Killer artificiale cellule presentanti l'antigene (KaAPC) per una efficiente In Vitro L'esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di generare una cellula presentante l'antigene artificiale killer non cellulare basata su HLA IG, o K-A-A-P-C per la deplezione di popolazioni di cellule T autoreattive o indesiderate. Ciò si ottiene collegando in primo luogo in modo covalente le molecole di HLA IG e gli anticorpi monoclonali Antifa su particelle di destrano di ferro di dimensioni cellulari per la generazione del K-A-A-P-C funzionale Nella seconda fase, i K-A-A-P-C sono caratterizzati mediante citometria a flusso per garantire la loro corretta funzionalità. Successivamente, i K-A-A-P-C vengono caricati con diversi peptidi di interesse per colpire la popolazione di cellule T specifiche per l'antigene indesiderato.

In definitiva, l'analisi citrica a flusso può essere eseguita per misurare l'uccisione mediata da antigrasso antigene specifico delle cellule T da parte del carico affine. K-A-A-P-C. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo incontrato problemi lavorando allo sviluppo di una cellula di presentazione dell'antigene killer basata su cellule mentre, allo stesso tempo, stavamo lavorando allo sviluppo di una piattaforma basata sul battito. Tecnologia per la modulazione delle cellule immunitarie Per generare prima K-A-A-P-C, aggiungere 250 microlitri di perle epossidiche da un brodo e 250 microlitri di tampone borato appena preparato in una fiala di vetro sterile con tappo a vite.

Posizionare la fiala su un magnete per far aderire le perle dopo due minuti, aspirare il tampone e rimuovere la fiala dal magnete. Lavare le perle una volta con un altro millilitro di tampone foro otto, per poi risospenderle in 550 microlitri di HLA A due IG e anti-umano CD 95 MAB. Agitare delicatamente la fiala per mescolare le perle con gli anticorpi e poi incubare le perle su un rotatore da un'estremità all'altra a quattro gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno successivo, centrifugare le perle per due minuti a 300 g e temperatura ambiente e riposizionare la fiala sul magnete. Dopo due minuti, aspirare il tampone di caricamento. Rimuovere la fiala dal magnete e lavare le perle in un millilitro di tampone di lavaggio agitando accuratamente.

Dopo il terzo lavaggio, ruotare la fiala in un millilitro di tampone fresco per il lavaggio delle perle per bloccare eventuali siti di legame proteici residui. Il giorno successivo, gira di nuovo le perline e riposiziona la fiala sul magnete. Dopo due minuti, aspirare il tampone di lavaggio.

Rimuovere la fiala dal magnete e aggiungere un millilitro di PBS al KAPC. Per verificare la qualità delle perline, trasferire 1,5 volte 10 al quinto del K-A-A-P-C in un tubo fax e lavarle con un millilitro di tampone di lavaggio fax Resus. Sospendere il pellet di perline in 100 microlitri di tampone di lavaggio e aggiungere un microlitro di IgG anti topo, un PE per rilevare l'HLA A, due IG e un microlitro di Ig antitopo MFI TC per rilevare il CD 95 MAB anti-umano.

Quindi, dopo un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le perle in un millilitro di tampone di lavaggio fax Resus. Sospenderli in 250 microlitri di tampone di lavaggio e leggere i campioni su un citometro a flusso per il caricamento dei peptidi. Trasferire due volte 10 al settimo del K-A-A-P-C in una nuova fiala di vetro sterile.

Quindi, dopo aver posizionato le perle sul magnete per due minuti, aspirare il PBS e risospendere le perle in 500 microlitri di PBS fresco contenente cinque microgrammi di peptide. Etichettare la fiala con la data e il nome del peptide caricato, K-A-A-P-C. Quindi conservare il K-A-A-P-C caricato a quattro gradi Celsius per almeno tre giorni per consentire un carico peptidico sufficiente sul dimero HLA A due IG per eseguire il test di uccisione in vitro A-K-A-A-P-C.

Lavare il K-A-A-P-C caricato con peptidi come dimostrato almeno sei volte per rimuovere tutto il peptide libero. Quindi trasferire K-A-A-P-C e due volte 10 al quinto antigene specifico in un pozzetto per campione di una piastra di fondo rotonda da 96 pozzetti in 200 microlitri di terreno di co-coltura in un rapporto uno a uno dopo 48 ore di coltura in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Trasferire i campioni nelle provette fax corrispondenti e lavarli in un millilitro di tampone legante nexina cinque.

Successivamente, risospendere i pellet in 100 microlitri di un tampone legante la nexina cinque, quindi incubare i campioni in un microlitro di una nexina cinque FITC e cinque microlitri di sette a a d a temperatura ambiente. Dopo 10-15 minuti, lavare i campioni con un millilitro di un tampone legante nexina cinque e risospendere i pellet in 250 microlitri di un tampone legante nin cinque. Quindi leggere immediatamente i campioni su un citometro a flusso.

K-A-A-P-C visualizza HLA A due IG e Antifa MAB contemporaneamente, il che, rispetto agli approcci basati su cellule, non viene alterato dall'efficacia della codifica o della trasduzione e può essere facilmente modulato durante la produzione. I K-A-A-P-C sono in grado di esaurire le cellule T antigene specifiche in vitro quando caricate con peptide affine, mentre non caricate con affini. K-A-A-P-C non esauriscono le cellule T, quindi K-A-A-P-C induce l'apoptosi delle cellule T in modo antigene-specifico.

Successivamente, quando le K-A-A-P-C vengono utilizzate per la deplezione selettiva di cellule T antigene-specifiche da una miscela di diverse specificità di cellule T, una citotossicità minima fuoriesce nelle cellule T vicine. Pertanto, K-A-A-P-C rappresenta uno strumento squisito per la deplezione antigene-specifica antigene e antigene in vitro di cellule T antigene-specifiche attivate umane con una potenziale applicabilità clinica per il trattamento di malattie autoimmuni e rigetti di allotrapianto dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia cellulare per esplorare nuovi approcci per il trattamento delle malattie autoimmuni mediate dalle cellule T e dei rigetti dei trapianti.