Name: Un nuovo metodo di Drug Administration per multipli Zebrafish ( Danio rerio) E la quantificazione di Recesso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Scopri un nuovo metodo per somministrare etanolo a gruppi di zebrafish (Danio rerio) e quantificare i comportamenti di astinenza. Questa tecnica consente dosaggi simultanei precisi per studiare l'ansia durante il ritiro dalla sostanza.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tutte le procedure e test comportamentali sono stati approvati da Research Animal Comitato Etico dell&#39;Università di MacEwan con il numero di protocollo 06-11-12, che è in conformità con il Consiglio canadese per le linee guida di cura degli animali per la cura e l&#39;uso di animali da esperimento. 1. Preparare dosaggio Serbatoi, soluzioni e schema di somministrazione <ol><li> Preparare un programma di somministrazione tale che gli animali vengono dosati nello stesso ambiente e nello stesso momento della giornata per evitare confusioni di tempo o di polarizzazione a stimoli visivi. </li><li> Ottenere il maggior numero di identici, 1.5 L, chiare come serbatoi necessari per il numero di gruppi di dimensioni polipropilene di deposizione delle uova. Utilizzare i gruppi di 8 pesci per vasca, che permette per 2 gruppi di pesci da esaminare al giorno più avanti nella procedura (vedi punto 3). Utilizzare un serbatoio e un serbatoio di dosaggio per gruppo (2x numero totale di gruppi). <ol><li> Mettere 400 micron inserti di riproduzione in tutti i serbatoi. Fill i serbatoi con acqua habitat o ad osmosi inversa alla giusta temperatura (per zebrafish, 25-28 ° C), che è coerente con il pesce di temperatura sono normalmente alloggiati a. NOTA: Ci possono essere interazioni chimiche indesiderate tra alcuni farmaci e le componenti chimiche dell&#39;acqua habitat tamponata. In questa situazione, utilizzare acqua ad osmosi inversa tamponata con sali minimi o nessun acquario per la somministrazione del farmaco, così come per i gruppi di controllo. </li><li> Assicurarsi che i serbatoi sono in un ambiente neutrale per evitare di condizionamento pesce a stimoli visivi esterni durante il dosaggio. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di droga. Mescolare la giusta quantità di farmaco con l&#39;acqua habitat nelle vasche di riproduzione. Preparare la soluzione etanolica 0,2% combinando 3 ml di etanolo alto grado (95% etanolo non denaturato) con 1,497 ml di acqua. Preparare la soluzione etanolica 1,4% combinando 21 ml di etanolo con 1479 ml di acqua. </li></ol> 2. Rete di pesce e EtProcedura di Amministrazione hanol <ol><li> Pesce con attenzione netti da loro carri armati di habitat e il trasferimento nel serbatoio appropriato contenente l&#39;inserto di deposizione delle uova. Idealmente, ospitare il pesce nel foglietto deposizione delle uova per eliminare compensazione del tutto. </li><li> Con tutti i pesci nei loro rispettivi serbatoi di contenimento, sollevare delicatamente la deposizione delle uova inserire fuori dal serbatoio e posizionarlo nel serbatoio della soluzione farmacologica appropriata (Figura 1A). <ol><li> Registrare il tempo di dosaggio, come richiesto. Utilizzare 30 min in soluzione di etanolo per la procedura qui descritta. </li><li> Se possibile, assistenti aiutano con il trasferimento di tutti i gruppi sperimentali alla soluzione farmaco simultaneamente per garantire un tempo preciso dosaggio. In alternativa, trasferire un gruppo alla volta e tenere traccia dei singoli gruppi di dosaggio volte (Figura 1A). </li></ol></li><li> Alla fine del periodo di somministrazione prevista, togliere il pesce dalla soluzione di etanolo sollevando attentamente l&#39;inserto riproduttivadalla soluzione droga e posizionando di nuovo nel serbatoio. </li><li> Delicatamente netto il pesce nelle di mantenimento e ricollocarle nel loro habitat fino alla prossima volta dosaggio programmato, o inserire inserire di nuovo nel serbatoio la deposizione delle uova per eliminare rete. </li><li> Come accennato in precedenza, se possibile entro i parametri delle apparecchiature di stabulazione degli animali, la casa degli animali nella stessa vasca e l&#39;inserto di deposizione delle uova che viene utilizzato come serbatoio. In questo modo si elimina la compensazione del tutto durante la procedura di amministrazione. </li></ol> 3. Test comportamentale <ol><li> Ottenere una luce / arena scuro larghezza 9,5 centimetri con 55 cm di lunghezza e 9,5 cm di profondità con un pavimento bianco impermeabile (Figura 1B). Fissare impermeabile carta non riflettente bianco e nero alle pareti interne della Arena utilizzando velcro, con la metà dell&#39;arena coperta di bianco e per metà coperto di nero. Riempire la scena ad una profondità di 5 cm con acqua ambiente alla temperatura di 25-28 ° C. Maintain questa temperatura durante tutto il test. </li><li> Minimo lo stimoli visivi esterni con la costruzione di una recinzione bianca a tre lati per l&#39;arena di essere situato in. Assicurarsi che l&#39;area di prova è diffusa illuminazione ambientale che non provochi riflessi sulla superficie dell&#39;acqua, ma è sufficientemente luminoso per il software di monitoraggio movimento, o per posta -hoc quantificazione manuale da immagini video. </li><li> Posizionare l&#39;arena nel recinto e impostare i parametri di registrazione e di analisi del movimento del software di monitoraggio comportamento. Impostare la durata di prova per 5-15 minuti, a seconda della domanda di ricerca. NOTA: Qui, abbiamo usato 5 min. </li><li> Trasportare il gruppo di pesci da testare per l&#39;area di ricerca nel serbatoio habitat e metterli al di fuori del recinto dell&#39;arena. Acclimatare il pesce per 10 minuti. </li><li> Un pesce delicatamente netta del gruppo e il luogo appropriato nel centro della luce / arena scuro, avendo cura di rilasciare il pesce quando è posizionato parallelamente all&#39;asse lungo dell&#39;arena di Avoid polarizzazione il pesce per la luce o zona oscura. </li><li> Inizia comportamento registrazione immediatamente dopo che l&#39;animale è stato rilasciato. Guarda per eventuali problemi di software con monitoraggio del pesce o per il salto di pesce o di congelamento. Ruotare l&#39;arena di 180 ° dopo la metà dei soggetti sono stati testati per evitare che confonde a causa di pregiudizi derivanti dalla quale estremità dell&#39;arena è orientata verso l&#39;estremità aperta del contenitore. </li><li> Dopo il processo è terminato, delicatamente rete e togliere il pesce dal nell&#39;arena per un serbatoio o serbatoio di habitat. </li></ol> 4. Analisi <ol><li> Esaminare il tempo trascorso in luce rispetto a zone scure. Per ogni gruppo e ogni pesce, ottenere il relativo tempo trascorso in zone chiare e scure e analizzare utilizzando un t-test un campione (o di Wilcoxon per dati non parametrica; differenza (metà del tempo di prova totale) 150 sec) per determinare se i gruppi preferiscono significativamente una zona sopra l&#39;altra. </li><li> Per confrontare le preferenze, calcolare un preferiscaIndice renza sottraendo il tempo trascorso nella zona di luce dal tempo trascorso nella zona di buio e confrontare le differenze tra i gruppi. t-test può essere utilizzato per confrontare due gruppi. Confronta più gruppi con una analisi a senso unico della varianza utilizzo di test HSD di Tukey post hoc dove (o test di Kruskal-Wallis con comparazione multipla di Dunn post hoc test per dati non parametrico) necessari. </li><li> Confrontare la velocità, il numero di transizioni di zona, serpeggianti, e l&#39;immobilità tra i gruppi. Utilizzare una analisi della varianza utilizzando test di HSD post-hoc di Tukey dove (prova o Kruskal-Wallis con comparazione multipla di Dunn post hoc test per dati non parametrico) necessari. </li></ol>

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</ol>

Gli autori riconoscono Joshua Gallup per l&#39;uso della sua fotografia attrezzature utilizzate per la Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto da un Consiglio di Ricerca di Ingegneria concessione (NSERC) Canada Discovery Scienze Naturali e (a TJH).

Precedenti studi che coinvolgono la somministrazione del farmaco in zebrafish hanno semplicemente fatto affidamento sulla compensazione di pesce per il loro trasporto dal proprio serbatoio di casa nella soluzione della droga 12,16. La compensazione non è sempre coerente e spesso richiede più tempo del previsto a causa della risposta di fuga del pesce zebra, che ha una significativa variabilità individuale. Metodi di trasferimento tradizionali, pur utile, possono essere migliorate riducendo la quantità di temp...

Il pesce zebra (Danio rerio) è una piccola specie di teleostei originario dell&#39;India che è un organismo modello utile per comportamentale 1 e Medical Research 2,3. Zebrafish sono anche comunemente usato nella sperimentazione di varie sostanze farmacologiche per caratterizzare il loro impatto sul comportamento. Vari dosaggi e orari di somministrazione dei farmaci sono stati utilizzati per studiare il comportamento del pesce zebra dopo la somministrazione di composti come stimolanti 4, ansiolitici 5 e etanolo 6-8. Il nostro laboratorio ha studiato gli effetti dei diversi orari di somministrazione di etanolo su ansia zebrafish e locomozione in chiaro / scuro ben validato test 9, 20, anche comunemente indicato come il test scototaxic. Un nuovo metodo di somministrazione di etanolo è stata sviluppata per aumentare l&#39;efficienza di ripetitivo, somministrazione giornaliera per un lungo periodo di tempo (21 giorni) 6 </sup&gt;. Metodi utilizzati in precedenza erano pratici, tuttavia, abbiamo cercato di sviluppare un metodo che ha ridotto rete, con i suoi costi di tempo connessi, e ha permesso simultanea, la somministrazione a tempo proprio del farmaco di interesse per un gran numero di pesci. Nella ricerca utilizzando tradizionali etanolo, zebrafish vengono compensate e trasferito da un serbatoio all&#39;altro contenente la miscela appropriata di etanolo ed acqua 10-12. Anche se questo metodo è ampiamente accettato, compensazione zebrafish può aumentare la variabilità del tempo necessario per introdurre e togliere il pesce dalla soluzione della droga. Pertanto, l&#39;esatta esposizione al composto di interesse può variare nel corso di un esperimento che coinvolge somministrazione ripetuta. Un metodo che riduce le fonti di errore derivante dalla variabilità dei tempi di trasporto è quindi desiderabile. Con il nostro metodo siamo in grado di spostare tutti i pesci simultaneamente, con conseguente tempo di dosaggio identico in ogni pesce. Dopo l&#39;esposizione di etanolo (qui descritto), zebrafish può essere verificato in qualsiasi number di test comportamentali, compresi quelli che valutano l&#39;ansia. Gruppi di pesci dosaggio utilizzando il nuovo metodo ha applicazioni pratiche al di là della capacità di replicare in modo accurato e standardizzare il dosaggio tra soggetti e tra gruppi di pesci. L&#39;avvento di un nuovo software che consente la tracciabilità dei pesci multipli in una sola volta può vedere i ricercatori utilizzano i nostri metodi per garantire la replicabilità e la precisione nei loro esperimenti. Considerando l&#39;uso diffuso di zebrafish come organismo modello per le neuroscienze comportamentali, questo metodo aumenta l&#39;efficienza e praticità nei futuri studi farmacologici. In questo paradigma, un programma di dosaggio ripetuto è stato impiegato che rispecchia circa orari bere umani. I pesci sono stati assegnati in modo casuale a uno dei tre gruppi: controllo, tutti i giorni-moderata, o settimanale-binge. Il programma di dosaggio è stato di 21 giorni di durata, scelto perché ha superato in modo significativo i tempi di esposizione in studi precedenti 7. Pesci di controllo ha ricevuto lo zero alcohol, pesce tutti i giorni-moderata ha ricevuto 0,2% di alcol una volta al giorno, e pesce settimanale-binge ricevuto 1,4% di alcol una volta alla settimana. Il / compito buio la luce è stata utilizzata per valutare l&#39;ansia dopo 2 giorni di astinenza. Questo è relativamente semplice test per amministrare che utilizza un&#39;arena rettangolare, in cui le pareti da un lato sono bianchi e dall&#39;altro lato sono scuri 9. Zebrafish adulti preferiscono robusto il lato oscuro della scena in condizioni di controllo 6,9,13. Aumento ansia è operativamente definita come molto più tempo trascorso nella zona di buio, e diminuita l&#39;ansia può essere assunta quando il pesce spende relativamente più tempo trascorso nella zona di luce. Con il software motion-tracking, altre variabili informative possono essere quantificati, tra cui velocità media, l&#39;immobilità, meandri, e la zona transizioni 14. Il metodo di dosaggio sviluppato nel nostro laboratorio può applicare a qualsiasi ricerca in cui i composti idrosolubili vengono somministrati una o più zebrafish. Molti altri agenti farmacologici che possono beneficiare di questa metodologia sono attualmente in fase di sperimentazione in zebrafish. Comunemente composti testati includono la nicotina, clordiazepossido, buspirone, e scopolamina, che vengono sciolti in un modo simile a etanolo; mescolando la quantità appropriata della sostanza chimica in acqua. Pertanto, la portata generale di questa procedura è molto più ampio e non limitato a etanolo. Inoltre, dopo la somministrazione di farmaci per più giorni, la luce / buio compito è soltanto uno dei molti test comportamentali che potrebbero essere impiegati. Dopo la somministrazione del farmaco o durante l&#39;astinenza, altri saggi popolari che possono essere utilizzati includono il test di immersione romanzo serbatoio 15 e le prove di comportamento sociale, come shoaling 16. La procedura che segue illustrerà un metodo efficiente di trasferire più volte gruppi di pesci o di singoli pesci in soluzioni contenenti un composto farmacologico di interesse. Inoltre, il processo di ansia test con la luce di prova / scuroin gruppi di pesci che sono in ritiro dopo essere stati esposti a lunghi orari di somministrazione alcole verrà descritto.

<table><tbody><tr><td>Sistema di alloggiamento da banco a tre ripiani</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/research-systems/z-hab-system/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acquario da riproduzione da 1,5 L con deflettore da 400 &amp;mu;m</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/consumables/tanks-lids-and-baffles/info/nursery-tank-and-baffles/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Etilene puro da grano</td><td><a href="http://www.luxco.com/brands/vodka-neutral-spirits-neutral-spirits-everclear" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Luxco, INC</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software di tracciamento del movimento Ethovision XT</td><td><a href="http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Noldus Information Technology</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td><a href="http://eshop.eppendorf.ca/categories/1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf Canada</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arena Luce/Buio</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Costruire secondo la descrizione della procedura. 9,5 cm di larghezza, 9,5 cm di profondità, 55 cm di lunghezza.</td></tr></tbody></table>

un nuovo metodo di drug administration per multipli zebrafish ( danio rerio) e la quantificazione di recesso

A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish (Danio rerio) and the Quantification of Withdrawal

Il test dell'ansia nel pesce zebra è spesso studiato in combinazione con l'applicazione di sostanze farmacologiche. In questi studi, i pesci vengono regolarmente raccolti con una rete e trasportati tra gli acquari domestici e le vasche di dosaggio. Al fine di migliorare la facilità di somministrazione dei composti, è stato sviluppato un nuovo metodo per il trasferimento dei pesci tra le vasche per la somministrazione del farmaco. Gli inserti progettati per la deposizione delle uova sono stati utilizzati per trasferire gruppi di pesci nella soluzione farmacologica, consentendo un dosaggio accurato di tutti i pesci del gruppo. Ciò aumenta la precisione e l'efficienza del dosaggio, che diventa molto importante in lunghi programmi di somministrazione ripetuta del farmaco. Abbiamo implementato questa procedura per l'uso in uno studio che esamina il comportamento del pesce zebra nel test luce/buio dopo la somministrazione di etanolo con diversi programmi di 21 giorni. Nei pesci esposti a quantità giornaliere moderate di alcol c'era una differenza significativa nella preferenza di posizione dopo 2 giorni di sospensione rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, non è stata osservata una differenza significativa nella preferenza di localizzazione in un gruppo esposto alla somministrazione di abbuffate settimanali. 
Questo protocollo può essere generalizzato per l'uso con tutti i tipi di composti che sono solubili in acqua e può essere utilizzato in qualsiasi situazione in cui viene esaminato il comportamento dei pesci durante o dopo lunghi programmi di somministrazione di farmaci. Il test luce/buio è anche un metodo prezioso per valutare i cambiamenti indotti dall'astinenza nell'ansia.

Per mantenere la precisione e controllo in studi farmacologici con zebrafish è importante volta la durata della somministrazione di etanolo costantemente e accuratamente come descritto sopra. La procedura può aumentare la facilità e la velocità del procedimento di dosaggio. La somministrazione di etanolo nei tempi previsti sia un settimanale o giornaliera, binge-moderata ha determinato livelli di ansia alterati, misurati con la luce / buio di prova, rispetto ai controlli. Quando la prova due giorni dopo l'ultima sommini...

Viene spiegato un nuovo metodo per ridurre la variabilità quando si espongono i pesci ai farmaci. È stato riscontrato che i pesci esposti a vari modelli di esposizione all'etanolo avevano livelli di ansia alterati durante la sospensione in un test scototassico chiaro/scuro.

Un nuovo metodo di Drug Administration per multipli Zebrafish ( Danio rerio) E la quantificazione di Recesso

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dosare gruppi di pesci in modo accurato ed efficiente con etanolo per valutare gli effetti del dosaggio ripetuto sul comportamento di astinenza. Ciò si ottiene dosando prima il pesce zebra, utilizzando un nuovo metodo che è stato sviluppato per consentire l'esposizione simultanea al farmaco di interi gruppi di pesci per periodi di tempo precisi. Il secondo passo è continuare a dosare il pesce secondo un programma che consenta di testare gli effetti specifici dell'astinenza da etanolo.Successivamente, durante il prelievo, i pesci vengono testati individualmente in un compito buio chiaro utilizzando un software di tracciamento del movimento per registrare il movimento. Il passo finale consiste nell'analizzare i dati al fine di studiare gli effetti dell'astinenza da etanolo sul comportamento del pesce zebra. In definitiva, il dosaggio ripetuto di etanolo utilizzando la procedura descritta provoca un effetto transitorio ma marcato sul comportamento del pesce zebra dopo due giorni di sospensione.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la somministrazione simultanea di farmaci a grandi gruppi di pesci ed è ideale per studi che p

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Il video descrive il test di preferenza luce-buio per studiare il comportamento correlato all'ansia nel pesce zebra dopo l'esposizione all'etanolo.

Test delle preferenze luce-buio: un metodo per studiare il comportamento correlato all'ansia nel pesce zebra

I pesci zebra sono un importante organismo modello per lo studio dell'omeostasi energetica.  Utilizzando un indicatore redox sensibile al NADH2, alamar Blue, abbiamo sviluppato un test che misura il tasso metabolico delle larve di zebrafish in un formato di piastra a 96 pozzetti e può essere applicato alla scoperta di farmaci o geni.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare il tempo di transito di fluorescente contrassegnato cibo attraverso l'intestino di zebrafish larvale in modo elevato throughput.

High-throughput misurazione del tempo di transito dell'intestino utilizzando Zebrafish larvale

Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare la sollecitazione comportamentale in un pesce zebra adulto. L'approccio sfrutta la tendenza innata che il pesce zebra preferisce la metà inferiore di un serbatoio quando è in uno stato stressante. Descriviamo anche i metodi per accoppiare il saggio con la farmacologia.

Approcci comportamentali allo studio dello stress innato nel zebrafish

Gli embrioni di pesce zebra vengono utilizzati per valutare la tossicità dei composti chimici. Si sviluppano esternamente e sono sensibili alle sostanze chimiche, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti fenotipici. L'esperimento richiede solo una piccola quantità di composto, che viene aggiunto direttamente alla piastra contenente embrioni, rendendo il sistema di test efficiente e conveniente.

Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra

I modelli di xenotrapianto di pesce zebra consentono lo screening farmacologico ad alto consumo e l'imaging fluorescente delle cellule tumorali umane in un microambiente in vivo. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per lo screening automatizzato dei farmaci su su larga scala su campioni di leucemia derivati dal paziente nel pesce zebra utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza automatizzata.

Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra

Qui, presentiamo una batteria di test comportamentali completa, tra cui il nuovo serbatoio, Shoaling e i test di preferenza sociale, per determinare efficacemente i potenziali effetti neurotossici delle sostanze chimiche (ad esempio, metanfetamina e glifosato) sul pesce zebra adulto utilizzando un singolo acquario. Questo metodo è rilevante per la neurotossicità e la ricerca ambientale.

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio

Viene descritto un nuovo metodo di iniezione intraperitoneale (IP) nel pesce zebra adulto. Quando si maneggiano composti tossici come la doxorubicina, questa procedura è più efficace dei due metodi IP precedentemente riportati. La tecnica è progettata per essere facilmente adottata da ricercatori con esperienza limitata nel modello del pesce zebra.

Una tecnica di iniezione intraperitoneale nel pesce zebra adulto che riduce al minimo i danni al corpo e la mortalità associata

Questo protocollo descrive una procedura di screening farmacologico nelle larve di zebrafish 3-7 giorni dopo la fecondazione, seguita da una valutazione morfologica.

Screening di piccole molecole e test di tossicità nelle larve di zebrafish in fase iniziale

Questo studio presenta un metodo di alimentazione a base di gelatina che consente una somministrazione orale precisa, non invasiva e basata sulla massa corporea di farmaci negli adulti di pesce zebra. Il protocollo dimostra un'accettazione affidabile del feed e, come prova di principio, la consegna riuscita di MK-801, che ha portato agli effetti comportamentali attesi.

Un approccio semplice e preciso basato su mangimi per la somministrazione orale di farmaci nei pesci

Scopri un nuovo metodo per somministrare etanolo a gruppi di zebrafish (Danio rerio) e quantificare i comportamenti di astinenza. Questa tecnica consente dosaggi simultanei precisi per studiare l'ansia durante il ritiro dalla sostanza.

Un nuovo metodo di Drug Administration per multipli Zebrafish ( Danio rerio) E la quantificazione di Recesso

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