In Vitro Ricostituzione di Complessi Light-raccolta di piante e alghe verdi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ricostituire in vitro complessi proteici di pigmenti che raccolgono la luce di piante o alghe. Ciò si ottiene estraendo i pigmenti dalle foglie di spinaci o dalle colture di alghe e sovraesprimendo la prote APA in e coli. In una seconda fase, l'APA prote viene miscelato con i pigmenti per ottenere un complesso ricostituito.

Successivamente, il complesso proteico del pigmento ricostituito viene purificato dai pigmenti in eccesso e si ottengono i risultati della proteina dispiegata che mostrano caratteristiche spettroscopiche simili del complesso proteico del pigmento ricostituito e di quello nativo in base agli spettri di assorbimento, agli spettri fluorescenti e al deismo circolare. Il vantaggio principale di questa procedura è che ci consente di ottenere una quantità relativamente elevata di complessi proteici del pigmento e anche di manipolare i complessi utilizzando in tipo mutato miscele di proteine e pigmenti con diverse composizioni a dimostrazione della procedura sarà Alberto na, uno studente laureato in laboratorio Per iniziare la procedura per l'estrazione del pigmento totale dalle foglie di spinaci. Con l'aiuto di un frullatore per omogeneizzare una manciata di spinaci, ne lascia circa 20 grammi in 100 millilitri di tampone per macinare a freddo per 20 secondi.

Filtrare la soluzione attraverso due strati di tela di nylon con un diametro scarso di 20 micrometri e centrifugare il filtrato a 1.500 Gs per 10 minuti. A quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di tampone per lavaggio a freddo.

Risospendere il pellet contenente i cloroplasti con un pennello morbido da artista. Una volta risospeso il pellet, aggiungere 50 millilitri di lavaggio, tampone e centrifuga, una soluzione a 10.000 Gs per 10 minuti. A quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 50 millilitri di centrifuga tampone di lavaggio, una soluzione a 10.000 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere completamente il surnatante da questo punto in poi.

Questa procedura deve essere eseguita al buio. Per evitare l'ossidazione dei pigmenti, aggiungere circa 20 millilitri di acetone all'80% tamponato con carbonato di sodio per estrarre i pigmenti, lasciare la soluzione in ghiaccio per 10 minuti. Il vortice occasionalmente tavolozza dei componenti cellulari mediante centrifugazione a 12.000 Gs per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

L'estrazione totale del pigmento dovrebbe risultare in un pellet bianco. Raccogli la laccia in un imbuto separatore. Aggiungere 0,4 volumi di etere datilico.

Agitare energicamente e assicurarsi di aprire le valvole per sfiatare il gas. Aggiungere 0,8 volumi di cloruro di sodio molare di punto 33 e mescolare energicamente. Attendere circa 10 minuti affinché gli strati si separino.

La fase eterea sulla parte superiore contiene i pigmenti estratti. Rimuovere ed eliminare la fase inferiore trasparente. Rimuovere l'etere versandolo dalla parte superiore dell'imbuto separatore in un contenitore di vetro adatto.

Asciugare l'etere aggiungendo un cucchiaio di solfato di sodio anidro granulare. Agitare la soluzione e attendere circa cinque minuti affinché l'essiccante assorba l'acqua dall'etere. Quando l'etere è sufficientemente essiccato.

Dovrebbero esserci alcuni cristalli fluttuanti e nessun grumo di solfato di sodio. Decantare l'etere in un nuovo contenitore di vetro, lasciando il solfato di sodio solido dietro l'aliquot dei pigmenti e asciugarli in un aspiratore rotativo fino a quando l'acetone non è completamente evaporato. Conservare i pigmenti essiccati a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

L'estrazione del cheratinoide dagli spinaci non è mostrata in questo video, ma anche i pigmenti essiccati vengono conservati a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Il complesso di raccolta della luce o LHC per la ricostituzione è stato estratto e purificato da e coli sotto forma di corpi di inclusione. Per il successo della ricostituzione, il rapporto tra le proteine del pigmento e la quantità di tampone utilizzato è fondamentale.

Questa procedura deve essere eseguita in condizioni di scarsa illuminazione. Risospendere 800 microgrammi di corpi di inclusione LHC per un totale di 400 microlitri di te. In un tubo di fuge da due millilitri, aggiungere 400 microlitri di due x ricostituzione, tampone e vortice.

Aggiungere brevemente 0,6 microlitri di un brodo di etanolo beta mar CAPTA da 14,8 molari. Per ottenere una concentrazione finale di 10 millimolari, riscaldare la proteina a 98 gradi Celsius per un minuto. Agitare brevemente e porre a temperatura ambiente per tre minuti.

Risospendere 500 microgrammi di pigmenti di clorofilla essiccati totali, più 80 microgrammi di pigmenti cheratinoidi in 30 microlitri di etanolo al 100% mediante vortice vigoroso. Per un minuto. Centrifugare la miscela di pigmenti a 15, 800 g a quattro gradi Celsius per circa 30 secondi e confermare che non ci sia pellet subito dopo la centrifuga, aggiungere lentamente la miscela di pigmenti alla proteina raffreddata durante il vortice.

Fai attenzione a non vorticare troppo vigorosamente poiché la proteina può traboccare dalla parte superiore del tubo. Continua a vorticare per cinque-10 secondi, quindi posiziona il tubo sul ghiaccio bagnato. Aggiungere 94 microlitri di glucocida al 20% ottale, beta D o og per ottenere una concentrazione finale del 2% Vortex brevemente e tenere in ghiaccio per 10 minuti, aggiungere 90 microlitri di cloruro di potassio a due molari per ottenere una concentrazione finale da 150 a 200 micro molari.

Agitare brevemente e tenere in ghiaccio per 20 minuti. Girare a 15, 800 GS a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Trasferire il natante SUP in un tubo da 10 millilitri senza disturbare il pellet.

Mantenere il natin freddo e al riparo dalla luce. Iniziare questa procedura preparando una colonna SROs di nichel da un millilitro come descritto nel testo del protocollo. Aggiungere tre o quattro millilitri di tampone OG al campione proteico e caricare il campione sulla colonna.

Sciacquare la colonna con cinque millilitri di tampone OG, seguiti da due millilitri di tampone di risciacquo OG. Eluire la proteina legata con tre millilitri di tampone elu. Raccogli l'ellu verde che contiene la proteina ricostituita.

Il gradiente di saccarosio viene preparato come descritto nel testo del protocollo accuratamente rimosso dalla parte superiore del gradiente, lo stesso volume di quello della frazione verde a cui si allude dalla colonna SRO di nichel. Caricare lentamente il campione ricostituito sulla parte superiore, facendo attenzione a non disturbare il gradiente. Posizionare il tubo e una bilancia in un rotore a secchiello oscillante S SW 41 o SW 60 e centrifugare in un'ultracentrifuga a 200.000 Gs a quattro gradi Celsius per 18 ore con un'accelerazione lenta e un arresto senza interruzioni.

Quando l'ultracentrifuga è completa, utilizzare una pinza per estrarre con cautela il gradiente dal supporto della provetta. La banda verde è una frazione da raccogliere. Lo spettro di assorbimento di CP 24.

Una proteina legante la clorofilla AB ricostituita in vitro viene confrontata con lo spettro del complesso nativo. Gli spettri identici indicano una composizione e un'organizzazione del pigmento praticamente identiche. La qualità del complesso ricostituito può essere valutata anche mediante spettroscopia di fluorescenza.

Poiché i pigmenti emettono fluorescenza per eccitazione a diverse lunghezze d'onda, la clorofilla A a 440 nanometri, la clorofilla B a 475 nanometri e zils a 500 nanometri. Gli spettri di emissione di fluorescenza di un complesso CP 24 wildtype ricostituito e normalizzato al massimo mostrano un efficiente trasferimento di energia dalla clorofilla B e dai riempimenti XANTHE alla clorofilla A.La presenza di clorofilla B non coordinata alla proteina può essere riconosciuta da una spalla aggiuntiva di circa 650 nanometri. La presenza di clorofilla A libera porta invece ad un'emissione aggiuntiva intorno ai 675 nanometri.

Gli spettri di emissione fluorescente a 475 nanometri citati sia del complesso CP 24 ricostituito che di quello nativo mostrano un singolo picco a 681 nanometri, indicando che il complesso ricostituito è correttamente ripiegato. Anche il CP 24 ricostituito e il complesso nativo mostrano spettri di carisma circolare molto simili. I singoli residui di amminoacidi importanti per la coordinazione di diversi pigmenti possono essere alterati per analizzare le proprietà dei singoli pigmenti o valutare il loro contributo alla funzione e alla stabilità del complesso.

Qui sono mostrati gli spettri di assorbimento di un CP 29 di tipo selvatico e mutato. La linea verde mostra le differenze tra i due grafici Quando si tate, questa tecnica include il gradiente SUSE, l'ultracentrifugazione potrebbe essere eseguita in 24 ore se eseguita correttamente.