In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans
4 settembre 2014
A seguito dell'esposizione a specifici fattori di stress ambientale, il nematode Caenorhabditis elegans subisce un'ampia plasticità fenotipica per entrare in uno stadio giovanile 'dauer' resistente allo stress. Presentiamo metodi per l'induzione controllata e l'imaging della neuroplasticità durante il dauer.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare il rimodellamento specifico della dote dei neuroni sensoriali nell'eleganza del mare. Ciò si ottiene estraendo prima il feromone di acido grezzo dalla coltura liquida. Il secondo passo consiste nel misurare la potenza del feromone grezzo.
Successivamente, il feromone viene utilizzato per indurre la formazione di acidità nell'animale che esprime GFP nei due neuroni IL. Il passaggio finale consiste nel montare l'animale sul vetrino del microscopio durante la fase DMT ed eseguire l'imaging dal vivo per mostrare l'arborizzazione dei dendriti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuroplasticità, come ad esempio il modo in cui i neuroni si rimodellano in risposta alle condizioni ambientali.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul rimodellamento IL due, può essere applicato anche ad altri eventi specifici del daer come il rimodellamento faringeo. Per iniziare questa procedura, coltivare l'OP 50 e coli da una singola colonia durante la notte a 37 gradi Celsius agitando 100 millilitri di brodo di libbra a 200 giri/min. Quindi far crescere l'eleganza N two C su piastre di Petri da 15 a 26 centimetri con NGM Agar seduto con 50 microlitri di e coli fino a quando i batteri non sono quasi esauriti.
Successivamente, coltiva una coltura di e coli in quattro litri di brodo LB inoculando un millilitro di Coli e agitando a 37 gradi Celsius per 16 ore. Successivamente, lavare i nematodi dalle piastre con un millilitro di soluzione di basilico S. Trasferire da quattro a cinque piastre di nematodi in un pallone di erlenmeyer da un litro di media S, centrifugare l'e coli a 650 g per 10 minuti e rimuovere il surnatante resus, sospendere ogni pellet batterico in 10 millilitri di soluzione di basilico S.
Successivamente, trasferire quantità uguali di batteri risospesi in ogni fiaschetta di nematodi. Posizionare il pallone su un agitatore orbitale a temperatura ambiente a 100-150 giri/min per quattro giorni fino a quando la soluzione inizia a chiarificarsi, il che indica un esaurimento del cibo. Una volta esaurito il cibo, coltiva l'e coli in quattro colture di un litro di libbra di brodo durante la notte.
Quindi centrifugare i batteri a 650 Gs per 10 minuti. Aggiungere i pellet batterici ai flaconi di terreno S con i nematodi e rimettere tutti i flaconi di terreno S nella camera orbitale per altri tre o quattro giorni fino a quando il cibo non si esaurisce di nuovo. Successivamente, trasferire un'aliquota di un millilitro di soluzione in una piastra di Petri e contare il numero di nematodi al microscopio da dissezione.
Quindi, centrifugare i nematodi a 4.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il pellet di nematode e conservare il surnatante. Quindi filtrare il surnatante attraverso la carta da filtro watman numero uno. Filtrare ulteriormente il surnatante attraverso unità di filtrazione sottovuoto sterili a punto 45 micrometri.
Successivamente, aggiungere il filtrato in un becher da due litri con l'ancoretta di combustione. Metterlo su una piastra di cottura in una cappa aspirante, portare a ebollizione mescolando ed evaporare a circa 200 millilitri. Successivamente, trasferire la soluzione in un becher da 500 millilitri e continuare a far bollire fino a quando non rimangono circa 50 millilitri.
Lasciate raffreddare e centrifugate per cinque minuti a 1000 Gs.Quindi versate il naceto in un becher da 100 millilitri e scartate il pellet. Quindi, fai bollire il cnaccio fino a ottenere una crosta marrone. Togliete dal fuoco e rompete la crosta con la spatola Dopo.
Aggiungere una quantità sufficiente di etanolo a 200 gradi per coprire la crosta. Coprite il bicchiere con la paraforma e lasciatelo riposare per una notte a temperatura ambiente. Quindi versare l'etanolo in un bicchiere pulito e metterlo da parte.
Aggiungere etanolo fresco per coprire la crosta e ripetere le estrazioni notturne tre volte, seguite dal raggruppamento degli estratti. Successivamente, utilizzare una pompa a vuoto per essiccare gli estratti di etanolo. Se non è disponibile una pompa per vuoto, aggiungere l'estratto di etanolo in un becher pulito e scaldarlo a 50 gradi Celsius mescolando in una cappa aspirante.
Quindi sciogliere il residuo in 10 millilitri di acqua distillata sterile. Sterilizzare questa soluzione con una siringa da 22 micrometri, filtrare e conservare a meno 20 gradi Celsius in un millilitro. Un watt.
In questa procedura, pesare una provetta da microcentrifuga. Aggiungere un millilitro di coltura notturna di equalizzare alla provetta e centrifugare a 17.000 Gs.Quindi rimuovere tutto lo snat. Pesare nuovamente il tubo e determinare il peso del pellet batterico.
Successivamente, risospendere il pellet con tampone M nine per una concentrazione finale del 4% in peso per volume. Aliquotare 10 microlitri di sospensione batterica al centro di ciascuna piastra di feromoni e conservare le piastre per una notte. A temperatura ambiente.
Trasferire da 10 a 15 gravitt in ermafroditi di tipo selvatico sulle piastre di feromoni un giorno dopo la muta dell'età adulta. Conservare le piastre a 25 gradi Celsius per tre o quattro ore. Quindi elimina tutti gli ermafroditi adulti.
Registra il numero di uova deposte per ogni piatto. Sigillare le piastre con paraform e riportare a 25 gradi Celsius per tre giorni prima di contare la percentuale di esecutori. Ora prepara le piastre di feromoni dell'agente utilizzando il valore EC 90 e induci gli operatori con un ceppo che trasporta un transgene reporter IL due integrato dopo la deposizione delle uova.
Rimuovi gli ermafroditi adulti. Sigillare le piastre con perfil e incubare per 34 ore a 25 gradi Celsius il giorno prima dell'imaging. Preparare una soluzione di agros al 10% in peso per volume in tampone M nove con feromone agente all'aliquota di concentrazione EC 90.
Circa 100 microlitri di agro su un vetrino da microscopio e posizionare rapidamente ma delicatamente un altro vetrino sopra per creare una superficie agro piatta Dopo che l'agros si è solidificato, separare i vetrini. Avvolgeteli nella pellicola di saran e conservateli in una camera di umidità. Dopo il periodo di incubazione di 34 ore, esaminare le piastre a feromoni per i nematodi che hanno interrotto il pompaggio faringeo.
Separare le diapositive in modo che solo una superficie della diapositiva abbia aros su di essa. Trasferire uno o più nematodi su un tampone al 10% con un microlitro di perle di polistirene da 0,1 micron, quindi determinare l'orientamento del nematode. Cattura le immagini Zack di un dendrite IL due Q con ingrandimento 100x con l'intensità di fluorescenza più bassa possibile ogni 15 minuti o secondo necessità per l'esperimento specifico.
Questa figura mostra le micrografie della vista laterale destra DIC dell'eleganza C durante le diverse fasi dello stampo dour. Questo è un animale L due con un tipico bulbo faringeo terminale arrotondato. Circa tre ore dopo la muta in dote, il bulbo terminale si sta restringendo e la cuticola L 2D sta iniziando a staccarsi dalla cuticola della dote appena formata.
Circa 10 ore dopo l'inizio della muta dell'agente, l'animale ha subito un esteso restringimento radiale e il distacco dalla cuticola L 2D. Occasionalmente, il dotto escretore rivestito di cuticole dello stadio L 2D può ancora essere visto attaccato alla dote in via di sviluppo. Qui è mostrata la micrografia epi fluorescente con vista laterale di un singolo animale che esprime il reporter IL due.
Questi riquadri mostrano i dendriti IL due Q in vari punti temporali dopo l'inizio della muta della dote. Una rapida dei due rami Q IL si verifica circa cinque ore dopo l'inizio della muta dell'esecutore. Quando si tenta di purificare il feromone dell'agente, è importante ricordare di utilizzare una tecnica sterile per prevenire la contaminazione.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare e valutare la potenza del feromone grezzo della dote, oltre a utilizzare questo feromone per l'imaging del rimodellamento specifico della dote in vivo.
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'immagine del rimodellamento dei neuroni sensoriali nel nematode Caenorhabditis elegans durante lo stadio dauer, che viene indotto da stress ambientali. I metodi presentati permettono l'induzione controllata dello stadio dauer e successivamente l'acquisizione di immagini in tempo reale per osservare la neuroplasticità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neuroplasticità
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Caenorhabditis elegans può entrare in una fase dauer resistente allo stress.
- Questa fase è caratterizzata da una notevole plasticità fenotipica.
- Comprendere la neuroplasticità in questo contesto può fornire informazioni sulle risposte neuronali ai cambiamenti ambientali.
- Le tecniche di imaging in vivo sono fondamentali per osservare questi cambiamenti in tempo reale.
Scopo dello studio
- Acquisire immagini del rimodellamento dei neuroni sensoriali durante lo stadio dauer.
- Comprendere in che modo gli stress ambientali influenzano la struttura neuronale.
- Contribuire alla più ampia comprensione dei meccanismi di neuroplasticità.
Metodi Utilizzati
- Estrazione del feromone grezzo di dauer da coltura liquida.
- Misurazione della potenza del feromone grezzo.
- Induzione della formazione di dauer in animali che esprimono GFP nei neuroni IL2.
- Acquisizione di immagini in tempo reale dell'arborizzazione dendritica durante lo stadio di dauer.
Risultati principali
- Induzione riuscita della formazione della dauer mediante feromone grezzo.
- Visualizzazione del rimodellamento dei neuroni sensoriali in risposta alle condizioni ambientali.
- Dimostrazione dell'arborizzazione dei dendriti durante lo stadio dauer.
- Conoscenze sui meccanismi di neuroplasticità in C. elegans.
Conclusioni
- I metodi sviluppati forniscono un quadro per lo studio della neuroplasticità in C. elegans.
- I risultati migliorano la comprensione degli adattamenti neuronali allo stress.
- Questa ricerca potrebbe contribuire a studi più ampi sulla neuroplasticità tra diverse specie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente un'induzione controllata e l'acquisizione in tempo reale di rimodellamenti neuronali indotti da stress in un modello geneticamente manipolabile, supportando la validazione di bersagli nella ricerca sulla neuroplasticità. Collegando stimoli ambientali a modifiche strutturali quantificabili in neuroni definiti, fornisce un sistema rilevante per le patologie per la riduzione del rischio meccanicistico dei bersagli del sistema nervoso centrale. L'approccio offre un'elevata affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, consentendo la visualizzazione di adattamenti neuronali funzionali associati ai percorsi di risposta allo stress.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche riguardo al rimodellamento neuronale indotto dallo stress, utilizzando un modello definito di neuroni IL2Q.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante letture di rimodellamento dendritico reversibili e quantificabili.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio collegando la formazione del dauer indotta dai feromoni a una neuroplasticità osservabile.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce un feromone dauer grezzo standardizzato mediante saggio biologico dose-risposta per un'induzione costante dello stadio dauer.
- Output quantitativo: La determinazione dell'EC90 consente un dosaggio preciso del feromone per una caratterizzazione riproducibile dello stadio dauer.
- Scalabilità: Il metodo in coltura liquida fornisce un feromone potente da 50.000–75.000 nematodi/ml, idoneo per applicazioni a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella la plasticità fenotipica indotta da stress, rilevante per i percorsi delle malattie neurodegenerative e dei disturbi psichiatrici.
- Continuità traslazionale: L'imaging in tempo reale dell'arborizzazione dendritica di IL2Q fornisce un biomarcatore quantificabile del rimodellamento neuronale.
- Progressione aggiustata per il rischio: Consente la valutazione degli effetti di composti sulle strutture neuronali sensibili allo stress, prima della validazione nei mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase iniziale della scoperta fino all'identificazione del capostazione, in cui l'induzione ambientale e l'analisi mediante imaging forniscono informazioni sull'interazione con il bersaglio e sulla modulazione del percorso metabolico.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di risposta allo stress mediante induzione controllata della fase dauer e rimodellamento neuronale.
- Screening: Fornisce sistemi biologici pronti per saggi, con potenza del feromone standardizzata e visualizzazione neuronale basata su GFP.
- Analisi: Permette la quantificazione in time-lapse dei cambiamenti nell'arborizzazione dendritica a 100x di ingrandimento, con controlli dell'intensità della fluorescenza.
- Ricerca Translazionale: Collega il rimodellamento indotto dalla fase dauer a meccanismi più ampi di neuroplasticità rilevanti per i disturbi del sistema nervoso centrale umano.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per indagare le risposte neuronali a stimoli ambientali o chimici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione dell'obiettivo attraverso la visualizzazione diretta del rimodellamento neuronale indotto dallo stress.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità mediante estrazione standardizzata di feromoni, test di potenza e definizione delle fasi del dauer.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'interazione con gli obiettivi di neuroplasticità.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei composti in base al rischio, in funzione dei loro effetti sulle strutture neuronali sensibili allo stress.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di C. elegans, nell'induzione della fase dauer e nella microscopia a fluorescenza.
- Necessita di agitatori orbitali, centrifughe, unità di filtrazione e microscopi a fluorescenza per l'acquisizione delle immagini.
- Richiede la standardizzazione dei saggi per la potenza dei feromoni e dei criteri di classificazione delle fasi dauer tra diversi gruppi di lavoro.
- L'adattamento ad altri modelli neuronali richiede la validazione di reporter sotto il controllo di promotori e di paradigmi di stress.
- È limitato dalla finestra temporale di 34 ore per l'acquisizione delle immagini della fase dauer e dalle esigenze di controllo ambientale per garantire un'attività costante del feromone.
