Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare gel di poliacrilammide o PA per colture cellulari con microsfere fluorescenti incorporate molto vicino alla superficie del gel. Ciò si ottiene funzionalizzando prima i vetrini di copertura con poli-D lisina. Il secondo passo consiste nel rivestire i vetrini di copertura con una soluzione contenente microsfere fluorescenti.

I gel PA successivi sono formulati mescolando concentrazioni appropriate di bis, acrilammide e acrilammide e inseriti tra una superficie sottostante e il lato funzionalizzato dei vetrini di copertura. Il passaggio finale consiste nel funzionalizzare il gel con una proteina della matrice extracellulare e cellule di coltura sulla superficie del gel. In definitiva, la microscopia della forza di trazione viene utilizzata per misurare le forze meccaniche esercitate dalle cellule a seguito della deformazione del substrato indotta dalle cellule.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la tradizionale fabbricazione PHL, è che localizza le microsfere fluorescenti in una posizione nota all'interno della profondità del gel, consentendo un calcolo più accurato delle forze di trazione cellulare. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la polimerizzazione spaziale deve essere effettuata durante la funzionalizzazione dei vetrini di copertura al fine di garantire che i bit di fluorescenza si trasferiscano correttamente al PHL First place. Il coperchio in vetro precedentemente pulito scivola su una superficie grattugiata in modo che non si tocchi.

Per facilitare l'interazione con i vetrini, rivestire l'intera superficie dei vetrini coprioggetti con 0,1 milligrammi per millilitro di poli-D lisina per un'ora. Durante questo periodo, eseguire una diluizione da uno a 10.000 della soluzione colloidale di 0,1 micrometri di diametro. Microsfere fluorescenti rosse con acqua deionizzata per ottenere una densità di particelle di circa una microsfera per 20 micron quadrati sulla superficie del gel.

Mettere la soluzione diluita in un bagnomaria ad ultrasuoni per 30 minuti. Dopo un'ora, usa una pinzetta per sollevare con cautela ogni vetrino coprioggetti e asciugarlo con aria. Quindi rimettere i vetrini del coperchio asciutto sulla superficie grattugiata.

Una volta rimossa la soluzione colloidale diluita dal bagno a ultrasuoni, pipettare 150 microlitri di soluzione su ciascun vetrino coprioggetti. Dopo 10 minuti, usa una pinzetta per sollevare con cautela ogni vetrino coprioggetti e asciugarlo con aria. Una volta che i vetrini coprioggetti asciutti sono stati riportati sulla superficie graduata, conservarli al buio fino al momento dell'uso.

Quindi, stendere il numero desiderato di piastre di Petri con fondo di vetro su una superficie piana in una cappa chimica. Coprire la parte di vetro di ogni capsula di Petri. Micro pozzetto con il 97% di tre amminopropil trimetile per sette minuti per l'attivazione chimica.

Dopo sette minuti, riempire la capsula di Petri con acqua deionizzata e gettare la soluzione in un contenitore per rifiuti. Coprire accuratamente la parte di vetro di ciascuna capsula di Petri. Bene con una soluzione di glutaraldeide allo 0,5% precedentemente preparata per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, riempire la capsula di Petri con acqua deionizzata e smaltirla in un contenitore per rifiuti per sciacquare e rimuovere la pelle di glutaraldeide. Prima di miscelare i componenti della soluzione di gel di poliacrilammide, spostare i vetrini funzionalizzati nella cappa chimica in modo che siano facilmente accessibili, consentendo il rapido inserimento del gel con le piastre di Petri con fondo in vetro. Dopo aver miscelato la soluzione di gel in una provetta da centrifuga da 15 millilitri, miscelare in successione immediata il 40% di acrilammide, il 2% di acrilammide e l'acido acrilico.

Per ottenere l'elasticità della matrice desiderata, aggiungere 100 millimolari di HEP, il 10% di ammonio per solfato e unire le quantità corrispondenti all'elasticità della matrice desiderata. Per completare la soluzione in gel, pipettare immediatamente 15 microlitri di soluzione in gel al centro della porzione in vetro delle piastre di Petri. Dopo aver raccolto un vetrino di vetro funzionalizzato con una pinzetta, capovolgerlo in modo che le perle fluorescenti si trovino sul lato a contatto con la soluzione in gel.

Quindi stendere delicatamente il vetrino coprioggetto sopra il gel di poliacrilammide ora liquido in modo che il lato funzionalizzato sia a contatto con il gel. Successivamente, capovolgi tutte le piastre di Petri per evitare gli effetti della gravità sulle nanoparticelle fluorescenti. Polimerizzazione in livelli più bassi del gel di poliacrilammide.

Dopo la polimerizzazione, capovolgere nuovamente le piastre di Petri e riempirle con BS. Toccare con cautela la parte di vetro della capsula di Petri e il contorno del vetrino coprioggetto usando una pinzetta per raschiare la circonferenza del vetrino coprioggetto. Seguono diversi cicli di raschiatura. Rimuovere il vetrino coprioggetto e smaltirlo in un apposito contenitore per rifiuti taglienti.

Dopo aver rimosso tutti i vetrini, posizionare il coperchio della capsula di Petri su ogni capsula e conservare a quattro gradi Celsius. Una volta che i gel di poliacrilammide si sono riscaldati a temperatura ambiente, utilizzare una pompa a vuoto in una cappa biologica per rimuovere tutto il PBS dalle piastre con fondo di vetro contenenti la pipetta di gel precedentemente preparata per immergere la soluzione su ciascun gel in modo che il gel sia completamente sommerso. Dopo l'incubazione a temperatura ambiente per almeno un'ora, aggiungere da 150 a 250 microlitri di una soluzione di H-S-E-D-C precedentemente preparata per coprire la superficie del gel e riempire il pozzetto del fondo di vetro della capsula di Petri.

Quindi incubare i gel a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Una volta che la soluzione N-H-S-E-D-C è stata rimossa sotto vuoto, aggiungere 150 microlitri di una soluzione di fibronectina precedentemente preparata a ciascun gel. Ancora una volta, incubare a temperatura ambiente per 35 minuti per consentire l'adesione della fibronectina.

A questo punto, scaldare il terreno cellulare PBS e la tripsina a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Sciacquare i gel cinque volte con acqua deionizzata sterile. Aspirando l'acqua tra un risciacquo e l'altro, coprire i gel, lasciandoli nella cappa.

Aggiungere un millilitro di tripsina per 25 centimetri quadrati al pallone contenente le cellule. Dopo che le cellule sono state sollevate dal pallone, diluire la tripsina con mezzi cellulari. Quindi contare le cellule utilizzando un emocitometro in base alla superficie del gel.

Determinare il numero di cellule necessarie per gel per una densità finale di posizionamento delle cellule di 3000 cellule per centimetro quadrato, diluire o concentrare la sospensione in modo tale che 150 microlitri della miscela di terreni cellulari contengano questo numero di cellule. Quindi Eloqua uno 50 microlitri di sospensione cellulare su ciascun gel. Seguendo questo luogo, le piastre di Petri contenenti cellule in un incubatore per 30 minuti.

Dopo aver rimosso con cura le piastre di Petri dall'incubatrice, riempire il resto della piastra di Petri con circa due millilitri di terreno in modo che la superficie della piastra sia completamente sommersa. Riposizionare le piastre di Petri nell'incubatrice fino all'acquisizione dell'immagine. Una volta preparata per l'imaging, posizionare delicatamente una delle piastre di Petri sul tavolino del microscopio.

Dopo aver rimosso il coperchio della piastra di Petri per l'imaging DIC, individuare una singola cellula e acquisire una singola immagine fissa della cellula in DIC senza spostare il tavolino del microscopio. Passa la modalità di imaging alla fluorescenza. Concentrati sulle microsfere fluorescenti e registra un'immagine delle microsfere.

Rimuovere con cautela il terreno cellulare dalla capsula di Petri con la pipetta e aggiungere lo 0,05% di tripsina EDTA. Concentrati sull'immagine DIC per mostrare il gel da cui la cellula si è staccata. Quindi visualizza le microsfere sotto la cellula dopo che le cellule si sono staccate.

L'imaging confocale è stato utilizzato per determinare che le perle si trovavano sotto la superficie del gel e per quantificare la loro posizione precisa, le perle fluorescenti di dimensioni e lunghezza d'onda diverse da quelle all'interno del gel sono state lasciate depositare sulla superficie. La posizione delle perle depositate funge da riferimento per la superficie superiore del gel, dove le cellule applicano la forza sull'aderenza. Dopo l'imaging confocale, è stata calcolata la distanza tra le nanoparticelle fluorescenti incorporate e quelle sulla superficie.

Questa distanza determinava la profondità precisa delle perle all'interno del gel. Qui è mostrata la distribuzione spaziale del cordone e la vista proiettata sul piano YZ. La scala fornisce la profondità di tutte le perle dalla superficie del gel.

La profondità media delle perle da 0,1 micron è di 619 nanometri, 467 nanometri, 278 nanometri per i gel di poliacrilammide di rigidità rispettivamente di 10 e 40 kilopascal. Le profondità corrispondenti per le perle di un micron di diametro sono meno 20 nanometri nei gel da 40 kilopascal, 12 nanometri nei gel da 10 e 1.255 nanometri nei gel da un kilopascal. La profondità delle perle disperse in tutto il gel è stata misurata e confrontata con le profondità.

Utilizzando la tecnica presentata. Qui viene mostrata la variabilità della dispersione delle perle all'interno della profondità di un gel di poliacrilammide utilizzando i metodi di fabbricazione tradizionali. Il campo di spostamento per una cella di fibroblasti e il corrispondente strato di perline fluorescenti sono mostrati qui.

Le perle vicino alla periferia dell'immagine appaiono leggermente sfocate, il che è un effetto ottico dovuto all'obiettivo a immersione in acqua. Dopo l'aggiunta di tripsina, la cellula viene rilasciata dalla superficie con conseguente ritorno della superficie deformata del gel di poliacrilammide al suo stato originale. Una volta padroneggiata, questa tecnica di fabbricazione e funzionalizzazione PHL può essere eseguita in sei ore se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare gel di poliacrilammide con microsfere fluorescenti, localizzate in una posizione nota all'interno della profondità del gel vicino alla superficie della coltura cellulare. Per un calcolo più accurato delle forze di trazione delle celle.