Miglioramento in gel riduttive solfo-glycomics β-eliminazione completa per O-linked e di spettrometria di massa

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere i glicani Olink. Ciò si ottiene risolvendo prima le glicoproteine mediante la pagina SDS. Il secondo passo consiste nel lavare i pezzi di gel contenenti la glicoproteina di interesse.

Successivamente, i glicani olink vengono rilasciati mediante eliminazione riduttiva della beta. Il passaggio finale è il glicano per metilazione con partizione di fase. Infine, i glicani metilati permanenti vengono analizzati mediante spettrometria di massa tandem per rilevare le strutture e quantificare le abbondanze.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la cromatografia liquida ad alte prestazioni, è che il nostro metodo separa i glicani neutri e quelli caricati per metilati in una rapida partizione di fase. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scienza del glico, consentendo una caratterizzazione completa o dei glicani collegati rilasciati dalle glicoproteine risolte. Prima di iniziare questa procedura, risolvere le glicoproteine utilizzando l'elettroforesi su gel.

Dopo l'elettroforesi, posizionare il gel su una lastra di vetro e asportare la regione di interesse utilizzando un bisturi pulito per aumentare la resa di glicani OG. Trasferire la banda di gel di interesse su un'altra lastra di vetro e tagliare il pezzo a cubetti di circa due millimetri. Trasferire i piccoli pezzi di gel in un tubo di vetro con tappo a vite da 13 x 100 millimetri con una microspatola in acciaio inossidabile.

Quindi, aggiungere un millilitro di bicarbonato di ammonio da 25 millimolari o ambi alla provetta del campione. Dopo aver tappato il tubo con un tappo a vite in teflon, mescolare delicatamente il contenuto muovendo il tubo prima di lasciarlo riposare per 10 minuti. Quindi rimuovere con cautela l'ambit dal tubo di vetro.

Usando una pipetta da pascolo o di vetro, aggiungi un millilitro di nitrile di aceto al tubo di vetro per coprire completamente i pezzi di gel. Dopo aver tappato il tubo, mescolare delicatamente il contenuto muovendo il tubo prima di lasciarlo riposare per 10 minuti. Al termine, rimuovere l'aceto nitrile dal tubo di vetro.

Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti fino ad eliminare il colore blu brillante, aggiungere due millilitri di acetato di etile e richiudere il tubetto. Posizionare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte con agitazione da un capo all'altro. Una volta rimosso il lavaggio con acetato di etile, eseguire tre lavaggi con due millilitri di acqua deionizzata.

Una volta asciugati i pezzi di gel, aggiungere 500 microlitri di una soluzione di idrossido di sodio da 100 millimolari. E rimaniamo in piedi per tre o cinque minuti sul ghiaccio per equilibrare il gel alle condizioni di base che migliorano il recupero dei glicani. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di sodio boro idruro a due molari in 100 millimolari di idrossido di sodio, ottenendo concentrazioni finali di un molare di sodio boro idruro in 100 millimolari di idrossido di sodio.

Dopo aver mescolato delicatamente la provetta, incubare il campione a 45 gradi Celsius per 18 ore. Durante la prima ora di incubazione, mescolare delicatamente la provetta ogni 15 minuti. Dopo che la reazione di eliminazione beta è stata completata e il tubo è stato posizionato sul ghiaccio, aggiungere lentamente il 10% di acido acetico goccia a goccia.

Per neutralizzare la base, agitare delicatamente la provetta del campione tra le aggiunte di acido acetico, centrifugare la provetta per eliminare le bolle e prevenire la fuoriuscita se necessario. Per fare una piccola colonna di vetro, graffiare e rompere la punta di una pipetta da pascolo o di vetro utilizzando un taglierino in ceramica in modo che la conicità della punta della pipetta sia lunga circa un centimetro. Dopo aver staccato un tappo di lana di vetro, spingilo verso la punta, formando un supporto per il letto di resina.

Fissare la colonna della pipetta con una molletta da bucato e posizionarla sopra una provetta di vetro. Quindi, lavare la pipetta vuota contenente lana di vetro con un millilitro di metanolo e tre millilitri di acido acetico al 5%. Dopo aver fatto roteare l'impasto di resina a scambio cationico idrogeno Dow X in acido acetico al 5%.

Trasferirne una quantità sufficiente a produrre un volume di letto di un millilitro nella colonna della pipetta per pascoli, sciacquare la colonna utilizzando cinque volumi di acido acetico al 5% controllando il flusso per verificare la comparsa di particelle di resina. Dopo aver posizionato la colonna su un nuovo tubo di vetro con tappo a vite da 16 x 125 millimetri, caricare il campione sulla colonna. Una volta raccolto il flusso, eluire i glicani con almeno tre volumi di acido acetico al 5% nella stessa provetta.

Dopo la liofilizzazione, aggiungere 300 microlitri di acido acetico al 10% in metanolo alla provetta del campione essiccata. Dopo il vortex, rimuovere il trimetilbate risultante mediante evaporazione sotto un flusso di azoto a 37 gradi Celsius. Dopo aver ripetuto le fasi di risospensione e asciugatura almeno quattro volte, ricostituire il campione in acido acetico al 5%.

Una volta che il campione è stato caricato su una colonna C 18 bilanciata, raccogliere il flusso in un tubo di vetro con tappo a vite di 13 x 100 millimetri. Eluire i glicani OOG con tre millilitri di acido acetico al 5% nella stessa provetta. Quindi liofilizzare il campione per preparare il reagente di base per la metilazione permanente.

Aggiungi 400 microlitri di idrossido di sodio al 50% a un tubo con tappo a vite in vetro pulito da 13 x 100 millimetri. Quindi aggiungere 800 microlitri di metanolo anidro allo stesso tubo. Aggiungere quattro millilitri di ossido di dimetilsolfo anidro e vortice per generare un precipitato bianco.

Centrifugare il campione a 600 volte G per un minuto per pellettare il precipitato. Dopo aver scartato il surnatante e aver aggiunto quattro millilitri di ossido di dimetilsolfo anidro al vortice di pellet, il reagente Ripetere altre quattro volte fino a quando l'impasto di base diventa traslucido. Sciogliere la base pellettata in tre millilitri di ossido di dimetilsolfo anidro e mescolare delicatamente pipettando su e giù con una pipetta da pascolo pulita.

Quindi, aggiungere 200 microlitri di ossido di dimetilsolfo anidro al campione essiccato e vortice. Per sospenderlo, aggiungere 300 microlitri di impasto di base risospeso al campione e aggiungere immediatamente 100 microlitri di metano ITOM. Sigillare la provetta con un tappo rivestito in teflon e mescolare energicamente per cinque minuti a vortice.

Per fermare la reazione di metilazione permanente, posizionare la provetta sul ghiaccio e aggiungere due millilitri di acido acetico al 5%. Dopo l'agitazione, pipettare la soluzione su e giù cinque volte per ridurre il volume rimanente di metano ITOM per evaporazione. A questo punto, aggiungere due millilitri di clorometano al campione dopo la vortice e la centrifugazione.

Trasferire lo strato acquoso superiore in un nuovo tubo di vetro da 13 x 100 millimetri. Dopo aver ripetuto il lavaggio acquoso dello strato di diclorometano, combinare la seconda fase acquosa con il primo strato acquoso. Una volta che il lavaggio con acqua della fase di clorometano è stato ripetuto due o tre volte, trasferire la fase di clorometano in una provetta di vetro pulita con una pipetta da pascolo pulita.

Quindi asciugare la fase organica sotto una corrente di azoto a 42 gradi Celsius. Dopo aver bilanciato una colonna C 18 e caricato lo strato acquoso su di essa. Lavare la colonna C 18 con acqua e poi eluire i glicani solfatati metilati permanenti in una nuova provetta di vetro con due millilitri di glicani OG metilati al 50% di aceto per analisi mediante infusione diretta in un appropriato spettrometro di massa utilizzando una sorgente di nano elettrospray a una portata della siringa da 0,4 a 0,6 microlitri al minuto a 210 gradi Celsius.

La temperatura capillare per la frammentazione mediante dissociazione indotta da collisione in MSM S e MS multidimensionale di uno strumento a trappola ionica applica dal 30 al 40% di energia di collisione Gli spettri di massa rappresentativi di campioni di glicano olink metilato permanente rilasciati dalla mucina bovina utilizzando l'eliminazione beta riduttiva ingel sono mostrati qui nel pannello superiore. Gli spettri sono dominati da un contaminante polidisperso derivato dal gel di poliacrilammide. Il pannello inferiore dimostra che il lavaggio con acetato di etile dei pezzi di gel prima dell'eliminazione beta elimina questo problema.

I glicani oinked sono stati rilasciati dalla mucina submascellare bovina mediante l'eliminazione riduttiva della beta riduttiva di Ingel utilizzando pezzi di gel che sono stati tagliati piccoli o grandi. Il recupero dei glicani oinked da piccoli pezzi di gel è stato quasi dieci volte maggiore rispetto a quello da grandi fette di gel. I glicani metilati neutri permanenti vengono recuperati nella fase organica di clorometano.

Mentre la permanente onica i glicani metilati sono suddivisi quantitativamente nella fase acquosa. L'efficienza e la semplicità del metodo di partizione di fase facilitano notevolmente la produttività dei campioni e i successivi approcci analitici. I glicani O metilati non solfatati sono stati recuperati dalla fase organica e tutti i sulglicani metilati permanenti sono stati recuperati dalla fase acquosa, il che facilita l'identificazione e la caratterizzazione di glicani quasi isobari solfatati e non solfatati.

Questi glicani differiscono solo di 0,1 unità di massa e sarebbero difficili da risolvere senza separare fisicamente le due specie mediante partizione di fase dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha permesso un'esplorazione approfondita della diversità dei glicani in campioni di tessuto, cellule in coltura, sistemi modello e campioni di pazienti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come palmare e suddividere con successo tutti i glicani collegati rilasciati dalle proteine gly.

Risolto dalla pagina SDS.