piastra standard NGM originariamente seminato con 50 ml di OP50 Escherichia coli, ha permesso di crescere per 3 giorni e successivamente inoculate con 3 - 4 adulti ermafroditi mantenuta a 25 ° C, si esaurirà la fornitura di cibo entro una settimana e produrre diverse migliaia dauers all&#39;interno di un ulteriore 3 giorni (oltre a numerosi non-dauers affamati). Tuttavia, questo metodo non è soddisfacente per i processi che si verificano durante l&#39;esame muta in dAuer. E &#39;difficile determinare quale delle diverse migliaia di animali su un piatto tipico Starved stanno entrando in dauer. Inoltre, l&#39;uso di una piastra di fame non offre alcuna possibilità di sincronizzazione. L&#39;uso di mutanti daf-c consente la sincronizzazione e la generazione affidabile di dauers. Tuttavia, non vi è alcuna garanzia che una particolare daf-c mutazione non influirà altri fenotipi specifici-Dauer da solo o in combinazione con altre mutazioni. La presenza di un feromone dauer stato implicito Cassada e Russell e successivamente dimostrato da Golden e Riddle. Il feromone dauer da allora è stato caratterizzato chimicamente 2, 8, 9, 10. Feromone purificato è costituito da una miscela complessa di ascarosides, che in forme diverse a regolare entrambi i processi comportamentali e di sviluppo 9, 11. L&#39;uso di un estratto di feromone greggio dauer permette di induzione affidabile controllata di dauers sincronizzati in uno sfondo wild-type. </p&gt; Il sistema nervoso e le cellule gliali associate subiscono rimodellamento durante dauer larva formazione 12, 13, 14. Alcuni di questi cambiamenti sono irreversibili, come ad esempio la ristrutturazione delle cellule gliali durante dauer 13, 14. Tuttavia altri eventi di rimodellamento sono reversibili dopo un ritorno favorevole condizioni ambientali. Ad esempio, una serie di quattro neuroni IL2Q subiscono una rapida e reversibile rimodellamento neuronale durante la formazione dauer tra cui: arborizzazione dei dendriti, un passaggio da singolo dendritiche ai neuroni e assoni multidendritic rimodellamento 12. I metodi consentono qui per imaging attendibile in vivo di neuroplasticità indotta da stress in un organismo modello. I metodi presentati per la produzione e la sperimentazione di greggio dauer feromone sono precedentemente descritti e compilati da diverse fonti 4, 8, 15, 16, 17, 18.

<table><tbody><tr><td>N2 C. elegans Bristol ceppo</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III Su</td><td>richiesta del laboratorio</td><td></td><td></td>Schroeder</tr><tr><td>PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V</td><td>Su richiesta del laboratorio</td><td></td><td></td>Schroeder</tr><tr><td>JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Tritech Research</td><td>60 mm T3308, 35 mm T3501</td><td></td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Vari</td><td></td><td>3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g peptone in 975 ml H2O autoclavato raffreddato a 55&deg; C seguito da 1 ml di colesterolo 5 mg/ml in etanolo, 25 ml di tampone 1 M KPO4 (pH 6,0), 1 ml di 1 M CaCl2, 1 ml di 1 M MgSO4</td></tr><tr><td>S I</td><td>vari</td><td></td><td>terreni S sono costituiti da una soluzione basale S (1,46 g di NaCl, 0,25 g di K2HPO4, 1,5 g di KH2PO4, 0,25 ml di colesterolo 5 mg/ml in etanolo e H2O a 250 ml. Alla soluzione basale S aggiungere 2,5 ml di citrato di potassio pH 6,0 (2 g di acido citrico monoidrato, 29,4 g di citrato tripotassico monoidrato, H2O a 100 ml, sterilizzato in autoclave), 2,5 ml di soluzione di metalli in tracce (1,86 g di EDTA disodico, 0,69 g di FeSO4&nbsp; e toro; 7 H2O, 0,2 g MnCl2&toro; 4 H2O, 0,29 g ZnSO4&nbsp; e toro; 7 H2O, 0,025 g CuSO4&nbsp; e toro; 5 H2O, H2O a 1 L. Autoclavato e conservato al buio), 0,75 ml di 1 M CaCl2 e 0,75 ml di 1 M MgSO4.</td></tr><tr><td>Piastre di feromoni Dauer per saggio dose-risposta</td><td>Varie</td><td></td><td>Miscele 0,085 g di agar nobile, 0,5 ml di NaCl 0,513 M e 5 &micro; l di 5 mg/ml di colesterolo sciolto in etanolo in ciascuna delle 6 provette da 15 ml. Aggiungere una quantità sufficiente di feromone grezzo a ciascuna provetta per creare una gamma di concentrazioni. Aggiungere H2O per portare il volume a 4,725 ml. Far bollire su un bruciatore Bunsen fino a quando l'agar non si sarà sciolto e poi raffreddare a 55 °C. Aggiungere 125 &5; l 1 M KPO4 tampone (pH 6,0), 50 &; micro; l 0,1 M CaCl2, 50 &micro; l 0,1 M MgSO4 e 50 &micro; l di 5 mg/ml di streptomicina solfato in ciascuna provetta. Versare il contenuto di ogni tubo in una capsula Petri di 35 mm di diametro. Lasciare solidificare l'agar a temperatura ambiente per una notte (se più a lungo, conservare in un contenitore chiuso per evitare un'eccessiva essiccazione).</td></tr><tr><td>Microsfere 0,1 micron</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876-15</td><td></td></tr><tr><td>M9 tampone</td><td>Varie</td><td></td><td>Miscela 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 litro. Sterilizzare in autoclave</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging di dauer-specifica neuronale ritocca in c. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

I meccanismi che controllano lo stress-indotta plasticità fenotipica di animali sono spesso complesse e difficili da studiare in vivo. Un classico esempio di plasticità indotta da stress è la fase dauer di C. elegans. Dauers sono uno stadio larvale di sviluppo alternativo formata in condizioni di basse concentrazioni di cibo batterica e alte concentrazioni di un feromone dauer. Dauers visualizzare ampia plasticità evolutiva e comportamentale. Ad esempio, un set di quattro quadranti interno-labiale (IL2Q) neuroni soggetta ad un esteso rimodellamento reversibile durante la formazione dauer. Utilizzando la ben nota voce di percorsi ambientali di regolazione dauer, un metodo precedentemente stabilito per la produzione di greggio dauer feromone da grandi culture nematodi liquido è dimostrata. Con questo metodo, una concentrazione di 50.000 - 75.000 nematodi / ml di coltura liquido è sufficiente a produrre una molto potente greggio dauer feromone. La potenza feromone greggio è determined da un saggio biologico dose-risposta. Infine, sono descritti i metodi utilizzati per in vivo time-lapse imaging dei IL2Qs durante la formazione dauer.

La produzione di greggio risultati dauer feromoni in un liquido giallo (Figura 1) che è sia caldo e freddo stabile. Aliquote di feromone greggio vengono conservati a -20 ° C indefinitamente senza perdita evidente di attività. In seguito la produzione di feromoni, un unico biotest dose-risposta è sufficiente per una stima approssimativa di potenza. Tuttavia, per la maggior parte degli esperimenti è necessario ripetere il saggio biologico 2 - 3 volte e prendere una media di ciascun esperimento. I risultat...

A seguito dell'esposizione a specifici fattori di stress ambientale, il nematode Caenorhabditis elegans subisce un'ampia plasticità fenotipica per entrare in uno stadio giovanile 'dauer' resistente allo stress. Presentiamo metodi per l'induzione controllata e l'imaging della neuroplasticità durante il dauer.

In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare il rimodellamento specifico della dote dei neuroni sensoriali nell'eleganza del mare. Ciò si ottiene estraendo prima il feromone di acido grezzo dalla coltura liquida. Il secondo passo consiste nel misurare la potenza del feromone grezzo.Successivamente, il feromone viene utilizzato per indurre la formazione di acidità nell'animale che esprime GFP nei due neuroni IL. Il passaggio finale consiste nel montare l'animale sul vetrino del microscopio durante la fase DMT ed eseguire l'imaging dal vivo per mostrare l'arborizzazione dei dendriti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuroplasticità, come ad esempio il modo in cui i neuroni si rimodellano in risposta alle condizioni ambientali.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul rimodellamento IL due, può essere applicato anche ad altri eventi specifici del daer come il rimodellamento faringeo. Per iniziare questa procedura, coltivare l'OP 50 e coli da una singola colonia durante la notte a 37 gradi Celsius agitando 100 millilitri di brodo di libbra a 200 giri/min. Quindi far crescere l'eleganza N two C su piastre di Petri da

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Questo protocollo descrive un metodo affidabile per l'anestesia e l'imaging di...

Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Un semplice dispositivo microfluidico è stato sviluppato per eseguire anestetico...

Semplici dispositivi microfluidici per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Fonte: Doser, R., et al. Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Questo video mostra l'imaging in vivo del flusso di calcio subcellulare nei neuroni del cordone nervoso ventrale dei ceppi transgenici di Caenorhabditis elegans. Vengono impiegati due indicatori di calcio distinti: un indicatore citoplasmatico in un ceppo e un indicatore mitocondriale in un altro. I neuroni vengono osservati al microscopio a fluorescenza per monitorare in tempo...

Imaging della dinamica subcellulare del calcio nei neuroni di Caenorhabditis elegans

Con il suo piccolo corpo trasparente, ben documentato neuroanatomia e una serie di tecniche genetiche suscettibili e...

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

L'imaging del comportamento e dell'attività neurale su scale temporali lunghe senza immobilizzazione dell'animale è un prerequisito per comprendere il comportamento. L'imaging delle camere microfluidiche di agarosio (AMI) può essere utilizzato per visualizzare l'attività neurale e il comportamento per tutte le fasi della vita di Caenorhabditis elegans.

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Qui, presentiamo un approccio combinatorio utilizzando microscopia ad alta risoluzione, strumenti computazionali, e l'etichettatura a cella singola in vivente embrioni C. elegans per comprendere le singole dinamiche delle cellule durante il neurosviluppo.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Le spine dendritiche sono importanti caratteristiche cellulari del sistema nervoso. Qui vengono descritti metodi di imaging dal vivo per valutare la struttura e la funzione delle spine dendritiche in C. elegans. Questi approcci supportano lo sviluppo di schermi mutanti per i geni che definiscono la forma o la funzione della colonna vertebrale dendritica.

Imaging delle spine dendritiche in Caenorhabditis elegans

È stato presentato un protocollo per l'imaging dei microtubuli dinamici in vivo utilizzando una proteina legante finale etichettata fluorescentemente. Abbiamo descritto i metodi per etichettare, immaginare e analizzare i microtubuli dinamici nel neurone del microtubulo laterale posteriore (PLM) di C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

Il protocollo descrive una semplice progettazione di chip microfluidici e una metodologia di microfabbricazione utilizzata per coltivare C. elegans in presenza di una fornitura continua di cibo fino a 36 ore. Il dispositivo di crescita e imaging consente inoltre l'imaging intermittente ad alta risoluzione a lungo termine dei processi cellulari e subcellulari durante lo sviluppo per diversi giorni.

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Scopri l'imaging in vivo del rimodellamento neuronale specifico dello stadio dauer in Caenorhabditis elegans. Questo metodo combina estrazione di feromone, induzione controllata e microscopia a fluorescenza per studiare la neuroplasticità.

In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

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