Name: La telomerasi attività nelle varie regioni del cervello di topo: telomerasi non radioattivo Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Scopri come misurare l'attività della telomerasi nei tessuti cerebrali di topo con il saggio TRAP non radioattivo. Questo metodo efficiente rivela differenze tra maschi e femmine.

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Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalla tecnologia B.G. Negev e dal contributo di Linda Powers.

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico per la sperimentazione animale nel dell&#39;Università Ben-Gurion (IL-39-08-2010). 1 del mouse Cervello estrazione di proteine <ol><li> Preparare 3 tubi da 15 ml contenenti ciascuna 5 ml di soluzione e posizionare i tubi di Ringer su ghiaccio. </li><li> Sacrifica il mouse utilizzando anestesia isoflurano (ATTENZIONE - utilizzare cappa chimica) per 10-20 secondi seguita da dislocazione cervicale e la decapitazione immediata. </li><li> Rimuovere il cervello dal cranio e sciacquare per qualche secondo con la soluzione ghiacciata di Ringer per evitare danni al tessuto cerebrale. </li><li> Utilizzando una lama chirurgica, separare il cervelletto (CR) e tronco cerebrale (BS) dalla corteccia frontale. Avanti, separare il cervelletto dal tronco encefalico e tagliare il lobo frontale (FL) dalla corteccia frontale; rimuovere il bulbo olfattivo del lobo frontale. Posizionare i 3 regioni cerebrali nelle apposite provette da 15 ml. </li><li> Omogeneizzare il tessuto in ogni tubo. Aggiungi frsoluzione ghiaccio esh freddo Ringer in modo che ogni provetta contenga lo stesso volume e centrifugare per 7 minuti a 800 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 ml di tampone di lisi CHAPS ad ogni provetta. Mescolare bene, facendo passare la soluzione di diverse volte (~ 10) attraverso una siringa da 1 ml con un ago da 21 G, e incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Trasferire il contenuto di ogni provetta in una nuova provetta micro-centrifuga e centrifugare per 30 minuti a 13.000 x g. Trasferire il surnatante in una nuova provetta micro-centrifuga e determinare la concentrazione di proteine ​​utilizzando un metodo precedentemente stabilito. Conservare gli estratti proteici in aliquote da 10 ml a -80 ° C. </li></ol> 2 TRAP Assay Preparazione degli strumenti di reazione, Soluzioni e proteine ​​Calcoli diluizione <ol><li> Preparare numero adeguato di appositi tubi micro-centrifuga etichettati per proteine ​​diluizioni estratto e tampone di reazione telomerasi. Eseguire tutti pipettaggio nel protocollo utilizzando puntali con filtro per prevenire la contaminazione. </li&gt; <li> Scongelare le seguenti soluzioni su ghiaccio: TRAP mix di reazione 10x, TS fondo, di dNTP, estratti UPW e proteine ​​(vedi tabella di materiali per reagenti e reattivi concentrazioni). </li><li> Diluire la soluzione di estratto proteico ad una concentrazione finale di 1 mg / mL con acqua ultra-pura (UPW). </li></ol> 3 telomerasi Reazione <ol><li> Preparare la miscela di reazione telomerasi aggiungendo quanto segue a un tubo micro-centrifuga: mix 2 microlitri TRAP (10x), 1 ml TS Primer (0.1 mg), 1 microlitri dNTP (10 mm) e 15 ml UPW. Per campioni multipli, moltiplicare i volumi di cui sopra per il numero di campioni, più 1. </li><li> Aggiungere 19 ml di miscela di reazione per ciascun tubo di reazione e aggiungere 1 ml di estratto proteico diluita (1 mg proteine) a ciascuna provetta per un volume finale di 20 microlitri. </li><li> Mettere le provette di reazione in un 30 ° C bagnomaria già caldo per 45 min. </li></ol> 4. PCR Reazione <ol><li> Quindici kmn prima della fine della reazione telomerasi, scongelare le seguenti soluzioni: ACX di primer, Titanium Taq Buffer, UPW. </li><li> Preparare la miscela di reazione PCR aggiungendo quanto segue a un tubo micro-centrifuga: 2,5 microlitri Titanium Taq Buffer (10x), 1 ml ACX Primer (0.1 mg), 2 ml UPW (1 ml quando si usa IC) e 0,5 ml Titanium Taq polimerasi (50x). Per campioni multipli, moltiplicare i volumi di cui sopra per il numero di campioni più 2. </li><li> Aggiungere 6 ml di miscela PCR per ciascuna provetta PCR e aggiungere l&#39;intero volume della reazione telomerasi (20 microlitri) ad ogni provetta per un volume finale di 26 microlitri. </li><li> Inserire le provette PCR ad un termo cycler PCR ed eseguire il seguente programma: - 90 ° C - 2 min. - 94 ° C -. 30 sec * - 60 ° C -. 30 sec * - 72 ° C -. 45 sec * - 72 ° C - 2 min. Conservare i prodotti di PCR a -20 ° C. * = 34 cicli </li></ol> 5. Agarose Mini-gel Preparazione, Campioni Correre, e Gel colorazione <ol><li> Aggiungere 25 ml di tampone di elettroforesi refrigerati (TBE) e ha una ancoretta in un becher che è 2-4 volte il volume della soluzione tampone e lentamente cospargere a 1.125 g del-alta risoluzione (HR) polvere di agarosio mentre la soluzione viene agitata rapidamente . Rimuovere la barra di mescolare, coprire il becher con un involucro di plastica e forare in un piccolo foro per la ventilazione. Riscaldare il bicchiere nel forno a microonde a potenza &quot;Low&quot; per 3 minuti e poi passare al potere &quot;Alto&quot; e riscaldare la soluzione a impulsi corti con attenzione a non provocare la fuoriuscita. Si noti che quando la schiuma creata dal riscaldamento diventa grosse bolle e scompare dopo pochi secondi, l&#39;agarosio è pronto. </li><li> Cast gel ad una apparecchiatura di mini-gel orizzontale, dopo il gel si solidifica a temperatura ambiente consentono il gel per raffreddare per 20 minuti a 4 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Caricare ogni corsia con 25 ml di campione TRAP (20 microlitri TRAP prodotti di PCR e 5 microlitri 6x gel-loading dye) e correre alle 110 V per 3 ore a 4 ° C in camera fredda. </li><li> Preparare nucleici 3x acido macchia soluzione di lavoro con l&#39;aggiunta di 15 microlitri 10.000X macchia nucleico-acido, soluzione madre a 50 ml Doppio Acqua distillata (DDW) con 0.1 M NaCl (0,29 g). Colorare il gel per 20 minuti agitando delicatamente. </li><li> Utilizzare transilluminatore UV con 302 nm di lunghezza d&#39;onda per visualizzare le bande di DNA ladder TRAP. </li></ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
<li>Cong, Y., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+human+telomerase+beyond+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actions of human telomerase beyond telomeres.</a> Cell Res. 18, 725-732 (2008).</li>
<li>Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTichon%2C+A+%22Curr.Mol.+Med%22">Curr.Mol. Med</a>. 13, 1010-1022 (2013).</li>
<li>Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+TERT+associates+to+RNA+granules+in+fully+mature+neurons%3A+Role+in+the+translational+control+of+the+cell+cycle+inhibitor+p15INK4B%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B.</a> PloS one. 8, e66602(2013).</li>
<li>De Jesus, B. B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+telomerase+activation+in+extending+health+span+and+logevity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential of telomerase activation in extending health span and logevity.</a> Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).</li>
<li>Blackburn, E., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%3A+An+RNP+enzyme+synthesizes+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).</li>
<li>Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+telomerase+activity+and+TERT+expression+during+brain+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice.</a> J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).</li>
<li>Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+activity+in+the+subventricular+zone+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice.</a> Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).</li>
<li>Eitan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Telomerase-increasing+compound+in+mouse+brain+delays+the+onset+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis.</a> EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Analisi delle attività della telomerasi nel cervello di topo mediante il dosaggio TRAP composto da 4 fasi principali: 1) proteine ​​estrazione dalle regioni specifiche del tessuto cerebrale 2) TS allungamento fondo da telomerasi - reazione telomerasi 3) amplificazione dei prodotti di reazione telomerasi mediante PCR 4 ) separazione dei prodotti PCR utilizzando alta risoluzione gel di agarosio. Questo saggio TRAP modificato affronta due principali difficoltà che si innalzano dal test tradizio...

La telomerasi è un ribonucleoproteina composto di telomerasi trascrittasi inversa (TERT), la subunità catalitica della telomerasi, e una componente RNA (TERC). Il ruolo canonico di telomerasi è quello di preservare la corretta lunghezza dei telomeri con l&#39;aggiunta di sequenze ripetitive (TTAGGG) alle estremità telomeriche, promuovendo quindi l&#39;integrità genomica, e la proliferazione delle cellule 1. Ruoli supplementari sono stati attribuiti al TERT nelle cellule, vale a dire che conferisce resistenza all&#39;apoptosi indotta da vari agenti dannosi 2, protegge le cellule staminali mesenchimali umane da stress ossidativo 3, e svolge un ruolo pro-sopravvivenza nei neuroni completamente differenziati dalla sua associazione di TIA1 RNA positivo granuli 4. TERT è espresso e attivo soprattutto nelle cellule somatiche dividendo e nella maggior parte dei tipi di tumori, mentre i livelli di espressione e l&#39;attività enzimatica sono strettamente regolati in cellule non-dividendo 5,6. Studi hanno dimostrato che nel rcervello Odent, l&#39;attività della telomerasi diventa inosservabile da giorno postnatale 10, mentre TERT mRNA viene mantenuta a livelli inferiori in età adulta 7. Altri studi hanno dimostrato l&#39;attività della telomerasi nella zona sub-ventricolare adulto, il bulbo olfattivo, l&#39;ippocampo, e nel cervelletto e nella corteccia adulta 8. Abbiamo recentemente dimostrato che nuovi composti che aumentano l&#39;espressione e l&#39;attività della telomerasi nelle corde cerebrali e spinali hanno esercitato effetti neuroprotettivi in ​​N-metil-D-aspartato (NMDA) - topi iniettati, ritardato l&#39;insorgenza e la progressione della malattia sclerosi laterale amiotrofica in SOD1 transgenici topi e ha aumentato la sopravvivenza dei neuroni motori nel midollo spinale di questi topi 9. Per comprendere appieno il ruolo pro-sopravvivenza della telomerasi nei neuroni e nel cervello, è necessario sviluppare un test semplice e relativamente veloce sensibile per la rilevazione dell&#39;attività della telomerasi nelle varie regioni del cervello. Il telomerica rprotocollo di amplificazione EPEAT (TRAP) è un noto test sensibile che unisce l&#39;attività canonica della telomerasi e la reazione a catena della polimerasi (PCR). In questo saggio, la telomerasi aggiunge TTAGGG ripete ad un substrato telomerasi (TS primer) oligonucleotide, seguita da amplificazione PCR che genera 6 coppie di basi (bp) scala del DNA utilizzando il TS inverso fondo -. ACX 32 P etichettato dCTP di sono utilizzati per rilevare la bassa quantità di prodotti di PCR. La scala di DNA viene risolto mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide sequenziamento (PAG). Sia l&#39;intensità delle bande di DNA e la lunghezza del DNA ladder riflettono la quantità di molecole di enzima attivo e la loro processività rispettivamente 10. Questo test tradizionale contiene alcune importanti difficoltà: Il pericolo di esposizione a sostanze radioattive, grandi e difficili da gestire sequenziamento PAGE e il consumo di tempo del gel corsa e l&#39;esposizione pellicola del prodotto radioattivo (pernottamento in entrambi i casi). </p&gt; Questo protocollo offre un miglioramento non radioattivo agarosio saggio basato mini-gel. Il DNA 6 bp ladder viene risolto utilizzando 4,5% ad alta risoluzione su gel di agarosio e l&#39;individuazione ha luogo con colorazione molto sensibile acido nucleico. La combinazione di alta risoluzione usando agarosio mini-gel e macchia sensibile acido nucleico offre maneggevole dosaggio, elimina il rischio di esposizione alla radioattività e abbreviare notevolmente la durata complessiva dosaggio da 3 giorni a diverse ore.

<table><tbody><tr><td>TRAP Mix (10x)</td><td></td><td></td><td>Realizzato manualmente, miscelare quanto segue in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (acquistato da Sigma). Le aliquote sono congelate a -20 °C.</td></tr><tr>Soluzione <td></td><td></td><td>di Ringer</td><td>Realizzato manualmente, miscelare quanto segue in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4&middot; H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L D-(+)-glucosio anidro.</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Minrad INC.</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>Maneggiare con cura in una cappa chimica</td></tr><tr><td>dNTP (10 mM)</td><td>Primer Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')</td><td>Oligo Sigma</td><td></td><td>DNA ordinati in formato DRY e UPW aggiunti in base alla concentrazione richiesta</td></tr><tr><td>Primer ACX (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3')</td><td>Oligo Sigma</td><td></td><td>DNA ordinati in formato DRY e UPW aggiunti in base alle esigenze concentrazione</td></tr><tr><td>Titanio Taq Polimerasi/Tampone</td><td>Clontech</td><td>S1792/S1793</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio ad alta risoluzione</td><td>Sigma</td><td>A4718</td><td>Qualsiasi agarosio ad alta risoluzione di alta qualità può essere adatto</td></tr><tr><td>Apparato mini-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione dell'acido nucleico (GEL-RED)</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3')</td><td>Oligo di DNA Sigma</td><td></td><td>ordinati in formato DRY e UPW aggiunti in base alla concentrazione richiesta Tampone</td></tr> di <tr><td>lisi CHAPS</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9852S</td><td>Aggiungere PMSF (inibitore della proteasi) a una concentrazione finale di 1 mM</td></tr><tr><td>Acqua ultra pura (UPW)</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 topi</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la telomerasi attività nelle varie regioni del cervello di topo: telomerasi non radioattivo repeat amplification protocol (trap) assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerasi, un ribonucleoproteina, è responsabile del mantenimento della lunghezza dei telomeri e quindi promuovere l&#39;integrità genomica, la proliferazione, e la durata della vita. Inoltre, la telomerasi protegge i mitocondri dallo stress ossidativo e conferisce resistenza all&#39;apoptosi, suggerendo la sua possibile importanza per la sopravvivenza dei non-mitotico, cellule altamente attive come i neuroni. Abbiamo precedentemente dimostrato la capacità di attivatori telomerasi nuovi per aumentare l&#39;attività della telomerasi e di espressione nelle varie regioni del cervello del mouse e per proteggere le cellule neuroni motori dallo stress ossidativo. Questi risultati rafforzano l&#39;idea che la telomerasi è coinvolto nella protezione dei neuroni da varie lesioni. Per sottolineare il ruolo della telomerasi nel cervello, noi qui a confronto l&#39;attività della telomerasi nel cervello maschile e femminile del mouse e la sua dipendenza dell&#39;età. TRAP assay è un metodo standard per la rilevazione dell&#39;attività della telomerasi in vari tessuti o linee cellulari. Qui mostriamo il Analysis di attività della telomerasi nelle tre regioni del cervello di topo da parte di non-denaturazione estrazione delle proteine ​​usando CHAPS Lysis Buffer seguita dalla modifica del dosaggio TRAP standard. In questo test 2-step, telomerasi allunga un substrato endogeno telomerasi specifico (TS primer) con l&#39;aggiunta di TTAGGG 6 ripetizioni bp (reazione telomerasi). I prodotti di reazione telomerasi sono amplificati dalla reazione di PCR creando una scala di DNA di incrementi di 6 bp. L&#39;analisi del DNA ladder è fatto da alta risoluzione elettroforesi su gel di agarosio 4,5% seguita da colorazione con colorante altamente sensibile acido nucleico. Rispetto al tradizionale test TRAP che utilizzano 32 P etichettato radioattivo dCTP di per il rilevamento del DNA e di elettroforesi su gel di poliacrilamide per risolvere la scala del DNA, questo protocollo offre un risparmio di saggio TRAP per valutare l&#39;attività della telomerasi nel cervello di topo, dimostrando la capacità di tempo non tossico rilevare le differenze di telomerase l&#39;attività nei vari regione del cervello di topo femmina e maschio.

Estratti proteici cellulari totali sono stati preparati dal lobo frontale (FL), tronco encefalico (BS) e cervelletto (CR), derivato da 3 CD-1 femmina e 3 CD-1 topi maschi all'età di 1 e 3 mesi di età per l' saggio TRAP modificato e 3 CD-1 topi maschi all'età di 2 mesi per il saggio TRAP radioattivo. Attività della telomerasi è stata rilevata nel 1 mg di proteine ​​estratto impiegando il saggio TRAP modificato e 2 mg di proteine ​​estrarre per il saggio TRAP radioattivo. Rilevazione di attività della telomerasi dal saggi...

La telomerasi è espressa nel cervello neonatale e anche in regioni distinte del cervello adulto. Presentiamo un saggio TRAP non tossico per l'analisi dell'attività della telomerasi in varie regioni del cervello del topo e il rilevamento delle differenze nell'attività della telomerasi tra cervelli di topo maschio e femmina.

La telomerasi attività nelle varie regioni del cervello di topo: telomerasi non radioattivo Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attività della telomerasi nel tessuto cerebrale normale. Ciò si ottiene preparando prima estratti di proteine di cellule intere da vari tessuti cerebrali come fonte per un enzima telomerasi attivo. Il secondo passo consiste nell'aggiungere quantità equivalenti di estratti proteici a una specifica miscela di reazione della telomerasi contenente il substrato e i nucleotidi necessari per l'attività della telomerasi.Successivamente, i prodotti della reazione della telomerasi vengono amplificati mediante PCR e analizzati mediante elettroforesi su gel aros ad alta risoluzione. Il passaggio finale consiste nel visualizzare i prodotti di reazione della telomerasi amplificati colorando il gel aros con un agente colorante del DNA altamente sensibile, che alla fine risulta da questo test del protocollo di amplificazione ripetuta del raggio Thoma che mostra un incremento di sei coppie di basi, scale di DNA equivalenti all'attività del raggio Thoma in vari tessuti cerebrali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come un saggio a trappola radioattiva o i kit di saggi a trappola commerciali, è che questo protocollo offre un'alternativa relativamente efficiente in termini di tempo e costi.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'attività del tessuto cerebrale, può essere applicato anche a qualsiasi altro tessuto vivente o coltura cellulare. Prima di iniziare questa procedura, preparare tre provette da 15 millilitri contenenti ciascuna cinque millilitri di soluzione di ringer. Metti i tubi sul ghiaccio dopo aver rimosso il cervello da un topo soppresso.Sciacquare il cervello per alcuni secondi con una soluzione di suoneria ghiacciata per evitare danni al tessuto cerebrale. Usando una lama chirurgica, separare il cervelletto e il tronco encefalico dalla corteccia frontale. Quindi, separa il cervelletto dal tronco encefalico.Rimuovere il bulbo olfattivo dal lobo frontale e tagliare il lobo frontale dalla corteccia frontale. Posizionare le tre regioni cerebrali nelle provette da 15 millilitri designate, omogeneizzare il tessuto in ciascuna provetta. Quindi, aggiungere una soluzione di ringer ghiacciata fresca in modo che ogni provetta contenga lo stesso volume e centrifugare per sette minuti a 800 volte G, rimuovere il surnatante e aggiungere 100 microlitri di fette di cippa.Tampone per ogni tubo. Mescolare bene passando la soluzione circa 10 volte attraverso una siringa da un millilitro con una pasta da 21 gauge, incubare su ghiaccio per 30 minuti. Dopo 30 minuti, trasferire il contenuto di ciascuna provetta in una nuova provetta per microcentrifuga e centrifugare per 30 minuti.A 13.000 volte, G, trasferire il supinato in una nuova provetta per microcentrifuga. Dopo aver determinato la concentrazione proteica con un metodo precedentemente stabilito, conservare gli estratti proteici in aliquote da 10 microlitri a meno 80 gradi Celsius. Iniziare questa parte del protocollo preparando il numero appropriato di provette da microcentrifuga etichettate per le diluizioni dell'estratto proteico e il tampone di reazione della telomerasi per le seguenti soluzioni su ghiaccio.10 x miscela di reazione trappola DS primer dn tps, acqua ultrapura ed estratti proteici diluiscono la soluzione dell'estratto proteico fino a una concentrazione finale di un microgrammo per microlitro. Utilizzando acqua ultrapura, eseguire tutto il pipettaggio utilizzando i puntali del filtro per prevenire la contaminazione o la reazione dei telomeri. Ogni campione richiede una miscela di reazione dei telomeri composta da due microlitri di trappola Mescolare un microlitro di primer TS, un microlitro di DN NTP e 15 microlitri di acqua ultrapura per più campioni.Moltiplicare questi volumi per il numero di campioni più uno, aggiungere 19 microlitri della miscela di reazione MASE a ciascuna provetta di reazione, seguiti da un microlitro dell'estratto proteico diluito. Per un volume finale di 20 microlitri, posizionare le provette di reazione in un bagno d'acqua preriscaldato a 30 gradi Celsius per 45 minuti. 15 minuti prima della fine della terza reazione, prepararsi per l'amplificazione dei prodotti della terza reazione utilizzando le seguenti soluzioni, un primer CX, un tampone di titanio e acqua ultrapura.Ogni campione richiede una miscela di reazione PCR composta da 2,5 microlitri di tampone tecnico in titanio, un microlitro di primer CX, due microlitri di acqua ultrapura e 0,5 microlitri di polimerasi tecnologica in titanio per più campioni. Moltiplicare questi volumi per il numero di campioni più due. Aggiungere sei microlitri della miscela di reazione PCR a ciascuna provetta PCR e aggiungere l'intero volume con la reazione mase a ciascuna provetta.Per un volume finale di 26 microlitri, inserire le provette per PCR in un termociclatore per PCR ed eseguire il seguente programma, 90 gradi Celsius per due minuti, seguiti da 34 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi, 60 gradi Celsius per 30 secondi e 72 gradi Celsius per 45 secondi. E gli ultimi due minuti a 72 gradi Celsius.Al termine della reazione PCR, conservare i prodotti PCR a meno 20 gradi Celsius. Per preparare le rose d'uovo per la colata del mini gel, aggiungere 25 millilitri di tampone per elettroforesi TBE raffreddato e una barra di agitazione a un becher che è da due a quattro volte il volume della soluzione tampone e iniziare a mescolare. Quindi cospargere lentamente 1,125 grammi di polvere aros ad alta risoluzione.Mentre la soluzione si mescola rapidamente, rimuovere la barra a stella. Coprire il bicchiere con pellicola trasparente e praticare un piccolo foro per la ventilazione. Quando si colpisce l'agros, è fondamentale raggiungere il punto di ebollizione per sciogliere completamente l'agros.Assicurati di prestare la massima attenzione al bicchiere nel microonde per assicurarti che la schiuma generata non fuoriesca. Scaldare il becher nel microonde a bassa potenza per tre minuti, dopodiché passare ad alta potenza e riscaldare la soluzione a impulsi brevi, facendo attenzione per evitare fuoriuscite. Gettare il gel in un apparecchio orizzontale per mini gel e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente Dopo che il gel si è solidificato, il gel per 20 minuti a quattro gradi Celsius.Prima dell'uso per l'elettroforesi, caricare ogni corsia con 25 microlitri di campione trappola e far funzionare a 110 volt per tre ore in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius mentre il gel è in funzione. Preparare una soluzione di lavoro per tre coloranti di acido nucleico aggiungendo 15 microlitri di 10.000 x soluzione madre per coloranti di acido nucleico a 50 millilitri di acqua distillata doppia con cloruro di sodio molare 0,1. Al termine dell'elettroforesi dei campioni, colorare il gel per 20 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente.Infine, utilizzare un illuminatore trans UV con una lunghezza d'onda di 302 nanometri. Per visualizzare la scala della trappola, l'attività dei telomeri delle bande di DNA è stata rilevata nelle regioni del cervello del topo sia con i saggi di trappola tradizionali che con quelli modificati. Una migliore visualizzazione e risoluzione dei prodotti del DNA dei telomeri è stata osservata con il test modificato, come si vede dalla lunghezza e dall'intensità della scala del DNA.Una graduale riduzione dei prodotti del DNA dei telomeri è stata osservata quando sono state utilizzate concentrazioni decrescenti di estratti proteici nel test trappola modificata, suggerendo la sua sensibilità per il rilevamento dell'attività dei telomeri a concentrazioni più basse di proteine, il rilevamento dell'attività della telomerasi mediante il test modificato in tre regioni cerebrali di topi femmina e maschio di un mese non ha mostrato differenze significative. Tuttavia, nei topi di tre mesi, è stata mostrata una maggiore attività della telomerasi nel lobo frontale e nel tronco encefalico rispetto al cervelletto, come rivelato dall'intensità delle bande di DNA e dalla lunghezza della scala dei prodotti del DNA. Durante la transizione del topo all'età adulta, l'attività del toma aumenta nel lobo frontale e diminuisce nel tronco encefalico e nel cervelletto.L'attività dei telomeri ome sembra anche essere più alta nel lobo frontale nelle femmine. A differenza dell'attività dei telomeri più elevata nel tronco encefalico e nel cervelletto nei maschi, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei o sette ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare facilmente l'attività del thoma nel tuo tessuto preferito.

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Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit analisi può essere utilizzato per analizzare e quantificare 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all'interno di un luogo spe specifico. Il kit distingue 5-5-mC da HMC con l'aggiunta di glucosio al gruppo ossidrilico di 5-HMC tramite una reazione enzimatica che utilizza β-glucosiltransferasi (T4-BGT). Quando 5-HMC si verifica nel contesto di CCGG, questa modifica converte un sito cleavable MspI a un non-cleavable sito.

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale

Un metodo preciso, corto, sofisticato ed economico è descritto che valuta la lunghezza dei telomeri nei diversi tessuti e specie utilizzando RT-PCR quantitativa. Inoltre, descriveremo un semplice test per valutare l'attività della telomerasi come test dorsale complementare per la lunghezza dei telomeri.

Lunghezza dei telomeri e telomerasi attività; Un Yin e Yang di senescenza cellulare

Descriviamo le procedure per l'etichettatura e la genotipizzazione topi appena nati e di generare colture neuronali primarie da loro. La genotipizzazione è rapido, efficiente ed affidabile, e consente l'estrazione automatica acidonucleico. Ciò è particolarmente utile per i mouse neonatale letali e le loro culture, che richiedono la preventiva realizzazione di genotipizzazione.

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

Il telomero e la telomerasi svolgono un ruolo essenziale nell'invecchiamento e nella tumorigenesi. L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come generare due alleli knock-in della telomerasi inducibili murini e come utilizzarli negli studi di degenerazione/rigenerazione tissutale e cancro.

Utilizzando Murine inducibile telomerasi alleli in Studi di Tissue Degeneration / Regeneration e il cancro

L'ibridazione in situ dell'RNA (ISH) consente la visualizzazione degli RNA nelle cellule e nei tessuti. Qui mostriamo come la combinazione di RNAscope ISH con immunoistochimica o coloranti istologici possa essere utilizzata con successo per rilevare mRNA localizzati negli assoni in sezioni di cervelli di topo e umani.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) sintetizza non solo DNA telomerico, ma anche RNA double-stranded attraverso attività RNA polimerasi RNA-dipendente. Qui, descriviamo un neocostituita dosaggio per rilevare attività RNA polimerasi RNA-dipendente di TERT endogeno.

Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

Qui, presentiamo un protocollo per generare cloni delle cellule di cancro che contiene un tag di sequenza MS2 presso un singolo subtelomeriche. Questo approccio, basandosi sul sistema MS2-GFP, permette la visualizzazione delle trascrizioni endogene di telomerica ripetizione-contenente RNA (TERRA) espresso da un singolo telomero in cellule viventi.

Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

Qui, descriviamo un protocollo per generare un modello murino femminile vitale con inattivazione cromosomico X non casuale, cioè il cromosoma X ereditato dalla materna è inattivo nel 100% delle cellule. Descriviamo anche un protocollo per testare la fattibilità, la tollerabilità e la sicurezza della riattivazione farmacologica del cromosoma X inattivo in vivo.

Un modello di mouse non casuale per la riattivazione farmacologica di MECP2 sul cromosoma X inattivo

Abbiamo convertito con successo il saggio di protocollo di amplificazione (TRAP) di teleomere standard per essere impiegato nelle reazioni a catena della polimerasi digitale delle gocce. Questo nuovo saggio, chiamato ddTRAP, è più sensibile e quantitativo, permettendo una migliore rilevazione e analisi statistica dell'attività telomerasi all'interno di varie cellule umane.

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): adattamento del protocollo di amplificazione di ripetizione telomere a droplet reazione a catena della polimerasi digitale

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

Scopri come misurare l'attività della telomerasi nei tessuti cerebrali di topo con il saggio TRAP non radioattivo. Questo metodo efficiente rivela differenze tra maschi e femmine.

La telomerasi attività nelle varie regioni del cervello di topo: telomerasi non radioattivo Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay (Video) | JoVE Journal

La telomerasi attività nelle varie regioni del cervello di topo: telomerasi non radioattivo Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

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