Name: Isolamento di cellule murine endoteliali Valve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Scopri l'isolamento di cellule endoteliali valvolari cardiache da embrioni e topi adulti utilizzando il modello reporter Tie2-GFP. Questo metodo consente analisi molecolari avanzate sullo sviluppo valvolare.

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Ringraziamo L&#39;impianto Comprehensive Cancer Center analitico Citometria Nucleo Ohio State University, in particolare Katrina Moore, per l&#39;assistenza tecnica FACS. Inoltre riconosciamo il dottor William Pu e il suo gruppo per le loro intuizioni scientifiche. Questo lavoro è stato supportato dal NIH HL091878 (JL) e il centro del cuore all&#39;ospedale dei bambini nazionale.

1 Preparazione di apparecchiature e soluzioni <ol><li> Sterilizzare gli strumenti di dissezione - forbici tessuti pregiati per estrarre i cuori adulti e 2 pinza sottile per la dissezione della regione valvolare - in autoclave in un vassoio strumento coperto. Spray utensili con il 70% di etanolo (EtOH) prima della dissezione. </li><li> Preparare tutte le soluzioni immediatamente prima dell&#39;esperimento e sterilizzare le soluzioni facendoli passare attraverso un filtro sterile 0,2 micron. Tenere soluzioni sul ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. <ol><li> Sterile Dissociazione Buffer (15 ml totale / campione). Combina 1,2 ml di collagenasi IV, 300 ml 2,5% tripsina e 150 microlitri di siero pulcino. Portare il volume fino a 15 ml con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). </li><li> Sterile ordinamento Buffer (12 ml totale). Combina 25 microlitri 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 12 microlitri DNasi I (RNase-free). Portare il volume fino a 12 ml con HBSS. </li><li> Cultura VEC Media. Mix gro endotelialiwth mezzi secondo le istruzioni del produttore (vedi materiale foglio di calcolo) aggiungendo i componenti aliquotate dal kit a 500 ml di EBM2 media. </li><li> GFP Negativo Cultura supporti (supporti cellule non endoteliali). Mescolare 445 ml di Medium 199 1x con 5 ml di penicillina / streptomicina (pen / strep) (concentrazione finale 1%) e 50 ml di FBS (concentrazione finale del 10%). </li></ol></li></ol> 2 Dissezione della Regione valvolare da topi adulti ed embrioni E14.5 <ul><li> Tutte le procedure sugli animali sono stati approvati ed eseguiti in conformità alle linee guida Hospital Research Institute IACUC dei Bambini Nazionale. </li><li> Topi Tie2-GFP sono stati acquistati da Jackson Laboratories (magazzino numero 003.658) 14 e sono stati mantenuti come genotipi omozigoti su uno sfondo FVB / N, e quindi garantire che tutti GFP espresso off-primavera in cellule endoteliali Tie2-positivi. </li><li> Per FACS ordinamento, preparare una età abbinato samp negativole che non contiene BPA come C57 / BL6 per impostare i parametri di gate GFP per FACS ordinamento. NOTA: Questo protocollo e risultati rappresentativi si basano sull&#39;utilizzo di tre, quattro mesi di età topi adulti o una cucciolata a giorno embrionale (E) 14.5. </li></ul><ol><li> Topi adulti: Subito dopo il sacrificio da CO 2 anossia, usano forbici dissezione per aprire delicatamente la cavità toracica ed esporre il cuore ei polmoni. Dopo l&#39;esposizione, afferrare il cuore con una pinza le grandi arterie e tirare fuori dal corpo. Rimuovere tessuto polmonare, se intatto, e posto il cuore in HBSS freddo a risciacquare. Rimuovere il ventricolo e tirare via atri lasciando il canale atrioventricolare &#39;anello&#39; e regioni aortici intatti. Effettuare una incisione lungo il lato del canale atrioventricolare di aprire il &#39;ring&#39; e esporre le strutture valvolari. Rimuovere il miocardio e le regioni aorta prossimale da prendere in giro delicatamente con una pinza. Identificare i lembi valvolari come bianco, tessuto denso sul miocardio rosa. Deta delicatamenteCH L&#39;corde tendinee dalle valvole atrioventricolari e rimuovere la maggior quantità di miocardio residuo possibile. Siate cauti a non tirare o raschiare i lembi valvolari durante questo processo poiché VEC possono essere sloggiati. Posizionare regioni valvolari tagliati in una provetta Eppendorf da 1,5 ml contenente 1 ml HBSS e tenere su ghiaccio. NOTA: dissezione accurata è fondamentale per eliminare le cellule endoteliali non valvolare che potrebbero contaminare il campione. </li><li> Embrioni: il sacrificio topi femmina 14,0 giorni dopo la spina copulazione si osserva (mattina del tappo di copulazione = 0,5 giorni). <ol><li> Subito dopo il sacrificio, sezionare l&#39;utero (contenente gli embrioni) e lavare in HBSS freddo. Sezionare singoli embrioni dall&#39;utero e rimuovere il sacco vitellino embrionale che circonda ogni embrione. Rimuovere i cuori di ciascuno degli embrioni e seguire passo 2.1. (NOTA: stringendo delicatamente l&#39;embrione con una pinza appena sotto le appendici superiori dovrebbe contribuire a esporre il cuore e rendere più facile la rimozione.) </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Dissociazione delle cellule e preparazione per FACS <ol><li> Utilizzo di puntali sterili, rimuovere HBSS dal tubo eppendorf contenente le regioni valvolari. </li><li> Sostituire con 1 ml di tampone di dissociazione e 4 microlitri DNasi I. </li><li> Ruotare le provette a 37 ° C per 7 minuti. </li><li> Pipettare su e giù 3 volte e poi lasciare che il campione riposare per 15 sec. Raccogliere il surnatante (contenente le cellule dissociate) in una provetta da 15 ml. </li><li> Per fermare la reazione collagenasi, aggiungere 125 ml di siero di cavallo al tubo di raccolta. Tenere tubo di raccolta sul ghiaccio. </li><li> Ripetere passaggi dissociazione (3,2-3,5) nove volte a raccogliere nove frazioni di surnatante. </li><li> Passare la raccolta frazionata attraverso un filtro di nylon 70 micron in un nuovo tubo di raccolta per garantire una sospensione di cellule singole rimuovendo eventuali residui e grumi. </li><li> Gira la sospensione a 400 g per 5 minuti per agglomerare le cellule. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di tampone e Ordinamentotenere in ghiaccio fino al FACS. </li></ol> 4. FACS Ordinamento GFP positive VEC <ol><li> Set porte per avanti e side scatter escludere detriti e catturare singole cellule; escludere doppietti utilizzando discriminazione doppietto gating. Registrare il campione di controllo negativo e definire le impostazioni di gate al fine di confrontare e definire con precisione la popolazione di cellule GFP-positive nel campione Tie2-GFP. </li><li> Analizzare le cellule GFP positive tramite FACS e perfezionare impostazioni del gate. </li><li> Ordina il campione Tie2-GFP e raccogliere sia le cellule GFP-positive e GFP-negativi. Se verranno utilizzate cellule per l&#39;estrazione dell&#39;RNA, ordinare direttamente nel buffer ordinamento. Per le celle di coltura dopo FACS, raccogliere le cellule GFP positive in una provetta sterile contenente 1 ml di media VEC con 1 ml di FBS, e raccogliere le cellule GFP negativi in ​​1 ml di media non-endoteliali con 1 ml di FBS. Utilizzare questa combinazione di siero media / 50% 50% per migliorare la vitalità cellulare. Tenere in ghiaccio fino analisi post FACS. </li></ol> 5. post FACS analisi dells <ol><li> Estrazione RNA: <ol><li> Subito dopo FACS, le cellule positive e negative GFP centrifugare a 1500 xg per 8 min. </li><li> Pipettare con attenzione il surnatante (smistamento buffer) e scartare. </li><li> Risospendere il pellet di cellule (pellet non è visibile per le dimensioni del campione consigliate qui) in 200 ml Trizol. </li><li> Congelare a -80 ° C o iniziare l&#39;estrazione fenolo-cloroformio standard per isolare mRNA totale come precedentemente descritto dal nostro laboratorio 15. </li><li> Utilizzare 50-200 ng di RNA per la sintesi di cDNA utilizzando la Mastermix secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Oggetto cDNA per l&#39;amplificazione PCR quantitativa utilizzando sonde IDT Primetime qPCR contro marcatori di cellule endoteliali del mouse (CD31, Fattore di von Willebrand (vWF)), marcatori valvola di cellule interstiziali (α-actina del muscolo liscio (α-SMA), periostina (Postn)), miociti marcatori (Mhc6, Mhc7) e GAPDH. </li></ol&gt; </li><li> Coltura murino VEC: <ol><li> Dopo FACS smistamento e raccolta di cellule (punto 4.3), le cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. </li><li> Pipetta con cautela il surnatante (ordinamento tampone + media) e scartare. </li><li> Risospendere il pellet di cellule GFP-positive in 1 ml di media VEC e il pellet GFP-negativo in 1 ml di media non endoteliali. </li><li> Piatto ciascun campione in un pozzetto di una diapositiva camera di plastica e crescere fino confluenti. Cultura per circa 1 settimana per le cellule GFP negativi a diventare confluenti e più di 2 settimane per le cellule GFP positive per diventare confluenti (da un campione di 3, topi adulti). Modificare i media ogni due giorni. </li></ol></li><li> Colorazione di immunofluorescenza: <ol><li> Rimuovere i supporti dalle cellule e fissare nel 4% paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a RT. Lavare le cellule fissate tre volte per 5 minuti ciascuno in soluzione tampone fosfato (PBS). </li><li> Rimuovere pozzi camera da scivolo e blocco in siero bovino 5% di albumina / 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Covarediapositive O / N a 4 ° C con anticorpi primari (CD31, 1: 1.000 o actina del muscolo liscio α-(α-SMA), 1: 100). Lavare 3x per 5 min in PBS. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo secondario (Alexa Fluor-568 di capra anti-Rat) 1: 400 in PBS, aggiungere alle diapositive, e incubare 1 ora a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini 3x per 5 min in PBS. </li><li> Montare in Vectashield contenenti DAPI e incubare 1 ora a 4 ° C prima della visualizzazione. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui si descrive per la prima volta, un nuovo metodo per l&#39;isolamento di VEC murini embrionali e adulte di topi Tie2-GFP. Anche se questa linea di topi è stato ampiamente utilizzato per l&#39;isolamento di popolazioni di cellule endoteliali, questo è il primo rapporto che mostra isolamento selettivo di VEC. A causa della fragilità della popolazione VEC, abbiamo sviluppato un protocollo rigoroso che consente l&#39;isolamento di singole cellule di GFP positive (e negative GFP) le cellule da valvole cardiache di topi embrionali e adulte. Rispetto alla pubblicazione originale utilizzando embrioni interi o organi da Tie2-GFP topi 14, abbiamo ottimizzato collagenasi e dissezione misure basate sulla bassa abbondanza di questa popolazione di cellule endoteliali fragile per isolare una popolazione selezionata di cellule. Isolamenti VEC hanno già stati riportati solo in modelli animali di grandi dimensioni con strumenti genetici e biomolecolari limitato. Questi strumenti sono ben stabiliti nei topi e, quindi, l&#39;abilità di isolare VEC murini consente un set esteso di disegni sperimentali da utilizzare per la ricerca delle valvole cardiache. Di conseguenza, un vantaggio significativo di questo approccio è che VEC possono essere isolati temporalmente da topi wild type, e modelli di malattia della valvola e lesioni. Un secondo vantaggio è che VECs possono essere isolati e analizzati quasi immediatamente dopo la dissezione, preservando pattern di espressione che riflettono la situazione in vivo in modo più accurato. Inoltre, questo protocollo isolamento è sufficiente ad eliminare coltura cellulare per l&#39;espansione numero e quindi possibili variazioni fenotipiche indotte dall&#39;ambiente in vitro sono impediti. Nonostante le novità ei vantaggi sperimentali di questo protocollo, ci rendiamo conto che esistono ancora limitazioni. In primo luogo, la dimensione della popolazione VEC entro valvole murini è molto piccolo e quindi, più cucciolate embrionali temporizzate sono necessari al fine di generare RNA sufficiente per l&#39;analisi di espressione genica. Mentre this può essere superato utilizzando più allevatori, potrebbe avere un impatto sulla domanda di alcuni strumenti di analisi post-isolamento. Questa limitazione è stata una sfida particolare per stabilire colture confluenti di VEC GFP-positive, al fine di effettuare analisi più approfondite di fenotipi VEC compresi i profili molecolari e test funzionali. Pertanto riconosciamo che non tutte le difficoltà sono state superate dal nostro approccio, ma questa è una zona di interesse che stiamo cercando di superare. Questo approccio di isolare VEC dalle regioni valvolari introduce la possibilità di contaminazione da Tie-GFP -positive, non valvolare cellule endoteliali della dell&#39;endocardio, o strutture vascolari all&#39;interno del miocardio ventricolare. Ad oggi, distinzione molecolare di VEC da altre popolazioni di cellule endoteliali cardiache non sono stati identificati. Tuttavia una regione enhancer del gene NFATc1 è stato identificato e dimostrato di etichettare specificamente VEC che non faresottoposti EMT, e le altre popolazioni di cellule endoteliali all&#39;interno del cuore 18. Come modello Cre (NFATc1 encre) è disponibile, gli studi futuri potrebbero utilizzare la specificità di questa linea per minimizzare i rischi di contaminazione. Oltre alle cellule positive Tie2-GFP non valvolare, c&#39;è sempre la possibilità di contaminazione da miociti nel punto in cui i lembi valvolari si attaccano alla regione anulare del setto e pareti miocardiche murali. In dati non riportati qui, inizialmente abbiamo iniziato gli studi per isolare VEC dalle regioni valvolari sezionati utilizzando perline anticorpi coniugati rivestiti con anti-GFP e anti-CD31. Anche se questo approccio ha avuto successo per isolare le cellule endoteliali, abbiamo sperimentato significativa aggregazione di cellule da tipi di cellule adiacenti, non endoteliali e quindi VIC e cellule miocardiche contaminati nostro campione sperimentale. Questo è stato evitato utilizzando l&#39;analisi FACS come parametri sono stati impostati per isolare solo sospensione singola cellas e analisi PCR per rilevare l&#39;espressione di geni specifici miociti è controllata per questa limitazione (Figura 3). Mentre il nostro contaminazione può essere ritenuto come minimo, rimane un potenziale complessità sperimentale che potrebbero essere evitati in futuro con la doppia selezione di GFP e marcatori di superficie specifici delle cellule endoteliali. Usando questo protocollo, abbiamo VEC successo isolate da topi embrionali e adulte e gli esempi forniti di come questo approccio può essere utilizzato per l&#39;isolamento di RNA e la coltura di cellule di popolazioni di cellule GFP positive e negative GFP. Tuttavia, questo approccio non è limitato a queste applicazioni e può essere utilizzato per una pletora di approcci molecolari, cellulari e funzionali. Inoltre, il fondo Tie2-GFP può essere allevato con modelli genetici di topo che permettano di studi comparativi delle popolazioni VEC nella salute e nella malattia. Lo sviluppo di questa nuova metodologia, per la prima volta, consentire studi miratiesaminando il contributo di VEC nello sviluppo della valvola e la manutenzione e potrebbe svelare i meccanismi precedentemente sottovalutati della malattia della valvola endotelio-dipendente.

La valvola maturo è composto da tre strati stratificati di matrice specializzata extracellulare (ECM) intervallati da cellule interstiziali valvolari (VIC) e incapsulato da un singolo strato di cellule endoteliali delle valvole cardiache (VEC) 1. Il ruolo della ECM è quello di fornire tutte le necessarie proprietà biomeccaniche di resistere continui cambiamenti in vigore emodinamico durante il ciclo cardiaco. Il fatturato del ECM valvola nella valvola adulti è strettamente regolata da VIC, che sono in gran parte quiescente e fibroblasti-come, in assenza di malattia. Oltre alla popolazione VIC, cellule endoteliali valvole cardiache (VEC) formano un endotelio ininterrotta sulla superficie delle cuspidi della valvola 2. Mentre l&#39;importanza di ECM e VIC per la struttura e la funzione della valvola sono stati descritti da noi e gli altri, il ruolo di VEC è meno noto. Tuttavia, questa relativamente piccola popolazione di cellule è critico per la formazione valvola nell&#39;embrione ed è descritto come disfunzionale nella valvolamalattia. Formazione di valvola cardiaca in embrione inizia quando un sottoinsieme di cellule endoteliali all&#39;interno delle regioni canale e del tratto di efflusso atrioventricolare subire endoteliale alla trasformazione mesenchimale (EMT) e formano gonfiori conosciuti come cuscinetti endocardici 1,3. Le cellule mesenchimali recentemente trasformate all&#39;interno di queste strutture poi si differenziano in VIC e formano le valvole maturi. Una volta EMT è completa, le cellule endoteliali che circondano i cuscini, chiamati VEC, formano uno strato di cellule endoteliali ininterrotto che protegge la valvola maturo contro i danni. Inoltre, VEC percepiscono l&#39;ambiente emodinamico e hanno dimostrato a livello molecolare comunicare con VIC sottostanti per regolare ECM omeostasi 1,3. Nelle valvole malate, il monostrato VEC viene interrotto in associazione con i cambiamenti anormali nell&#39;organizzazione ECM e biomeccanica alterati 4,5. Inoltre, studi in modelli murini suggeriscono che la disfunzione VEC è la causa di fondo della valvola disease 1,6-9. Come VEC svolgono un ruolo importante nello sviluppo della valvola, la manutenzione, e la malattia, è importante che noi definiamo pienamente i loro fenotipi temporali, al fine di avanzare il campo e capire i meccanismi della malattia. Precedente lavoro di molti laboratori si è isolato con successo VEC da suini e ovini modelli 10-12. A causa delle grandi dimensioni di queste valvole, isolamenti attraverso tampone e / o digestione enzimatica, seguita da un numero di diversi metodi di isolamento, tra cui la separazione delle cellule tallone magnetica e singola cella espansione clonale è stata efficace per generare popolazioni puri 11-13. Tuttavia, questi modelli possono essere restrittivi causa l&#39;annotazione incompleta dei suini e ovini genomi che limitano la disponibilità di strumenti molecolari oltre ai costi elevati. Pertanto sperimentazione di suini e ovini VEC dopo l&#39;isolamento può essere restrittivo. Modelli murini sono preferibili a causa delle molte possibilità di manipula genetica, ma fino ad oggi, sono stati riportati zione e strumenti molecolari in embrione e l&#39;adulto non isolamenti VEC in piccoli modelli animali. Ciò è probabilmente dovuto alla difficoltà di lavorare con campioni di tessuto di piccole dimensioni che comprendono una popolazione di cellule minoranza che attualmente privi di identità unica di marcatori VEC-specifici, evitando così metodi di isolamento a base di anticorpi. In questo articolo, riportiamo un nuovo metodo per l&#39;isolamento diretto di VEC murini nelle fasi embrionali e adulte. Questo protocollo sfrutta topi Tie2-GFP, che esprimono GFP in tutti i tipi di cellule endoteliali e sono stati ampiamente utilizzati per studiare popolazioni di cellule endoteliali 14. Tuttavia, la novità di questo studio è che questi topi, per la prima volta sono stati utilizzati per isolare cellule endoteliali dalle valvole. Con attenta dissezione del tessuto valvola e una serie di nove digestioni enzimatiche seguiti da FACS ordinamento, VEC possono essere isolati e utilizzati per varie tecniche sperimentali including estrazione e cultura RNA, direttamente dopo l&#39;ordinamento.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 Capra Anti-ratto IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtro cellulare in nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>2,5% tripsina</td><td>Invitrogen LT</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina (BSA), frazione V, trattata con shock termico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CD31 anticorpo anti-topo per ratti</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>siero per pulcini</td><td>Invitrogen LT</td><td>16110-082</td><td></td></tr><tr><td>collagenasi IV</td><td>Invitrogen LT</td><td>17104-019</td><td>Preparato secondo le istruzioni del produttore</td></tr><tr><td>DNase I, senza RNasi (10.000 unità)</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza</td><td>CC3156</td><td>Per terreni VEC</td></tr><tr><td>EDTA, soluzione 0,5 M&nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>03-500-506</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td>Per terreni VEC</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS),</td><td>Hyclone</td> inattivato termicamente <td>SH3007103IH</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Invitrogen LT</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Forno di ibridazione</td><td>VWR</td><td>230301V</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 1X</td><td>Corning cellgro</td><td>10-060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide 16% Soluzione Microscopia elettronica di grado EM</td><td>Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>MP-Biomed</td><td>ICN1670049</td><td></td></tr><tr><td>Permanox vetrino per camera sterile con coperchio</td><td>Thermo-Scientific</td><td>177429</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato, 1X</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PrimeTime Mini qPCR Assay</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Acta2 (&alpha;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Mastermix</td><td>Invitrogen LT</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tie2-GFP topi</td><td>Jackson Laboratories</td><td>3658</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti #5 11 cm</td><td>Dumont</td><td>14096</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-SMA anticorpo anti-topo&nbsp;</td>Supporto di montaggio <td>rigido Sigma-Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule murine endoteliali valve

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Le normali strutture valvolari sono costituite da strati stratificati di matrice extracellulare specializzata (ECM) intervallati da cellule interstiziali valvolari (VIC) e circondati da un monostrato di cellule endoteliali valvolari (VEC). I VEC svolgono un ruolo essenziale nella creazione delle strutture valvolari durante lo sviluppo embrionale e sono importanti per mantenere l'integrità e la funzione valvolare per tutta la vita. A differenza di un endotelio continuo sulla superficie dei lembi valvolari sani, l'interruzione della VEC è comunemente osservata nelle valvole malfunzionanti ed è associata a processi patologici che promuovono la malattia e la disfunzione valvolare. Nonostante la rilevanza clinica, gli studi mirati che determinano il contributo dei VEC allo sviluppo e ai processi patologici sono limitati. L'isolamento dei VEC da modelli animali consentirebbe la sperimentazione specifica per le cellule. I VEC sono stati isolati da modelli adulti di grandi animali, ma a causa delle loro piccole dimensioni della popolazione, della fragilità e della mancanza di marcatori specifici, non sono state riportate segnalazioni di isolamenti di VEC in embrioni o modelli di piccoli animali adulti. Qui descriviamo un nuovo metodo che consente l'isolamento diretto dei VEC dai topi allo stadio embrionale e adulto. Utilizzando il modello reporter Tie2-GFP che marcano tutte le cellule endoteliali con la proteina fluorescente verde (GFP), siamo riusciti a isolare le cellule GFP-positive (e negative) dalle regioni delle valvole semilunari e atrioventricolari utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). I VEC isolati GFP-positivi sono arricchiti per i marcatori endoteliali, tra cui CD31 e il fattore di von Willebrand (vWF), e mantengono l'espressione delle cellule endoteliali quando vengono coltivati; mentre, le cellule GFP-negative mostrano profili molecolari e forme cellulari coerenti con i fenotipi VIC. La capacità di isolare VEC murini embrionali e adulti consente di condurre studi molecolari e funzionali precedentemente irraggiungibili su una specifica popolazione di cellule valvolari, che miglioreranno notevolmente la nostra comprensione dello sviluppo valvolare e dei meccanismi della malattia.

Tie2 cellule GFP-co-localizzano con marcatori di cellule endoteliali nelle valvole cardiache embrionali e adulte. Al fine di confermare la specificità di espressione Tie2-GFP in VEC da topi embrionali e adulte, immunofluorescenza è stata eseguita per determinare co-localizzazione con il marcatore delle cellule endoteliali, CD31 in sezioni di tessuto preparate da E14.5 e 3 mesi di età adulta Tie2-GFP topo, utilizzando metodi precedentemente pubblicate dal nostro laboratorio 16. Come mostrato in Figura 1, VECs co-esprimono GFP (Figura 1 A, B, E, F) e CD31 (Figura 1 C, D, E, F) sia adulto (Figura 1 B, D, F) e embrionale ( Figura 1 A, C, E) le fasi, quindi convalida il nostro modello per il successivo isolamento VEC. Analisi FACS identificato popolazioni di cellule GFP-positive e GFP-negativi distinti in valvole cardiache embrionali e adulte isolate da topi Tie2-GFP. Selvaggio ttopi YPE C57 / BL6 sono stati usati per impostare i parametri GFP e circa il 2% delle singole cellule-gated da topi Tie2-GFP mostrano un arricchimento significativo in cellule GFP-positive mediante analisi FACS in entrambi i campioni embrionali e adulte (Figura 2). Sulla base di studi di co-localizzazione illustrate nella Figura 1, queste cellule sono considerati VECs e producono una media di 61.800 cellule totali (campioni vanno da 39,000-77,000 cellule / campione) in campioni adulti (n = 3), e 8,928 cellule (8,015- 11.000 cellule / lettiera) da una cucciolata di embrioni E14.5. Analisi PCR conferma arricchimento di marcatori di cellule endoteliali in cellule GFP-positive e valvola di marcatori di cellule interstiziali di cellule GFP-negativi isolati da topi Tie2-GFP. Analisi dell'espressione genica di popolazioni di cellule GFP positivi e negativi per qPCR seguenti FACS Mostra profili molecolari distinti. Rispetto alle popolazioni di cellule GFP negativi isolati da embrioni Tie2-GFP e adults, le cellule GFP positive sono arricchite per l'espressione di marcatori di cellule endoteliali CD31 e vWF, (Figura 3). Inoltre, l'espressione di marcatori miociti (MYH6, MYH7) in queste popolazioni di cellule è molto bassa, dimostrando minimo la contaminazione di cellule non endoteliali. Al contrario, le cellule GFP negativi isolate da topi adulti Tie2-GFP e E14.5 embrioni sono arricchiti per valvola cellule interstiziali (VIC), marcatori di cellule positive α-SMA e periostina (POSTN) relativi alla GFP. Arricchimento di questi marcatori è maggiore nelle cellule GFP negativi isolati da campioni E14.5 rispetto agli adulti a causa del fenotipo quiescente di VIC adulti e quindi bassa espressione di marcatori attivati. Cellule GFP-positive isolate dal Tie2-GFP topi adulti possono essere coltivate in vitro. La capacità di cultura GFP cellule negative e positive GFP isolati da campioni adulti è stata esaminata la based sulla morfologia cellulare e la colorazione immunoistochimica. Utilizzando protocolli precedentemente descritti da noi 17 illustra la Figura 4 che le cellule GFP positive appaiono round morfologia (figura 4A) e co-express GFP con il marker delle cellule endoteliali CD31 dopo due settimane in coltura (Figura 4C). Al contrario, le cellule non endoteliali sono negativi per la GFP, visualizzare una morfologia mesenchimale-like (Figura 4B) ed esprimere il VIC marcatori α-SMA dopo nove giorni (Figura 4D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400"> Figura 1.-Tie2 cellule GFP-positive co-localizzano con CD31 in valvole cardiache embrionali e adulte. Immunofluorescenza per mostrare associazione di (Tie2-) espressione GFP (A, B) con il marcatore delle cellule endoteliali, CD31 (C, D) in le svolantini eptal della valvola mitrale a E14.5 (A, C, E) e adulti (B, D, F) fasi. La regione valvola è evidenziato in A, C, E. (E, F) fusione di immagini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2. VEC Tie2-GFP-positive possono essere identificate da FACS. Rispetto ai controlli C57 / BL6 di pari età (A, C), le valvole isolate da embrioni Tie2-GFP (B) e adulti (D) contengono una GFP distinta popolazione di cellule positive, come indicato in verde. Eventi GFP-negativo, mostrati in rosso sono stati raccolti come controllo. I numeri tra (B) e (D) indicano la% media di GFP-pcellule ositive dal numero totale di eventi ordinati per FACS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3. cellule GFP-positive sono arricchiti per i marcatori delle cellule endoteliali mentre le cellule GFP-negativi esprimono geni associati con le cellule interstiziali valvolari. Rappresentante qPCR di marcatori di cellule endoteliali (CD31, Fattore di von Willebrand (vWF)) e adulti (MYH6) e fetali ( MYH7) marcatori miociti in cellule GFP-positive isolate dalle regioni valvolari di E14.5 (A) e adulti (B) topi Tie2-GFP. Nota arricchimento di marcatori di cellule endoteliali e livelli molto bassi di geni miociti-associata. (C, D) Fold chaNGES in espressione di marcatori di cellule interstiziali valvolari α-SMA e Postn in cellule GFP-negativi isolati da E14.5 (C) e adulti (D) topi Tie2-GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500"> Figura 4.-Tie2 cellule GFP-positive mantengono l'espressione di marcatori di cellule endoteliali in vitro. Seguito FACS, GFP positive (A, C) e negativo (B, D) le popolazioni di cellule provenienti da topi adulti sono stati coltivati ​​fino confluenti e sottoposti alla fase di imaging contrasto (A, B) e immunostaining fluorescente (C, D). Cellule GFP-positive esprimono CD31 (rosso) (C) dopo10 giorni di coltura. Al contrario, l'espressione della GFP non è stato rilevato nella popolazione di cellule negativo, che macchiato positivo per α-SMA, un marker di VIC attivati ​​(D).

La capacità di isolare le cellule endoteliali delle valvole cardiache (VEC) è fondamentale per comprendere i meccanismi di sviluppo, mantenimento e malattia delle valvole. Qui descriviamo l'isolamento di VEC da topi Tie2-GFP embrionali e adulti utilizzando FACS che consentiranno studi che determineranno il contributo dei VEC nei processi di sviluppo e malattia.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare popolazioni arricchite di valvole cardiache, cellule endoteliali da embrioni e topi adulti con un reporter endoteliale. Ciò si ottiene innanzitutto mediante un'attenta dissezione della regione del canale ventricolare atriale contenente tutti i lembi delle valvole cardiache mitrali, tricuspidali, aortiche e polmonari. La seconda fase della procedura consiste nel dissociare il tessuto valvolare e rilasciare le singole cellule trattando il tessuto con una serie di trattamenti enzimatici.Questo processo viene ripetuto nove volte. Quindi la soluzione contenente cellule e detriti viene fatta passare attraverso un filtro per garantire una sospensione a singola cellula senza detriti cellulari. Il passaggio finale consiste nello smistare e raccogliere le cellule dissociate utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.In definitiva, una popolazione sufficientemente ampia di cellule endoteliali valvolari arricchite viene resa disponibile per la coltura in vitro e l'analisi molecolare. In questo approccio, mostreremo come isolare le cellule endoteliali delle valvole cardiache dai topi. Poiché gli strumenti biomolecolari sono stati ben consolidati nel modello murino.Ciò consente di utilizzare una serie ampliata di disegni sperimentali per la ricerca sulle valvole cardiache. Inoltre, l'isolamento delle cellule endoteliali delle valvole cardiache negli embrioni consente di eseguire studi sullo sviluppo precedentemente non fattibili. Iniziamo.Assicurarsi di sterilizzare completamente gli strumenti chirurgici sterilizzandoli in autoclave su un vassoio per strumenti. Il sito chirurgico deve essere sanificato spruzzandolo con etanolo al 70%. Ciò include il microscopio e qualsiasi altra apparecchiatura potenzialmente a contatto nel sito.Le seguenti soluzioni devono essere preparate immediatamente prima dell'esperimento. Tampone di dissociazione, tampone di smistamento e, se coltura, coltura VEC, terreni e terreni di coltura GFP negativi. Ognuna di queste soluzioni deve essere sterilizzata con un filtro da 0,2 micron, dopodiché le soluzioni devono essere mantenute in ghiaccio fino a quando non vengono utilizzate dopo l'anidride carbonica.Asfissia del topo, seguita da lussazione cervicale. Usa le forbici da dissezione per aprire la cavità toracica. I topi qui sono omozigoti per la GFP di secondo legame o sono controlli negativi della stessa età necessari per lo smistamento dei fatti.Quindi, esponi il cuore e i polmoni. Quindi afferra il cuore con una pinza alle grandi arterie ed estrailo dal corpo. Immergere parzialmente il cuore.In un piatto di HBSS freddo nel piatto, preparare il cuore per la dissezione rimuovendo il tessuto polmonare attaccato, è fondamentale eliminare le cellule endoteliali non valvolari che potrebbero contaminare il campione. Per ottenere prima un anello del canale ventricolare atriale, rimuovere gli atri tirandoli delicatamente lontano dal cuore. Successivamente, usa una lama di rasoio per tagliare i ventricoli, facendo il taglio proprio sotto le valvole AV, le regioni aortiche dovrebbero rimanere intatte.Successivamente, praticare un'incisione lungo un lato del canale per aprire l'anello ed esporre le strutture della valvola ventricolare atriale utilizzando una pinza. Staccare delicatamente il miocardio per esporre i lembi valvolari. Sono tessuto bianco denso sopra il miocardio.Ora, staccare delicatamente il cordi tendai dalle valvole ventricolari atriali se è ancora attaccato. E rimuovere le regioni prossimali dell'arteria polmonare e le pareti aortiche che non contengono le strutture valvolari semilunari nel processo. Rimuovere il più possibile il miocardio rimanente senza danneggiare i lembi valvolari poiché il SEC potrebbe staccarsi.Un'attenta dissezione è fondamentale per eliminare le cellule endoteliali non valvolari che potrebbero contaminare il campione. Quindi cerca di rimuovere il più possibile il tessuto circostante mantenendo intatte tutte e quattro le valvole. Infine, metti le regioni del cuore valvolare tagliate in una provetta da 1,5 millilitri con un millilitro di HBSS freddo e mantieni la provetta sul ghiaccio.Utilizzare questa tecnica per preparare il tessuto valvolare isolato da animali adulti o E 14.5 con una pipetta. Rimuovere l'HBSS dal tubo con il fazzoletto. Quindi aggiungere nuovamente un millilitro di tampone di dissociazione e quattro microlitri di DNAS uno.Incubare i tessuti nel tampone di dissociazione e DN con rotazioni delicate a 37 gradi Celsius per sette minuti. Dopo sette minuti, pipettare i tessuti su e giù tre volte per aiutare a dissociare le cellule. Dopo essersi depositato per circa 15 secondi, raccogliere il surnatante contenente le cellule dissociate.Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Terminare la reazione della collagenasi nel conico da 15 millilitri con un'aggiunta di siero di cavallo. Questa è la prima frazione di raccolta.Ora tornando al tubo dei tessuti stabilizzati, aggiungere nuovamente il tampone di dissociazione e quello del DNA. Ripetere la procedura per raccogliere una seconda frazione. Continuare a ripetere il processo fino a raccogliere un totale di nove sospensioni cellulari.Ora passa tutte le raccolte frazionate attraverso un filtro di nylon da 70 micron in un unico tubo per una sospensione delle celle senza detriti. Raccogli le celle in un pellet facendo girare il tubo verso il basso a 400 GS per cinque minuti. Quindi risospendere il pellet in un millilitro di tampone di selezione e tenerlo in ghiaccio fino a quando non può essere analizzato via fax, che è coperto nel testo.La coltura cellulare e la colorazione del protocollo sono coperte anche dalle sezioni di tessuto del protocollo di testo dal terzo legame GFP transgenico. I topi sono stati raccolti da adulti e gli embrioni di E 14,5 negli adulti. Le cellule endoteliali valvolari sono state identificate con il marcatore endoteliale CD 31 e sono risultate coespresse GFP.Le stesse cellule isolate da embrioni di E 14,5. Inoltre, l'analisi fax con CD 31 e GFP ha identificato popolazioni cellulari positive e negative per GFP da cellule preparate da embrioni adulti ed E 14,5. Wild type C 57 sei nero.Le cellule adulte sono state utilizzate per impostare i parametri GFP, l'espressione genica nelle popolazioni cellulari GFP positive e GFP negative è stata confrontata mediante PCR quantitativa nelle cellule GFP positive. I marcatori endoteliali erano alti e i marcatori miocitivi erano molto bassi. Nelle cellule GFP negative.I marcatori delle cellule interstiziali valvolari erano elevati. Le due popolazioni cellulari sono state coltivate separatamente dopo due settimane. Le cellule GFP positive hanno assunto una morfologia intorno ed esprimono CD 31.Al contrario, le cellule GFP negative hanno assunto una morfologia mesenchimale dopo nove giorni. Queste cellule hanno anche espresso il marcatore VIC alfa SMA dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle valvole cardiache per essere in grado di esplorare i meccanismi di sviluppo e malattia in modelli murini che possono poi essere tradotti nella popolazione umana.

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Forniamo un metodo per isolare e popolazioni coltura pura di cellule endoteliali valvola cardiaca (VEC). VEC può essere isolato da entrambi i lati della cuspide o depliant e subito dopo, alla base di cellule interstiziali (VIC) isolamento è semplice.

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