Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare i batteri e l'attività della polmonite da streptococco utilizzando il test di sovrapposizione. Ciò si ottiene infilzando prima il ceppo produttore su una piastra TSA. Nella seconda fase, la miscela di ceppo di sovrapposizione viene preparata e quindi pipettata lentamente sulla piastra TSA contenente il ceppo produttore a gradini.

Nella fase finale, viene valutata l'attività batterica. In definitiva, il saggio di sovrapposizione può essere utilizzato per mostrare l'inattività dei batteri o la produzione di feromoni da parte del ceppo di interesse accoltellato. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la purificazione diretta della batterina, è che questo metodo è un modo rapido per stabilire una serie di batteri, l'inattività e per esaminare più ceppi per i batteri in produzione.

A dimostrare la procedura sarà Natalie Marchek, una studentessa laureata nel mio laboratorio Per preparare i batteri in produzione, iniziare strisciando il ceppo pneumococcico di interesse su una piastra TSA di sangue di pecora al 5% e incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. La mattina successiva pipettare da 3000 a 4.000 unità di catalizzatori su piastre contenenti 25 millilitri di TSA e utilizzare perle di vetro sterili per distribuire i catalizzatori sulle piastre. Dopo aver lasciato asciugare le piastre per circa 10 minuti sotto una cappa di sicurezza biologica, raccogliere una quantità visibile di batteri su un puntale della pipetta e infilzare il puntale della pipetta nella piastra TSA essiccata.

Se possibile, includere un noto produttore di batteri come controllo positivo e il ceppo da utilizzare nella sovrapposizione come controllo negativo, fornendo uno spazio adeguato tra le pugnalate in modo che gli aloni di crescita non si sovrappongano. Quindi incubare le colture di pugnalata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per sei ore il giorno prima del test di sovrapposizione, inoculare da cinque a 10 colonie del ceppo pneumococcico da testare in provette di vetro contenenti cinque millilitri di terreno THY contenente lo 0,5% di estratto di lievito. Quindi chiudere i coperchi di queste colture di ceppi di glicerolo e incubarle in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius senza agitare.

Dopo quattro o cinque ore, capovolgere delicatamente i tubi un paio di volte e poi misurare l'od. Quando le colture hanno raggiunto un OD due 60 da 0,3 a 0,5, aggiungere glicerolo a una concentrazione finale del 20%, quindi aliquotare le colture in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e conservare le provette a meno 80 gradi Celsius. La mattina successiva scongelare un'aliquota di brodo di glicerolo a temperatura ambiente.

Quindi, poco prima dell'applicazione di sovrapposizione, mescolare cinque millilitri di THY 3000 a 4.000 unità di catalizzatore e 200 microlitri di stock di glicerolo in un tubo conico da 15 millilitri. Per i ceppi batterici reporter, aggiungere 50 microlitri di Xcel alla miscela di rivestimento utilizzando un tubo conico per piastra. Mettere la miscela di copertura a temperatura ambiente mentre la miscela è equilibrante sciogliere il solido TSA in un forno a microonde, quindi metterla a bagnomaria a 55 gradi Celsius.

Quando il TSA fuso si è raffreddato a 55 gradi Celsius, aggiungere rapidamente tre millilitri di TSA alla miscela di rivestimento e pipettare su e giù più volte con una pipetta da cinque millilitri. Facendo attenzione a non introdurre bolle, pipettare lentamente la miscela di rivestimento direttamente sulla piastra TSA pugnalata. Dopo alcuni minuti, quando la piastra si è indurita e senza ruotare la piastra, riposizionare con cura la coltura di pugnalata sovrapposta nell'incubatore per la coltura notturna.

La mattina successiva osserva la crescita notturna. Le placche dovrebbero apparire opache a causa della crescita del ceppo di rivestimento, tranne nelle aree in cui si è verificata l'inibizione o la segnalazione dei feromoni. Ci sono due possibili risultati per il saggio di sovrapposizione in questo esperimento rappresentativo.

Dopo la coltura notturna, è stata osservata una zona di clearance che circondava il ceppo pugnalato, indicando che questo ceppo di sovrapposizione è sensibile ai peccati batterici prodotti. Si noti anche il vortice del ceppo pugnalato nella miscela di rivestimento. In questo esperimento, il ceppo di rivestimento era immune alla secrezione del batterina, come indicato dall'assenza di un alone che circondava la pugnalata.

È anche possibile che il ceppo pugnalato non secerna batterina per il test di segnalazione. Sono possibili due diversi risultati. In questo esperimento, il ceppo pugnalato ha secreto un feromone che ha interagito con l'istidina chinasi del ceppo di sovrapposizione, come osservato dalla zona blu che indica la rottura di xal in questa immagine.

Se il feromone non attiva la trascrizione del locus BLP nel ceppo del reporter, o se il ceppo pugnalato non secerne un feromone, la rottura della scala X non si verificherà come osservato in questa immagine Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi mutazionale o il sequenziamento, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se un'attività inibitoria apprezzabile è attribuibile al locus BLP o se è una mancanza di attività a causa di una mutazione nel gene trasportatore.