Name: Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Impara la tecnica di coltura organotipica di slice cerebrali e cerebellari per studiare la proliferazione e differenziazione delle cellule della linea oligodendrocitaria. Questo metodo preserva l'architettura tissutale per analisi accurate in vitro.

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Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni della National Multiple Sclerosis Society (RG4179 ad A.N.), del National Institutes of Health (NIH R01NS073425 e R01NS074870 ad A.N.) e della National Science Foundation (A.N.). Ringraziamo il Dr. Frank Kirchhoff (Università del Saarland, Homburg, Germania) per aver fornito PLPDsRed ai topi transgenici. Ringraziamo Youfen Sun per la sua assistenza nel mantenimento della colonia di topi transgenici.

NOTA: Tutte le procedure sugli animali stanno seguendo le linee guida e sono stati approvati dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso l&#39;Università del Connecticut. NOTA: Per questi esperimenti costitutive NG2cre 18 (JAX # 008533) e inducibile NG2creER 16 (JAX # 008538) topi transgenici attraversato dalla A alla Z / EG 19 (JAX # 003920) o gtRosa26: YFP giornalista 20 (JAX # 006148) linee, rispettivamente, sono stati utilizzati di immagine cellule NG2 e la loro progenie. Per immagini oligodendrociti maturi, PLPDsRed topi transgenici 21 sono stati utilizzati. Per la sopravvivenza coerente, fette possono essere isolati da topi fino a 10 giorni dopo la nascita sia dal prosencefalo e il cervelletto. 1 fetta Preparazione <ol><li> In una cappa cultura, posizionare inserti di coltura di tessuti in sei pozzetti e aggiungere 1 ml di fetta di terreno di coltura (ricetta nella sezione reagenti). Mettere le piastre nell&#39;incubatore coltura cellulare a 37 ° C con 5% di CO 2 di almeno 2 ore prima della dissezione. </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti e chopper tessuto con il 70% di etanolo. </li><li> Tampone Bubble dissezione (ricetta nella sezione reagenti) con il 95% O 2, 5% di CO 2 in ghiaccio per almeno 15 minuti prima dell&#39;inizio della dissezione. </li><li> Anestetizzare cuccioli di topo mettendoli in ghiaccio per 5-10 minuti secondo protocolli approvati animali. Accertare la profondità appropriata di anestesia confermando che i topi non rispondono alla coda e pizzicare punta. </li><li> Decapitare animali utilizzando forbici affilate seguenti protocolli di animali. Rimuovere rapidamente il teschio sopra il proencefalo e cervelletto facendo prima un taglio sagittale seguita da incisione laterale, utilizzando strumenti sterilizzati. Tagliare nervi cranici dalla superficie ventrale del cervello e cervelletto rotolando attentamente il tessuto al lato. </li><li> Posizionare il tessuto in un piatto sterile 35 millimetri contenente tampone dissezione ossigenato ghiacciato. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il cervelletto e proencefalo. Poi fare un taglio medio-sagittale through proencefalo e cervelletto, che separa gli emisferi. </li><li> Tagliare 300 micron di spessore sezioni coronali e sagittali del proencefalo e cervelletto con un elicottero del tessuto manuale. NOTA: Un elicottero tessuto manuale permette una rapida trasformazione da dissezione alla cultura incubazione senza la necessità di incorporamento agarosio. Un vibratome può anche essere usato come descritto in precedenza 9. </li><li> Trasferire le fette separate in appena bolle buffer di dissezione a freddo su ghiaccio. </li><li> Utilizzare piccola dissezione o di peso spatole per separare singole sezioni e trasferire loro di preincubato sei piatti e con inserti di cultura. </li><li> Rimuovere eventuali buffer di dissezione in eccesso dalla superficie dell&#39;inserto cultura con una pipetta di trasferimento monouso o un suggerimento P 200 pipetta. Da due a tre proencefalo o tre fettine di cervelletto può essere collocata in un inserto cultura. NOTA: Per i risultati coerenti con le culture del prosencefalo, è ideale per prendere le fette che attraversa il anteriore un terzo del corpo calloso(Figura 1A) al fine di studiare entrambe le regioni materia grigia e bianca nella stessa sezione. Ogni animale di solito produce 6 fette prosencefalo e 6 fette cervelletto. </li><li> Posizionare le sei pozzetti in incubatrice e sostituire il supporto fetta con 1 ml di terreno fetta 1 giorno dopo la preparazione fetta e poi a giorni alterni fino fissazione fetta. </li><li> A seconda dell&#39;esperimento, utilizzare fette dopo 5-7 giorni di coltura. Utilizzare solo le fette che diventano trasparenti dopo i primi giorni e scartare quelli che hanno le regioni opache irregolari. NOTA: le regioni opache all&#39;interno fette sono visibili ad occhio e appaiono come un grumo di cellule scuri sotto a contrasto di fase. Dopo che la tecnica è stato masterizzato, fette opache morti si verificano raramente, in meno del 1-5% di fette. </li></ol> 2 Time-Lapse Imaging di divisione delle cellule NG2 e Oligodendrocyte Differenziazione NOTA: Per eseguire lasso di tempo di imaging della proliferazione delle cellule NG2 e differenziazione usiamo NG2cre: ZEG topi 16che esprimono EGFP in cellule NG2 e la loro progenie (Figura 1C-E). Reporter espressione in questa linea è sufficientemente robusto per ottenere immagini in diretta di GFP + cellule in fettine subito dopo il sezionamento per un periodo di tempo di almeno quattro settimane. Le immagini più chiare sono ottenute dopo il periodo iniziale assottigliamento della fetta, che si verifica durante i primi 3-5 giorni di coltura. <ol><li> Durante l&#39;esperimento, mantenere le fette in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e rimuovere solo per brevi periodi di tempo (meno di 15 min per fetta), mantenendo il coperchio sulla piastra ben sei durante l&#39;imaging. </li><li> Utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito dotato di una fotocamera digitale, catturare immagini al primo punto temporale utilizzando un obiettivo 10X. NOTA: Primi punti di tempo può variare da esperimento e può essere il giorno in cui sono state preparate le fette o in qualsiasi punto nel tempo dopo. </li><li> Cattura immagini da più regioni in punto una volta in entrambe le zone grigie e bianche materia della fetta. Nota the regione ripreso da punti di riferimento specifici all&#39;interno la fetta e mappando la posizione dell&#39;immagine su uno schema che può essere utilizzato per le sessioni di imaging successive. Punti di riferimento utili possono includere bordi delle fette e / o l&#39;orientamento dei tratti di sostanza bianca. Immagine 4-8 posizioni su ogni fetta in ogni punto. </li><li> Cattura immagini successive con un intervallo di 4-6 ore se l&#39;esame di divisione delle cellule NG2 e la differenziazione degli oligodendrociti, idealmente più di 5-7 giorni. </li><li> Catturare un&#39;immagine finale di tutte le regioni e fissare le fette immediatamente. Aggiungere 1 ml di fissativo (4% PFA con 0.1M L-lisina 0,01 M di sodio meta-periodato) al fondo dell&#39;inserto cultura, quindi aggiungere altre 1 ml sopra le fette. Fare attenzione a non spruzzare il fissativo direttamente sulla fetta come si può staccare dalla membrana. Fissare il tessuto per 30 minuti e procedere con immunoistochimica utilizzando marcatori specifici stadi di sviluppo, come descritto nella sezione 4. </li><li> Fette Lavare con 0,2 M di sodio tampone fosfato 3 x 10 m. Se necessario, memorizzate fette a 4 ° C in 0.2 M tampone fosfato di sodio per 1-3 giorni prima di immunoistochimica ma idealmente eseguire colorazione entro 24 ore. Procedere con immunoistochimica come descritto di seguito nella sezione 4 per determinare la percentuale di cellule che si sono differenziate in oligodendrociti (Figura 2D-F). </li></ol> 3 Fate Mappatura di Progeny cellule NG2 Utilizzando topi inducibile Reporter transgenici nelle culture fetta NOTA: Per monitorare il destino delle cellule NG2 da un particolare punto di tempo nella cultura, inducibili NG2creER: possono essere utilizzati YFP topi transgenici. <ol><li> Indurre Cre ricombinazione e di espressione giornalista con l&#39;aggiunta di 100 4OHT nM disciolto in etanolo al mezzo di coltura. NOTA: cellule positive Reporter dovrebbero apparire entro 1-2 giorni ad una efficienza di induzione di ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + cellule ed a questo punto di tempo saranno tutti cellule in fase di cellule NG2 (Figura 2A-C) </li><li> Fissare e lavare la fettas in diversi momenti dopo varie manipolazioni (descritti nelle sezioni 2.5 e 2.6). </li></ol> 4 Slice Immunoistochimica <ol><li> Tagliare le membrane con le fette allegate fuori degli inserti utilizzando un bisturi. </li><li> Trasferimento fette ai singoli pozzetti di una soluzione salina 24 piatto contenente ben tamponata con fosfato (PBS) utilizzando un set di pinzette, facendo attenzione a non interrompere la composizione della fetta al momento del ritiro la membrana. </li><li> Trasferire le fettine su un piatto ben 24 con la soluzione bloccante contenente siero 5% di capra normale (NGS) e 0,1% Triton-X100 in PBS per 1 ora. </li><li> Incubare le fette in anticorpo primario O / N a 5% NGS in PBS a 4 ° C. Per identificare le cellule in fase di cellule NG2, utilizzare anticorpi anti NG2 e PDGFRα. Per identificare oligodendrociti differenziati, utilizzare un anticorpo per la poliposi adenomatosa dell&#39;antigene coli (APC; clone CC1). </li><li> Al secondo giorno fette di lavaggio in PBS 3 x15 min, poi incubare in Antibo secondariamuore in 5% NGS in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le fette in PBS 3 x15 min e montare su vetrini. Montare con le fette su e membrana di fronte alla diapositiva in modo che la membrana non sarà tra l&#39;obiettivo e il tessuto. </li></ol>

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<li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).</li>
<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti

Mielinizzazione nel sistema nervoso centrale è essenziale per un&#39;efficiente comunicazione neuronale e la sopravvivenza assonale 22. Cellule NG2 continuano a generare oligodendrociti mielinizzanti in età adulta, pur mantenendo una popolazione residente nella maggior parte delle regioni del cervello 16,23 - 25. Alcuni meccanismi genetici e molecolari che regolano il differenziamento di queste cellule sono state descritte, ma resta ancora molto da scoprire. Culture fetta organotipica sono un comod...

Culture fetta Organoytpic del sistema nervoso centrale, hanno dimostrato di essere estremamente utile per lo studio dei neuroni e della biologia delle cellule gliali in un sistema semiintact 1 - 4. Queste culture sono relativamente semplici da adottare e mantenere molti benefici di colture primarie di cellule dissociate, come manipolazione dell&#39;ambiente extracellulare e di facile accesso per i ripetuti a lungo termine imaging cellulare dal vivo e registrazioni elettrofisiologiche 5-9. Inoltre, culture fetta mantengono citoarchitettura tessuto 3-dimensionale, connettività neurale regionale, e la maggior parte dei tipi di cellule principali sono presenti nel sistema. Queste proprietà fanno di queste culture un sistema unico e conveniente per studiare il comportamento di singole cellule e fisiologia con interazioni cellulari e ambientali. Cellule NG2 sono una popolazione di cellule gliali nel sistema nervoso centrale dei mammiferi che continuano a proliferare e generare myelinating oligodendrociti durante lo sviluppo embrionale e postnatale 10. Essi sono stati ampiamente studiati in colture cellulari primarie dissociate, e recente sviluppo di linee di topi transgenici con espressione specifica delle cellule NG2 di proteine ​​fluorescenti ha facilitato nella mappatura vivo destino e registrazioni elettrofisiologiche in fettine acute. Anche con questi studi, poco si sa circa le dinamiche temporali di proliferazione delle cellule NG2 e la differenziazione degli oligodendrociti. Sebbene coltura cellulare dissociata è ampiamente usato per la relativa facilità di manipolazioni farmacologiche e genetiche, non è adatto per interrogare differenze funzionali di queste cellule in differenti regioni cerebrali in particolare quando è desiderabile mantenere contesto del microambiente cellulare. Culture fetta forniscono una semplice alternativa che è suscettibile di manipolazioni farmacologiche e sono stati utilizzati per indagare oligodendrociti mielinizzazione 11,12, cellulerisposta colare dopo lisolecitina (LPC) o di anticorpi indotta demielinizzazione 13,14, e l&#39;induzione di rimielinizzazione tramite trattamento farmacologico 15. Un metodo per indagare ed eseguire l&#39;imaging dal vivo e tessuto fissato (o postfixation) analisi della proliferazione delle cellule NG2 e la differenziazione degli oligodendrociti in culture fetta organotipica prelevati sia dal prosencefalo e il cervelletto è descritto. Questo è un metodo potente che può essere utilizzato per studiare il destino delle cellule di singole cellule NG2 dopo la divisione 16 e per scoprire le differenze o una regione e di età-dipendente in fattore di crescita NG2 indotta proliferazione cellulare 17. Questo relativamente semplice tecnica è ampiamente accessibile di approfondire intrinseca e / o ambientale cella meccanismi che regolano la fisiologia di queste cellule gliali e la loro risposta all&#39;attività neuronale o danneggiamento della mielina.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Slice Culture Medium</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>50%</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>25%</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>1mg/L</td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>0,4mM</td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Hyclone</td><td>SH30074,03</td><td>25%</td></tr><tr><td colspan="4">Titolare a pH 7.22 con NaOH, filtrare con il filtro per flaconi e conservare a 4 gradi Celsius</td></tr><tr><td colspan="4">Dissection Buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.004mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO4 (anidro)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4.004mM</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Acido</td> <td>ascorbicoSigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2.0mM</td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0.075mM</td></tr><tr><td colspan="4">Filtrare con il filtro per flacone e conservare a 4 gradi Celsius, ossigenare con 95%O2 5%CO2 prima dell'uso</td></tr><tr><td colspan="4">Altri reagenti e forniture</td></tr><tr><td>4-idrossi tamoxifene (4OHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904</td><td>100nM</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>EM Sciences</td><td>19200</td><td>4%</td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6027</td><td>0,1M</td></tr><tr><td>Metaperiodato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1878</td><td>0,01M</td></tr><tr><td>Coniglio anti NG2 anticorpo</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Topo anti CC1 anticorpo</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Topo anti Ki67 anticorpo</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Topo anti NeuN anticorpo</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticorpi secondari specie-specifici</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td></td><td></td><td>5%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio con inserti per membrana per colture DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Millicell 0,45&mu; m dimensione dei pori</td><td>Fisher Scientific PICM03050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtri per bottiglie</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2 miscela di gas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre</td><td></td><td></td><td></td> sterili a sei pozzetti</tr><tr><td>Spatole per dissezione (ippocampo) o per pesare Tritatessuti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>manuale o automatico</td></tr><tr><td>Lame di</td><td></td><td></td><td></td>rasoio</tr><tr><td>Pipette di trasferimento monouso Piastre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>di Petri sterili da 35 mm e 60 mm</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fase invertita Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cappa a</td><td></td><td></td><td></td>flusso laminare</tr><tr>Incubatore <td></td><td></td><td></td>per<td>colture tissutali</td></tr><tr><td>Microcope a fluorescenza invertita</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

culture organotipica slice per studiare oligodendrocyte dynamics e mielinizzazione

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Cellule NG2 che esprimono (polydendrocytes, cellule precursori degli oligodendrociti) sono la quarta maggiore popolazione di cellule gliali nel sistema nervoso centrale. Durante lo sviluppo embrionale e postnatale che proliferano attivamente e generano oligodendrociti mielinizzanti. Queste cellule sono state comunemente studiate in colture primarie dissociate, co-colture di neuroni, e nel tessuto fisso. Utilizzo di recente disponibili linee di topi transgenici fetta sistemi di coltura possono essere utilizzati per studiare la proliferazione e la differenziazione delle cellule oligodendrociti lineage in entrambe le regioni grigi e bianchi questione di proencefalo e cervelletto. Culture fetta sono preparati dai primi topi postnatale e sono tenuti in coltura per fino a 1 mese. Queste sezioni possono essere esposte più volte nel corso del periodo di coltura per studiare il comportamento e le interazioni cellulari. Questo metodo permette la visualizzazione di divisione cellulare NG2 e le fasi che portano alla differenziazione degli oligodendrociti consentendo un&#39;analisi dettagliata della regione dipendeent cellule NG2 e oligodendrociti eterogeneità funzionale. Questa è una tecnica potente che può essere usato per studiare i segnali intrinseci ed estrinseci che influenzano queste cellule nel tempo in un ambiente cellulare che si avvicina a quella trovata in vivo.

Esempi di dati rappresentativi sono riportati qui di seguito, che sono stati ottenuti con culture fetta sia dal proencefalo e nel cervelletto di P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP e PLPDsRed linee di topi transgenici. Cellule NG2 possono essere esposte nei giorni in prosencefalo e cervelletto fette (Figura 1B-D, video 1) e il fenotipo di queste cellule può essere determinata dopo la fissazione e immunoistochimica con anticorpi NG2 e CC1 (Figura 1E). Oltre a vivere l'imaging, la proliferazion...

Viene descritta una tecnica per studiare le cellule NG2 e gli oligodendrociti utilizzando un sistema di coltura a fette del proencefalo e del cervelletto. Questo metodo consente di esaminare le dinamiche di proliferazione e differenziazione delle cellule all'interno della linea degli oligodendrociti, dove l'ambiente extracellulare può essere facilmente manipolato mantenendo la citoarchitettura tissutale.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la proliferazione e la differenziazione delle cellule del lignaggio degli oligodendrociti in un ambiente che assomiglia molto a quello che si trova in vivo. Ciò si ottiene preparando prima colture di fette di quattro cervelli e cervelletti da topi transgenici postnatali precoci. Le singole cellule nelle fette vengono quindi visualizzate per periodi di ore o giorni per visualizzare le dinamiche cellulari della loro proliferazione e differenziazione.Dopo l'imaging, l'immunoistochimica post hoc delle cellule viene utilizzata per determinare varie caratteristiche cellulari. In definitiva, i risultati possono mostrare le dinamiche della proliferazione e del differenziamento cellulare in condizioni normali e dopo manipolazioni farmacologiche o genetiche. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il carbone dissociato, le colture di neuroni e le cellule di lignaggio dell'incyte liga è che le colture a fette consentono la manipolazione dell'ambiente acellulare mantenendo l'architettura citogenica del tessuto.Tutte le procedure per gli animali seguono le linee guida e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Connecticut almeno due ore prima della dissezione. Preparare gli inserti per colture tissutali in piastre a sei pozzetti per ciascuna. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura a fette, quindi trasferire le piastre nell'incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica almeno 15 minuti prima della dissezione.Metti il tampone di dissezione sul ghiaccio e inizia a gorgogliare con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Assicurarsi inoltre che tutti gli strumenti e il trinciafazzoletti siano sterilizzati con etanolo al 70%. Trasferire il tessuto in un piatto sterile da 35 millimetri contenente un tampone di dissezione ossigenato ghiacciato.Successivamente, usando una lama di rasoio, recidere il cervelletto e il proencefalo con il taglio sagittale attraverso il proencefalo e il cervelletto che separano gli emisferi. Ora, utilizzando il tritatutto manuale, realizzare sezioni coronali e sagittali spesse 300 micron delle quattro cervelle e del cervelletto. Ogni animale di solito produce sei, quattro fette di cervellone e sei fette di cervelletto.Idealmente prende fette che coprono il terzo anteriore del corpo calloso per studiare sia le regioni della materia grigia che quelle della sostanza bianca nella stessa fetta. Trasferire le fette separate nel tampone di dissezione a freddo appena bollito su ghiaccio nel tampone, utilizzando una piccola spatola da dissezione o pesata. Separare le singole sezioni e trasferirle in pre-incubate.Sei piastre a pozzetti contenenti inserti per la coltura. È possibile inserire due o tre sezioni in una lingua. Inserire la pipetta per rimuovere il tampone di dissezione in eccesso dalla superficie della coltura.Inserire e trasferire le piastre nell'incubatrice fino a quando non sono fissate. Il terreno di coltura deve essere sostituito un giorno dopo la preparazione della fetta e poi a giorni alterni fino alla fissazione della fetta come indicato nel protocollo. A seconda dell'esperimento, usa le fette dopo cinque-sette giorni.Nella cultura. Utilizzare solo le fette che diventano trasparenti dopo i primi giorni e scartare quelle che presentano regioni opache irregolari visibili ad occhio nudo. Sotto il contrasto facciale, queste regioni opache appaiono come un ammasso di cellule scure.Se eseguite correttamente, le regioni opache morte si verificano in non più di uno - 5% delle sezioni. Per eseguire l'imaging time-lapse della proliferazione e della differenziazione delle cellule NG due, utilizzare fette di topi da tre a cinque giorni che esprimono EGFP in cellule NG due. Non lasciare che le diapositive scendano sotto i 37 gradi Celsius per più di 15 minuti.Per ogni sessione di imaging, mantenendo la lastra chiusa, utilizzare l'obiettivo 10 x di un microscopio a fluorescenza invertita per acquisire le immagini la prima volta. Punto della cultura. Immagina da quattro a otto posizioni su ciascuna sezione da entrambe le aree di materia grigia e bianca della sezione.Inoltre, è possibile visualizzare punti di riferimento utili come i bordi delle fette, le celle particolari o l'orientamento dei tratti di sostanza bianca per il trasferimento. L'immagine del punto temporale precedente può essere utilizzata come immagine di riferimento durante il trasferimento per la divisione cellulare NG two e la differenziazione degli oligodendrociti. Acquisisci immagini ogni quattro o sei ore idealmente per cinque o sette giorni.Se viene utilizzato il marcatore inducibile NG due cre, ER YFP, indurre l'espressione del reporter utilizzando un terreno di coltura con 100 nano molare. Quattro idrossitamoxifene disciolti nell'attività reporter dell'etanolo dovrebbero comparire entro uno o due giorni. Per il fissaggio, aggiungere un millilitro di fissativo sul fondo della coltura.Inserire e aggiungere un altro millilitro sopra le fette. Non spruzzare il fissativo direttamente sulle fette o potrebbero staccarsi. Fissare il fazzoletto per 30 minuti a quattro gradi Celsius e poi utilizzando un bisturi.Ritagliare le membrane con le fette attaccate. Usando una pinzetta, trasferisci con cura le fette nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti caricata con PBS. Successivamente, trasferire le fette in una seconda piastra a 24 pozzetti caricata con una soluzione bloccante contenente il 5% di siero di capra normale e lo 0,1% di tritton X 100 in PBS.Lasciarli incubare nella soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Una volta bloccate, spostare le fette su una piastra caricata con anticorpi primari in PBS con il 5% di NGS. Lasciali incubare per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.Lavate le fette in PBS. Quindi incubare le fette con anticorpi secondari in PBS con il 5% di NGS. Lasciare procedere l'incubazione per un'ora a temperatura ambiente.Seguire questo con altri tre lavaggi in PBS come prima e montare le fette con la membrana rivolta verso il vetrino in modo che non si trovi tra l'obiettivo e il tessuto. Per analizzare le dinamiche temporali della differenziazione degli oligodendrociti, sono state ottenute immagini della divisione cellulare NG two da colture di fette del proencefalo da topi transgenici P otto NG two creeg per più giorni, le sequenze time-lapse sono state prese per 122 ore. Il fenotipo delle cellule divise è stato determinato con gli anticorpi NG 2 e CC 1.La proliferazione cellulare è stata valutata anche utilizzando la colorazione immunoistochimica per il marcatore di proliferazione cellulare. La mappatura dell'esca KI 67 di due cellule NG è stata effettuata dopo l'induzione della ricombinazione CRE in fette di topi NG due CRE YFP. Due giorni dopo l'aggiunta di quattro idrossitamoxifene.Nelle colture sono state trovate due cellule positive del reporter YFP che esprimono NG. Quattro giorni dopo, una parte di queste cellule si è differenziata in CC one oligodendrociti positivi. Gli oligodendrociti maturi sono stati osservati in colture di fette di cervelletto da P-L-P-D-S.I neuroni Perkin mielinizzati dei topi rossi erano presenti in queste culture. L'imaging ripetuto ha mostrato l'aggiunta di oligodendrociti mielinizzanti DS che esprimono il rosso, l'immunoistochimica in queste fette ha mostrato una sostanziale espressione della proteina basica della mielina. Infine, l'imaging a risoluzione temporale più elevata ha rivelato corpi cellulari oligodendrocitari stabili con alcuni movimenti minori nei processi distali.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare colture di fette sia dal cervello che dal cervelletto e visualizzare ripetutamente singole cellule per giorni o ore e analizzare il destino delle cellule immagine utilizzando l'immunoistochimica post-ho. Oltre all'imaging, queste fette consentono anche la manipolazione dell'ambiente cellulare utilizzando tecniche di mappatura del destino, come la ricombinazione inducibile della crema in una fetta preparata.

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Questo è un protocollo di preparare e mantenere una preparazione neocorticale fetta di cultura organotipica allo scopo di effettuare registrazioni elettrica da neuroni piramidali.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

Questo video dimostra una tecnica ex vivo per indurre la morte delle cellule cerebrali mediata da cellule T CD8+ citotossiche. Dopo aver ottenuto le fette di cervello, le cellule T CD8+ attivate dirette verso gli oligodendrociti vengono trasferite sulle fette per colpire la guaina mielinica e gli oligodendrociti. Dopo l'incubazione, il danno alla mielina e la morte neuronale possono essere valutati istologicamente nelle regioni di interesse.

Una tecnica ex vivo per indurre la morte neuronale tramite cellule T CD8+ specifiche per gli oligodendrociti

Fonte: Kennedy, L. H., et. al. Visualizzazione e imaging dal vivo di organelli di oligodendrociti in fette di cervello organotipiche utilizzando virus adeno-associati e microscopia confocale. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'imaging dei mitocondri degli oligodendrociti in fette di cervello di topo organotipiche. La fetta viene posta all'interno di una camera a bagno con circolazione continua del fluido e temperatura controllata. Dopo aver impostato vari parametri del microscopio...

Imaging confocale del movimento mitocondriale all'interno di oligodendrociti in colture organotipiche di fette cerebrali

Per affrontare i meccanismi di demielinizzazione e apoptosi neuronale nelle lesioni corticali dei disturbi demielinizzanti infiammatori, vengono utilizzati diversi modelli animali. Qui descriviamo un approccio ex vivo utilizzando cellule T CD8+ specifiche per gli oligodendrociti su fette di cervello, con conseguente morte oligodendrogliale e neuronale. Vengono discusse le potenziali applicazioni e i limiti del modello.

Un Ex vivo Modello di un attacco T-Cell Oligodendrocyte-diretto nel acute cervello fette

Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

Colture organotipiche fettine di ippocampo (OHSC) rappresentano un modello in vitro che simula molto bene la situazione in vivo . Qui descriviamo un basato su vibratome migliorato affettare protocollo per ottenere fette di alta qualità per uso nel valutare il potenziale di neuroprotective del romanzo sostanze o il comportamento biologico delle cellule del tumore.

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

I oligodendrocytes myelinating promuovono la propagazione del potenziale d'azione rapida e la sopravvivenza neuronale. È descritto qui un protocollo per l'espressione del oligodendrocyte-specific di proteine fluorescenti in organotipiche fette del cervello con formazione immagine successiva di time-lapse. Inoltre, una procedura semplice per la visualizzazione non macchia mielina è presentata.

Visualizzazione e Live Imaging del Oligodendrocyte organelli in fettine di cervello Organotypic utilizzando Virus Adeno-associati e microscopia confocale

Qui presentiamo un metodo per preparare organotipiche fetta culture dal cervelletto di topo e guaina mielinica colorazione da immunohistochemistry adatto per studiare i meccanismi della mielinizzazione e remyelination nel sistema nervoso centrale.

Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare

Un test etta ex vivo permette di immaginare l'escrescenza del nervo oculomotore in tempo reale. Le fette vengono generate incorporando embrioni E10.5 IslMN:GFP in agarose, tagliando su un vibratoma e crescendo in un incubatore stage-top. Il ruolo dei percorsi di orientamento degli assoni viene valutato aggiungendo inibitori ai mezzi di coltura.

Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

Qui, esponiamo un metodo efficiente per la purificazione degli oligodendrociti e la produzione di mezzo con condizioni oligodendrocite che possono essere utilizzati per esperimenti di co-cultura.

Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture

Impara la tecnica di coltura organotipica di slice cerebrali e cerebellari per studiare la proliferazione e differenziazione delle cellule della linea oligodendrocitaria. Questo metodo preserva l'architettura tissutale per analisi accurate in vitro.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

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