Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la proliferazione e la differenziazione delle cellule del lignaggio degli oligodendrociti in un ambiente che assomiglia molto a quello che si trova in vivo. Ciò si ottiene preparando prima colture di fette di quattro cervelli e cervelletti da topi transgenici postnatali precoci. Le singole cellule nelle fette vengono quindi visualizzate per periodi di ore o giorni per visualizzare le dinamiche cellulari della loro proliferazione e differenziazione.

Dopo l'imaging, l'immunoistochimica post hoc delle cellule viene utilizzata per determinare varie caratteristiche cellulari. In definitiva, i risultati possono mostrare le dinamiche della proliferazione e del differenziamento cellulare in condizioni normali e dopo manipolazioni farmacologiche o genetiche. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il carbone dissociato, le colture di neuroni e le cellule di lignaggio dell'incyte liga è che le colture a fette consentono la manipolazione dell'ambiente acellulare mantenendo l'architettura citogenica del tessuto.

Tutte le procedure per gli animali seguono le linee guida e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Connecticut almeno due ore prima della dissezione. Preparare gli inserti per colture tissutali in piastre a sei pozzetti per ciascuna. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura a fette, quindi trasferire le piastre nell'incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica almeno 15 minuti prima della dissezione.

Metti il tampone di dissezione sul ghiaccio e inizia a gorgogliare con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Assicurarsi inoltre che tutti gli strumenti e il trinciafazzoletti siano sterilizzati con etanolo al 70%. Trasferire il tessuto in un piatto sterile da 35 millimetri contenente un tampone di dissezione ossigenato ghiacciato.

Successivamente, usando una lama di rasoio, recidere il cervelletto e il proencefalo con il taglio sagittale attraverso il proencefalo e il cervelletto che separano gli emisferi. Ora, utilizzando il tritatutto manuale, realizzare sezioni coronali e sagittali spesse 300 micron delle quattro cervelle e del cervelletto. Ogni animale di solito produce sei, quattro fette di cervellone e sei fette di cervelletto.

Idealmente prende fette che coprono il terzo anteriore del corpo calloso per studiare sia le regioni della materia grigia che quelle della sostanza bianca nella stessa fetta. Trasferire le fette separate nel tampone di dissezione a freddo appena bollito su ghiaccio nel tampone, utilizzando una piccola spatola da dissezione o pesata. Separare le singole sezioni e trasferirle in pre-incubate.

Sei piastre a pozzetti contenenti inserti per la coltura. È possibile inserire due o tre sezioni in una lingua. Inserire la pipetta per rimuovere il tampone di dissezione in eccesso dalla superficie della coltura.

Inserire e trasferire le piastre nell'incubatrice fino a quando non sono fissate. Il terreno di coltura deve essere sostituito un giorno dopo la preparazione della fetta e poi a giorni alterni fino alla fissazione della fetta come indicato nel protocollo. A seconda dell'esperimento, usa le fette dopo cinque-sette giorni.

Nella cultura. Utilizzare solo le fette che diventano trasparenti dopo i primi giorni e scartare quelle che presentano regioni opache irregolari visibili ad occhio nudo. Sotto il contrasto facciale, queste regioni opache appaiono come un ammasso di cellule scure.

Se eseguite correttamente, le regioni opache morte si verificano in non più di uno - 5% delle sezioni. Per eseguire l'imaging time-lapse della proliferazione e della differenziazione delle cellule NG due, utilizzare fette di topi da tre a cinque giorni che esprimono EGFP in cellule NG due. Non lasciare che le diapositive scendano sotto i 37 gradi Celsius per più di 15 minuti.

Per ogni sessione di imaging, mantenendo la lastra chiusa, utilizzare l'obiettivo 10 x di un microscopio a fluorescenza invertita per acquisire le immagini la prima volta. Punto della cultura. Immagina da quattro a otto posizioni su ciascuna sezione da entrambe le aree di materia grigia e bianca della sezione.

Inoltre, è possibile visualizzare punti di riferimento utili come i bordi delle fette, le celle particolari o l'orientamento dei tratti di sostanza bianca per il trasferimento. L'immagine del punto temporale precedente può essere utilizzata come immagine di riferimento durante il trasferimento per la divisione cellulare NG two e la differenziazione degli oligodendrociti. Acquisisci immagini ogni quattro o sei ore idealmente per cinque o sette giorni.

Se viene utilizzato il marcatore inducibile NG due cre, ER YFP, indurre l'espressione del reporter utilizzando un terreno di coltura con 100 nano molare. Quattro idrossitamoxifene disciolti nell'attività reporter dell'etanolo dovrebbero comparire entro uno o due giorni. Per il fissaggio, aggiungere un millilitro di fissativo sul fondo della coltura.

Inserire e aggiungere un altro millilitro sopra le fette. Non spruzzare il fissativo direttamente sulle fette o potrebbero staccarsi. Fissare il fazzoletto per 30 minuti a quattro gradi Celsius e poi utilizzando un bisturi.

Ritagliare le membrane con le fette attaccate. Usando una pinzetta, trasferisci con cura le fette nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti caricata con PBS. Successivamente, trasferire le fette in una seconda piastra a 24 pozzetti caricata con una soluzione bloccante contenente il 5% di siero di capra normale e lo 0,1% di tritton X 100 in PBS.

Lasciarli incubare nella soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Una volta bloccate, spostare le fette su una piastra caricata con anticorpi primari in PBS con il 5% di NGS. Lasciali incubare per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.

Lavate le fette in PBS. Quindi incubare le fette con anticorpi secondari in PBS con il 5% di NGS. Lasciare procedere l'incubazione per un'ora a temperatura ambiente.

Seguire questo con altri tre lavaggi in PBS come prima e montare le fette con la membrana rivolta verso il vetrino in modo che non si trovi tra l'obiettivo e il tessuto. Per analizzare le dinamiche temporali della differenziazione degli oligodendrociti, sono state ottenute immagini della divisione cellulare NG two da colture di fette del proencefalo da topi transgenici P otto NG two creeg per più giorni, le sequenze time-lapse sono state prese per 122 ore. Il fenotipo delle cellule divise è stato determinato con gli anticorpi NG 2 e CC 1.

La proliferazione cellulare è stata valutata anche utilizzando la colorazione immunoistochimica per il marcatore di proliferazione cellulare. La mappatura dell'esca KI 67 di due cellule NG è stata effettuata dopo l'induzione della ricombinazione CRE in fette di topi NG due CRE YFP. Due giorni dopo l'aggiunta di quattro idrossitamoxifene.

Nelle colture sono state trovate due cellule positive del reporter YFP che esprimono NG. Quattro giorni dopo, una parte di queste cellule si è differenziata in CC one oligodendrociti positivi. Gli oligodendrociti maturi sono stati osservati in colture di fette di cervelletto da P-L-P-D-S.

neuroni Perkin mielinizzati dei topi rossi erano presenti in queste culture. L'imaging ripetuto ha mostrato l'aggiunta di oligodendrociti mielinizzanti DS che esprimono il rosso, l'immunoistochimica in queste fette ha mostrato una sostanziale espressione della proteina basica della mielina. Infine, l'imaging a risoluzione temporale più elevata ha rivelato corpi cellulari oligodendrocitari stabili con alcuni movimenti minori nei processi distali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare colture di fette sia dal cervello che dal cervelletto e visualizzare ripetutamente singole cellule per giorni o ore e analizzare il destino delle cellule immagine utilizzando l'immunoistochimica post-ho. Oltre all'imaging, queste fette consentono anche la manipolazione dell'ambiente cellulare utilizzando tecniche di mappatura del destino, come la ricombinazione inducibile della crema in una fetta preparata.