Name: Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Impara a genotipizzare rapidamente i topi neonati e a stabilire colture neuronali primarie su strato alimentante gliale. Questo metodo efficiente facilita lo studio di modelli murini letali neonatali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano i ricercatori dell'Università dell'Iowa, i dottori Luis Tecedor, Ines Martins e Beverly Davidson per le istruzioni e i commenti utili riguardanti le colture striatali, e i dottori Kara Gordon, Nicole Bode e Pedro Gonzalez-Alegre per l'assistenza e le discussioni sulla genotipizzazione. Ringraziamo anche il Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) per gli utili commenti riguardanti il tatuaggio, e il Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) per gli utili commenti riguardanti la cultura del topo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'American Heart Association, del Dipartimento della Difesa (premio Peer Reviewed Medical Research Program W81XWH-14-1-0301), della Dystonia Medical Research Foundation, della Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, della National Science Foundation e della Whitehall Foundation (NCH).

L'autore (Zhengmin Huang) è il presidente di EZ BioResearch LLC che produce i reagenti descritti in questo articolo.

Il protocollo presentato qui comprende procedure per tatuaggi per etichettare / individuare i topi, per la genotipizzazione topi da punte di coda, e per la coltura neuroni del cervello del mouse a bassa densità. In un giro di esperimenti usando 6-8 cuccioli, queste procedure richiedono tipicamente ~ 0,5 ore, ~ 4 ore e ~ 2 ore, rispettivamente, per un totale di 6-7 ore. Questo rende pratico per un singolo sperimentatore per completare tutte le procedure necessarie dal momento della nascita i cuccioli &#39;del fasciame di...

Modelli di roditori di malattie genetiche sono dimostrati utili per stabilire le funzioni fisiologiche di proteine ​​normali e acidi nucleici, così come le conseguenze fisiopatologiche di difetti di questi. Gli esempi includono topi deficienti per proteine ​​coinvolte in funzioni cellulari chiave, così come i modelli murini di malattie come il morbo di Alzheimer. Tuttavia, alcune manipolazioni genetiche possono portare a letalità neonatale poco o pochi giorni dopo la nascita. In questi casi, colture primarie sono uno strumento importante perché le cellule vive sono disponibili presso i cuccioli embrionali o neonatali prima della morte, possono essere mantenute per almeno un paio di settimane in vitro, e in questo periodo precoce dello sviluppo neuronale può essere seguito da esperimenti biochimici, funzionali e morfologiche. Per le colture primarie, può essere utile al piatto i neuroni a bassa densità; ciò rende possibile visualizzare il somata individuale, dendriti, alberi assonale e nervo Termisegnali ad alta risoluzione spaziale. Tuttavia, la sopravvivenza e la differenziazione dei neuroni a bassa densità richiede tipicamente che sono piastrate su uno strato alimentatore gliali, co-coltura con cellule gliali in assenza di contatto fisico con loro, o coltivati ​​in terreno condizionato dalla glia 1. La creazione di colture neuronali bassa densità su strati di alimentazione gliali può dipendere genotipizzazione veloce e affidabile anticipo - entro poche ore a differenza di alcuni giorni. La velocità è particolarmente importante quando il genotipo neuronale deve essere abbinato a quello di uno strato alimentatore gliali preparato. Come esempio più pratico, può essere necessario decidere quali cuccioli di genotipo che da utilizzare nelle culture generano, per ottimizzare l&#39;efficienza di un esperimento. Qui mostriamo il protocollo di lavoro che è stato usato per un veloce, semplificato e affidabile genotipizzazione del mouse in precedenti pubblicazioni 2-6. Mouse e codeun kit disponibile in commercio vengono utilizzati. Questo protocollo comprende un&#39;unica fase di estrazione degli acidi nucleici dal tessuto, e non richiede né una purificazione passo-acido nucleico, né l&#39;uso di un tampone di terminazione (&#39;fermata soluzione&#39;). L&#39;affidabilità di questo metodo genotipizzazione è illustrato presentando i risultati di una serie di prove in cui le differenze sono introdotte rispetto alla quantità iniziale di campioni, l&#39;età degli animali e la lunghezza degli ampliconi PCR. Questo kit offre i vantaggi di estrazione e affidabilità automatizzato. Per motivi di essere completa, l&#39;uso di tatuaggi per l&#39;identificazione a lungo termine dei topi genotipizzati è anche dimostrato. Il tatuaggio viene ottenuto applicando inchiostro tatuaggio al derma della pelle (sotto l&#39;epidermide) 7. Una procedura è descritta per tatuaggi i cuscinetti delle zampe di topi neonati o di 1 giorno, anche se tatuaggi possono essere applicati ad altre parti del corpo, come code e dei piedi, e Animals di tutte le età. Inoltre, sarà dimostrato procedure per la placcatura e coltivando neuroni di topo a bassa densità, basato sulla preparazione ottimale di diversi tipi di strati di alimentazione gliali 2,8. Usiamo un modello genetico del mouse della malattia neurologica ereditaria DYT1 distonia - una malattia autosomica dominante movimento causata da una mutazione nel gene TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La proteina codificata, torsinA, appartiene alle &quot;ATPases associati alle diverse attività cellulari&quot; (AAA +) famiglia di proteine, i cui membri generalmente eseguire funzioni chaperone-like, che assiste in: proteine ​​unfolding, proteina-complesso smontaggio, il traffico di membrana, e la fusione delle vescicole 10-13. I risultati mutazione in un in-frame delezione di un codone dell&#39;acido glutammico, e possono portare alla manifestazione di &#39;insorgenza precoce generalizzata isolato distonia&#39; 14,15. Tuttavia, il percorsomeccanismi ophysiological responsabili di questo disturbo rimangono poco conosciuti. In un modello di topo knock-in, l&#39;allele mutante è TOR1A tm2Wtd, citato qui di seguito come TOR1A AE. Eterozigoti AE-torsinA knock-nei topi sono pazienti umani vitali e geneticamente mimici con DYT1 distonia, mentre omozigote knock-in topi muoiono dopo la nascita 16,17, con la latenza di morte post-natale colpiti da background genetico 18. La morte precoce di omozigoti topi knock-in richiede che sia la genotipizzazione degli animali e la creazione di colture neuronali sono concluse rapidamente. Come altro esempio di genotipizzazione, Tfap2a (fattore di trascrizione AP-2α, attivando legame con le proteine ​​2α enhancer) sarà utilizzato. La proteina codificata da questo gene è importante nella regolazione più processi cellulari, quali la proliferazione, la differenziazione, la sopravvivenza e apoptosi 19.

<table><tbody><tr><td>REAGENTI - Macchina per</td><td></td><td></td><td></td>tatuaggi</tr><tr><td>Detergente</td><td>Identificazione e marcatura degli animali Systems, Inc.</td><td>NMCR3</td><td>Viene utilizzato per pulire gli aghi e il supporto dopo il tatuaggio.</td></tr><tr><td>Agente essiccante a macchina</td><td>Sistemi di identificazione e marcatura degli animali, Inc.</td><td>NDAR4</td><td>Viene utilizzato per asciugare gli aghi e il supporto dopo la pulizia.</td></tr><tr><td>Neonato Tatuaggio Pigmento Nero</td><td>Animale Identificazione E Sistemi Di Marcatura, Inc.</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore per la preparazione della pelle</td><td>Sistemi di identificazione e marcatura degli animali, Inc.</td><td>NSPA1</td><td>Q-tip.</td></tr><tr><td>Soluzione per la preparazione della pelle</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NSP01</td><td>Questo reagente rilascia un sottile strato di olio che migliora l'efficienza del tatuaggio e previene lo sbiadimento del tatuaggio, (informazioni dal venditore): 1) impedendo che la pelle non tatuata venga macchiata temporaneamente, consentendo così di valutare facilmente la qualità di un tatuaggio del cuscinetto della zampa prima che il cucciolo venga restituito alla sua gabbia di casa - la superficie della pelle macchiata può essere confusa con la pelle tatuata, 2) riducendo il danno alla pelle durante il tatuaggio... Ammorbidire la pelle e lubrificare l'ago aiuterà l'ago a penetrare nella pelle senza causare danni alla pelle e 3) impedirà all'ossigeno molecolare di entrare nella pelle, riducendo così le risposte infiammatorie alle specie reattive dell'ossigeno che possono essere generate.</td></tr><tr><td>REAGENTI - genotipizzazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di genotipizzazione EZ Fast Tissue/Tail PCR (formato provetta a strisce)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Nella soluzione 2X PCR Ready Mix è incluso un colorante rosso di caricamento per l'elettroforesi.</td></tr><tr><td>Soluzione di lisi tissutale A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Preparare la soluzione di estrazione del DNA mescolando 20 e micro; l di soluzione di lisi tissutale A e 180 &micro; l di soluzione di lisi tissutale B per campione.</td></tr><tr><td>Soluzione di lisi tissutale B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Preparare la soluzione di estrazione del DNA mescolando 20 & micro; l di soluzione di lisi tissutale A e 180 &micro; l di soluzione di lisi tissutale B per campione.</td></tr><tr><td>Acido acetico, glaciale</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio grado ottimizzato, grado di biologia molecolare</td><td>rpi</td><td>A20090-500&nbsp;</td><td>Utilizziamo gel di agarosio al 2% in tampone TAE contenente il colorante gel SYBR Safe DNA (diluito 10.000 volte) o bromuro di etidio (0,5 & micro; g/ml di volume del gel).</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico, sale disodico diidrato (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette filtrate, senza aerosol, 0,1-10 e micro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG104-96RS&nbsp;</td><td>Utilizzare puntali per pipette sterili e privi di DNA, RNasi e DNasi. Per tutte le fasi che coinvolgono il DNA, utilizzare puntali per pipette filtrati per evitare la contaminazione incrociata.</td></tr><tr><td>Punte per pipette filtrate, punte per filtri Premium Fit, 0,5-20 e micro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td><td>Utilizzare puntali per pipette sterili e privi di DNA, RNasi e DNasi. Per tutte le fasi che coinvolgono il DNA, utilizzare puntali per pipette filtrati per evitare la contaminazione incrociata.</td></tr><tr><td>Puntali per pipette filtrati, puntali filtranti Premium Fit, 1-200 &; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td><td>Utilizzare puntali per pipette sterili e privi di DNA, RNasi e DNasi. Per tutte le fasi che coinvolgono il DNA, utilizzare puntali per pipette filtrati per evitare la contaminazione incrociata.</td></tr><tr><td>Marcatore di peso molecolare, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>Utilizziamo uno di questi tre marcatori di peso molecolare.</td></tr><tr><td>Marcatore di peso molecolare, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore di peso molecolare, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>Provette per PCR, 8 strisce di provette con tappi superiori a cupola fissati singolarmente, naturale, 0,2 ml&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>Utilizzare provette sterili e prive di DNA, RNasi e DNasi. Una striscia da 8 provette è facile da maneggiare e da raggruppare i campioni rispetto ai singoli tubi.</td></tr><tr><td>Provette per PCR, Ultraflux Individual&nbsp;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>Utilizzare provette sterili e prive di DNA, RNasi e DNasi.</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga Seal-Rite da 0,5 ml, naturale</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>Utilizzare provette sterili e prive di DNA, RNasi e DNasi.</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stainin * 10.000x concentrazione in DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>rpi</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Primer per amplificare il gene Tor1a in &Delta; Topi knock-in E-torsinA</td> 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CC-3' (avanti) e 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (riferimento 18).<td></td><td></td><td> Questi primer sono stati utilizzati a una concentrazione finale di 1,0 ng/&micro; l (~0,16 &micro; M) (riferimento 2).</td></tr><tr><td>Primer per l'amplificazione del gene Tfap2a in topi wild-type:</td><td></td><td></td><td>5'-GAA, AGG, TGT, AGG, CAG, AAG, TTT, GTC, AGG, GC-3' (avanti), 5'-CGT, GTG, GCT, GTT, GGG, GTT, GCT, GAG, GTA-3' (inverso) per l'amplicone da 498 bp, 5'-CAC, CCT, ATC, AGG, GGA, GGA, CAA, CTT, TCG-3' (in avanti), 5'-AGA, CAC, TCG, GGC, TTT, GAT, GAT, CAT, TC-3' (inverso) per l'amplicone da 983 bp, e 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (avanti), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (retro) per l'amplicone da 1990 bp. Questi primer vengono utilizzati a 0,5 &micro;M.</td></tr><tr><td>REAGENTI - colture</td><td></td><td></td><td></td>cellulari</tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deossiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Vedere la sezione commenti di uridina per ulteriori informazioni.</td></tr><tr><td>Integratore B-27</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari 35 x 10 mm,</td> fiasche per colture cellulari <td>353001</td><td></td><td>falco</td> trattato con coltura</tr><tr><td>tissutale, T25, trattato per colture tissutali, collo inclinato, tappo a tappo, 25 cm2 Area di crescita, 70 ml</td><td>di 353082</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BD falconFiasche per colture cellulari, T75, trattate per coltura tissutale, collo inclinato, tappo ventilato, 75 cm2 Area di crescita, 250 ml</td><td>BD falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>tubo conico, polipropilene, 15 ml</td><td>BD falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Countess (contatore del numero di cellule) vetrini per camera</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Citosina &beta;-D-Arabinofuranoside cloridrato (Ara-C cloridrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645-100mg</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio (Destrosio) anidro, SigmaUltra, 99,5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Piatto, vetro Petri 100 x 15 mm</td><td>Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>DNasi Tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-200KU</td><td>La soluzione madre è preparata a 1.500 unità/20 &mu; l = 75.000 unità/ml in acqua distillata.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto glucosio, GlutaMAX, piruvato</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10569-010,</td> unità filtrante Fast PES da 500 ml<td></td></tr><tr><td>, 250 ml, membrana diametro 50 mm, 0,2 e micro; m Dimensione dei pori</td><td>Nalgene</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtrante PES veloce, 500 ml, membrana diametro 90 mm, 0,2 & micro; m Dimensione dei pori</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti, 12 mm rotondo, spessore 0,09&ndash; 0,12 mm, n. 0</td><td>Carolina</td><td>633017</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sali bilanciati di Hanks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387-10X</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, &ge; 99,5% (titolazione)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico, 37%, reagente A.C.S.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato, MgSO4&bull;( 7H2O), BioUltra, &ge; 99,5% (Fluka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di matrice di membrana basamentale Matrigel, senza rosso fenolo</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>Questo è il materiale di rivestimento per vetrini coprioggetti e fiasche. 1) Per prepararlo, scongelare la soluzione di matrice di membrana basale Matrigel su ghiaccio, che di solito richiede ~ 1 giorno. Utilizzando una pipetta preraffreddata, aliquotare la soluzione scongelata in palloni di T25 preraffreddati su ghiaccio e conservare i palloni a -20 °C. Per preparare la soluzione di Matrigel funzionante, scongelare il Matrigel aliquotato in un pallone su ghiaccio, diluire 50 volte aggiungendo una soluzione MEM preraffreddata e mantenere la soluzione diluita a 4 °C. È importante pre-raffreddare tutti i materiali di coltura e i terreni che entrano in contatto con Matrigel, tranne durante e dopo il rivestimento dei vetrini, per evitare che si formi prematuramente un gel. 2) Per rivestire i vetrini coprioggetti o i palloni di coltura con Matrigel, applicare la soluzione Matrigel sulla superficie. Prima di placcare le celle, è importante asciugare completamente la superficie. A questo scopo, potrebbe essere utile aspirare Matrigel durante la centrifugazione cellulare immediatamente prima di placcare le cellule e lasciare abbastanza tempo per l'essiccazione.</td></tr><tr><td>Terreno minimo essenziale (MEM)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Estensore di siero MITO+, 5 ml</td><td>di piastre multipozzetto BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>, piastra a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale</td><td>BD falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>piastre multipozzetto, piastra a 6 pozzetti trattata con coltura tissutale</td><td>BD falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1X), liquido</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Acido nitrico</td><td>VWR</td><td>bdh 3044</td><td></td></tr><tr><td>NS (integratore neuronale) 21&nbsp;</td><td>preparato in laboratorio</td><td></td><td>Fonte: referenza 69</td></tr><tr><td>pipette Pasteur, 5 &frac34; &rdquo; &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Usa questo tappo in cotone 5 &frac34; &rdquo; Pipetta Pasteur per triturazione cellulare. Lucidare preventivamente la punta a fuoco per levigare la superficie di taglio e ridurre il diametro interno al 50-80% dell'originale. Una punta troppo piccola distruggerà le cellule e ridurrà la vitalità cellulare, ma una punta troppo grande diminuirà l'efficienza della triturazione.</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur, 9" &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl), SigmaUltra, &ge; 99,0%</td>Pipetta sierologica <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>, 2 ml</td><td>BD falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica, 5 ml&nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica, 10 ml</td><td>BD falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica, 25 ml</td><td>BD falcon</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica, 50 ml&nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3, carbonato acido di sodio), SigmaUltra, &ge; 99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl), SigmaUltra, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH), pellet, 99,998% di metalli in tracce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico eptaidrato (Na2HPO4&bull;( 7H2O)), &ge; 99,99%, Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431478-250G</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio, SigmaUltra, &ge; 99,5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa, sterile, 0,2 & micro; m</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Siringa, 3 ml</td> BD <td>falcon</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina, Holo, plasma bovino</td><td>Calbiochem</td><td>616420</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue color, 0,4%</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Questo viene utilizzato per contare le cellule vive/morte. Rinnovare una vecchia soluzione di blu di tripano se viene riutilizzata molte volte (ad es più volte alla settimana per diverse settimane), perché formerà precipitati e risulterà in letture errate della densità cellulare.</td></tr><tr><td>Tripsina, tipo XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005-5G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA, 0,25%&nbsp;</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td>La soluzione madre è preparata a 50 mg di 5-fluoro-2'-deossiuridina e 125 mg di uridina in 25 ml di DMEM (8,12 e 20,48 mM, rispettivamente).</td></tr><tr><td>REAGENTI - immunocitochimica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo, coniglio policlonale anti-MAP2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo, topo monoclonale anti-GFAP</td><td>cocktail Merck Millipore</td><td>NE1015</td><td></td></tr><tr><td>ATTREZZATURA - tatuaggio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NEO&#8211; 9</td><td>Questo sistema di tatuaggio per neonati è un sistema elettrico che funziona spostando rapidamente gli aghi per tatuaggi a 1 o 3 punti verticalmente nella pelle. Attiva la macchinetta per tatuaggi una volta per circa 0,5 secondi, mentre le punte dell'ago per tatuaggi vengono mantenute perpendicolari alla superficie della pelle. Preferiamo il tatuaggio a tre aghi per massimizzare l'area tatuata, ma il tatuaggio a un ago è efficace su aree più strette, ad esempio le dita dei piedi, o se è necessario un controllo meccanico fine, ad es quando vengono tatuati i numeri. Due cicli di tatuaggio alla velocità più bassa (impostando "1" su 3 passaggi) sono in genere sufficienti per produrre un tatuaggio visibile e duraturo dei cuscinetti delle zampe.</td></tr><tr><td>ATTREZZATURA - genotipizzazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi, orizzontale, Wide Mini&#8211; Sottocella GT</td><td>BIO&#8211; RAD</td><td>170&#8211; 4405</td><td>I parametri tipici dell'elettroforesi sono l'intensità del campo elettrico a 6 V/cm e la durata di 25 minuti per un gel di 10 cm.</td></tr><tr><td>FluorChem 8800</td><td>ProteinSimple</td><td>FluorChem 8800</td><td></td></tr><tr><td>PCR, MJ Mini Termociclatore</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC-1148EDU</td><td>Le nostre reazioni PCR per il gene Tor1a in &#916; I topi knock-in E-torsinA sono i seguenti: 1 ciclo di denaturazione a 94 &#176; C per 3 min, 35 cicli di denaturazione a 94 &#176; C per 30 sec, ricottura a 58 &#176; C per 30 sec, estensione a 72 &#176; C per 2 min. Segue l'estensione finale a 72 &#176; C per 10 min, e tenendo premuto a 4 &#176;C.</td></tr><tr><td>Alimentazione, PowerPac Basic</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>ATTREZZATURA - coltura</td><td></td><td></td><td></td>cellulare</tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato, Countess</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10310</td><td>Questo contatore di cellule automatizzato misura separatamente la densità delle cellule vive e morte (non colorate e colorate con blu di tripano, rispettivamente). È importante conoscere l'intervallo ottimale di misure di densità: il contatore che utilizziamo ha la massima precisione nell'intervallo da 1 x 105 a 4 x 106 cellule/ml. Se i valori di densità delle celle misurati non rientrano nell'intervallo consigliato, regolare il volume di risospensione in modo appropriato.</td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica, Classe II, Tipo A2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-400</td><td>Questa cappa viene utilizzata per tutte le procedure di coltura cellulare, ad eccezione della dissezione cerebrale.</td></tr><tr><td>CO2 Incubatore, AutoFlow, controllo dell'umidità Camicia d'acqua</td><td>NUAIRE</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Banco pulito orizzontale</td><td>NUAIRE</td><td>NU-201-330</td><td>Questo banco pulito viene utilizzato per la dissezione cerebrale (passaggi 3.1.1 e 3.1.2 di "Dissezione cerebrale e dissociazione cellulare)".</td></tr><tr><td>Orbit LS Agitatore a bassa velocità</td><td>Labnet</td><td>S2030-LS-B</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL RC-6 Plus Centrifuga Superspeed</td><td>Fisher</td><td>46910 (centrifuga)/46922 (rotore)</td><td></td></tr></tbody></table>

rapida genotipizzazione degli animali seguito da stabilire colture primarie di neuroni del cervello

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Analisi ad alta risoluzione della morfologia e funzione dei neuroni di mammifero richiede spesso la genotipizzazione dei singoli animali seguita dall&#39;analisi di colture primarie di neuroni. Descriviamo una serie di procedure per: etichettatura topi appena nati per essere sottoposti a genotipizzazione, rapida genotipizzazione, e stabilire le culture a bassa densità di neuroni del cervello di questi topi. Topi individuali sono etichettati da tatuaggio, che permette l&#39;identificazione a lungo termine della durata in età adulta. La genotipizzazione del protocollo descritto è veloce ed efficiente, e consente l&#39;estrazione automatica di acidi nucleici con buona affidabilità. Ciò è utile in circostanze in cui il tempo sufficiente per la genotipizzazione convenzionale non è disponibile, per esempio, in topi che soffrono di letalità neonatale. Colture neuronali primarie sono generati a bassa densità, che permette esperimenti di imaging ad alta risoluzione spaziale. Questo metodo di coltura richiede la preparazione di strati di alimentazione gliali prima placcatura neuronale. Il pROTOCOLLO è applicata nella sua interezza ad un modello murino della distonia disturbo del movimento DYT1 (AE-torsinA topi knock-in), e colture neuronali sono preparati dal ippocampo, corteccia cerebrale e striato di questi topi. Questo protocollo può essere applicato a topi con altre mutazioni genetiche, nonché di altre specie animali. Inoltre, i singoli componenti del protocollo possono essere utilizzati per isolati sotto-progetti. Così questo protocollo avrà applicazioni larghe, non solo nel campo delle neuroscienze, ma anche in altri settori delle scienze biologiche e mediche.

Come esempio di applicazione di questo protocollo, risultati rappresentativi sono mostrati per etichettare topi tatuaggi, genotipizzazione affidabile in varie condizioni sperimentali, e stabilendo colture neuronali primarie su strati di alimentazione gliali. Tatuaggio Cuccioli appena nati sono stati etichettati sui cuscinetti delle zampe utilizzando un sistema tatuaggi ('Newborn' in Figura 1). Le etichette sono rimasti chiarament...

Descriviamo le procedure per l&#39;etichettatura e la genotipizzazione topi appena nati e di generare colture neuronali primarie da loro. La genotipizzazione è rapido, efficiente ed affidabile, e consente l&#39;estrazione automatica acidonucleico. Ciò è particolarmente utile per i mouse neonatale letali e le loro culture, che richiedono la preventiva realizzazione di genotipizzazione.

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di genotipizzare topi neonati e di generare colture neuronali a bassa densità su uno strato di alimentazione gliale. Ciò si ottiene genotipizzando rapidamente i topi appena nati utilizzando la punta della coda nella seconda fase. Lo stesso giorno, i cervelli vengono sezionati e coltivati come strati di alimentazione gliale.Poi, dopo alcune settimane, un altro gruppo di topi neonati viene rapidamente genotipizzato e le cellule neuronali vengono generate dal cervello dell'animale per la coltura sugli strati di alimentazione gliale preceduti. In definitiva, questo metodo può essere utilizzato per una genotipizzazione rapida e affidabile, nonché per la generazione di neuroni sani e cellule gliali. Ci sono due vantaggi principali di questo protocollo.Uno è che possiamo coltivare neuroni sani a una densità molto bassa per esperimenti di imaging pianendoli su uno strato fetale gliale. Il secondo vantaggio è che i topi appena nati possono essere genotipizzati in diverse ore, consentendo la corrispondenza dei genotipi dei neuroni e dello strato fetale gliale. Sono un assistente di ricerca nel laboratorio di Harta.Dimostrerò le procedure per la genotipizzazione e le colture. Inizia aggiungendo 200 microlitri di soluzione di estrazione del DNA a ciascuna provetta PCR contenente un campione. Posizionare la striscia di provette in un termociclatore PCR e quindi avviare l'estrazione del DNA al termine dell'estrazione.Rimuovere la striscia di tubi dal termociclatore e capovolgere i tubi cinque volte. Quindi trasferire quattro microlitri di estratto di DNA da ciascun campione in una provetta inutilizzata su una striscia di otto provette e mescolare il campione con 10 microlitri di due XPCR pronti. Mescolare due, due microlitri di primer diretti e inversi misti e quattro microlitri di acqua priva di nucleasi.Per ogni campione, posizionare i campioni in un termociclatore e avviare il programma di cicli termici. Al termine del programma, caricare 20 microlitri di ciascun campione amplificato o marcatore di peso molecolare direttamente nell'apposito pozzetto di un aros gel. Quindi eseguire il gel e acquisire immagini fluorescenti delle bande sotto la luce ultravioletta.Per rilevare i prodotti del DNA amplificato, iniziare rimuovendo le regioni di interesse da ciascun emisfero del cervello e quindi trasferire i tessuti cerebrali in una provetta da 15 millilitri. Lascia che il fazzoletto si depositi sul fondo del tubo e poi sostituisci la soluzione dalla parte superiore delle fette con da cinque a 10 millilitri di ghiaccio freddo. Soluzione di matassa con o senza siero fetale bovino come indicato in precedenza, aspirando completamente tutta la soluzione.Dopo il quarto lavaggio, utilizzare una siringa da tre millilitri per filtrare due millilitri di soluzione digestiva contenente tryin appena preparata attraverso una siringa da 0,2 micrometri. Filtrare direttamente nella provetta contenente i tessuti cerebrali e lasciare che la tripsinizzazione proceda a temperatura ambiente. Dopo 13 minuti, neutralizzare la reazione aspirando prima la maggior parte della soluzione di tripsina e poi aggiungendo da sette a 10 millilitri di soluzione di matassa ghiacciata con siero fetale bovino.Quindi sciacquare i fazzoletti in soluzione di Hank con o senza siero fetale bovino come appena dimostrato. Quindi, filtrare due millilitri di soluzione di dissociazione sui tessuti cerebrali. Quindi dissociare meccanicamente le cellule con un trier delicato da 10 a 20 volte utilizzando una pipetta in PE lucidata a fuoco con tappo di cotone.Continuare il trier fino a quando i pezzi di tessuto visibili scompaiono. Attendere tre minuti affinché i piccoli pezzi si depositino e quindi utilizzare la pipetta PE per trasferire circa 1,5 millilitri di soluzione in una provetta conica da 15 millilitri contenente tre millilitri di soluzione Hank ghiacciata con siero fetale bovino centrifugato nelle provette per 13 minuti a 185 Gs e quattro gradi Celsius. Quindi aspirare con cura il surnatante utilizzando la stessa pipetta pasteur.Risospendere delicatamente il pellet in un millilitro di terreno di preriscaldamento uno. Quindi aggiungere circa quattro millilitri di terreno di preriscaldamento. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura T 25 non rivestito e collocare il pallone in un incubatore per colture cellulari.In un giorno in vitro, sciacquare le cellule due volte con cinque millilitri di terreno di placcatura ghiacciato, una inclinando delicatamente il pallone più volte con un movimento vorticoso da sei a nove giorni. In vitro posizionare 100 microlitri di materiale di rivestimento con proteine della matrice extracellulare su vetrini di vetro in un piatto per colture cellulari e posizionare il piatto nell'incubatore per colture cellulari. Il giorno successivo, sciacquare il pallone aspirando tutta la soluzione all'interno del pallone e aggiungendo circa 13 millilitri di soluzione di matassa ghiacciata. Quindi aspirare completamente la soluzione.Quindi, filtrare quattro millilitri di una soluzione di tripsina EDTA più DNA direttamente sulle cellule e lasciare che le cellule si dissocino dal pallone di coltura cellulare in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo 13 minuti, neutralizzare la reazione con due millilitri di siero bovino fetale ghiacciato al 100% e utilizzare una pipetta da 5 a 10 millilitri per trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi lavare le cellule aggiungendo circa quattro millilitri di soluzione di matassa ghiacciata con centrifugazione di siero fetale bovino, quindi sospendendo nuovamente il pellet in un millilitro di terreno di preriscaldamento. Uno.Ora aspirare completamente il materiale di rivestimento dal coperchio, far scivolare e placcare circa 50 microlitri di cellule gliali risospese sui vetrini di copertura. Per stabilire lo strato di alimentazione gliale, incubare le cellule gliali per 20-60 minuti a 37 gradi Celsius, quindi aggiungere un millilitro di terreno di preriscaldamento, uno per ciascun vetrino coprioggetto mentre viene aggiunto il mezzo di placcatura. È utile utilizzare un'altra pipetta per premere sulla periferia del vetrino coprioggetti in modo che il vetrino coprioggetti non galleggi nel fluido.Dopo la coltura notturna. Sostituire il terreno con un millilitro di terreno di placcatura preriscaldato fresco, uno a due o tre giorni. In vitro, aggiungere 10 microlitri di inibitore mitotico a ciascuna coltura di strato di alimentazione per inibire la replicazione del DNA e la proliferazione delle cellule gliali a sette-nove giorni.In vitro, sostituire il terreno di coltura con un terreno di coltura preriscaldato due. Quindi impiattare delicatamente circa 50-100 microlitri di cellule neuronali di topo in un terreno di preriscaldamento due su ciascuno strato di alimentazione gliale. In questa immagine, il gene del tour one è stato amplificato dal DNA genomico, isolato dalle clip della coda di neonati, di cuccioli eterozigoti e omozigoti wild type del modello di distonia knockin DYT one.Bande separate per il tipo selvatico e gli alleli mutati sono chiaramente visibili. In questa figura sono mostrati due campi rappresentativi di una coltura neuronale ippocampale di topo. Sono stati generati dalla regione ippocampale CA tre, CA uno di topi wild type.14 giorni dopo la placcatura su uno strato di alimentazione gliale ippocampale prestabilito di topi di tipo selvatico nelle immagini di contrasto di interferenza differenziale, si possono osservare segni di buona salute, come un chiaro margine di processi neuronali estesi nel corpo cellulare neuronale e uno strato relativamente uniforme di cellule gliali. Ulteriore colorazione immunocitochimica per la mappa dei marcatori neuronali. In secondo luogo, si può osservare anche l'identificazione dei neuroni e dei loro processi in ciascun campo.Utilizzando questo protocollo, una genotipizzazione in un ciclo di coltura può essere completata in 67 ore. Questo protocollo è particolarmente utile per la coltura di neuroni di topi geneticamente modificati che possono morire diversi giorni dopo la nascita.

rapid-genotyping-animals-followed-establishing-primary-cultures-brain

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

Il protocollo descrive un sistema modello efficiente e riproducibile per studiare herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) latenza e riattivazione. Il dosaggio utilizza omogenei culture neurone simpatico e consente la dissezione molecolare del virus-neurone interazioni utilizzando una varietà di strumenti interferenza tra RNA e l'espressione di proteine ​​ricombinanti.

A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione

Un metodo di tracciare neuroni sinapticamente collegate è descritto. Usiamo specificità TVA di una cella a monte per sondare se una popolazione di cellule riceve input sinaptico da tipi di cellule geneticamente definiti.

Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

Il video dimostra una tecnica per la coltura di astrociti primari dalla corteccia del ratto. La corteccia viene dissociata meccanicamente per ottenere una sospensione omogenea di cellule gliali, che viene poi placcata su piastre rivestite di polipeptidi per promuovere la proliferazione selettiva degli astrociti. Successivamente, gli astrociti vengono dissociati enzimaticamente dalle piastre e trasferiti in terreni freschi, consentendo la coltura di astrociti puri.

Generare una coltura primaria di astrociti dal cervello di un cucciolo di ratto

Viene descritto un protocollo per generare un sistema di co-coltura costituito da neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), neuroni corticali primari e astrociti. Questo sistema di co-coltura consente di rilevare la formazione di contatti sinaptici e circuiti tra nuovi neuroni derivati da iPSC e neuroni corticali preesistenti che esprimono la canalrodopsina-2.

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

Le cause della degenerazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo durante il morbo di Parkinson non sono completamente comprese. I sistemi di coltura cellulare forniscono uno strumento essenziale per lo studio delle proprietà neurofisiologiche di questi neuroni. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato, che può essere utilizzato per la modellazione in vitro della neurodegenerazione.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Modifichiamo e implementare un protocollo precedentemente pubblicato che descrive la differenziazione rapida, riproducibile ed efficiente di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) in eccitatorio neuroni corticali 12. In particolare, la nostra modifica permette il controllo della densità delle cellule neuronali e uso su array micro-elettrodi per misurare le proprietà elettrofisiologiche a livello di rete.

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Presentato qui è un protocollo per la generazione spontanea di neurosfere arricchite in cellule progenitrici neurali da neuroni placcati ad alta densità. Durante lo stesso esperimento, quando i neuroni sono placcati ad una densità inferiore, il protocollo si traduce anche in colture di neuroni ratti primari prolungati.

Generazione di neurosfere da neuroni ippocampali primari misti e corticali isolati da E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Questo protocollo presenta un modo unico di generare colture cellulari del sistema nervoso centrale da cervelli di topo embrionali del giorno 17 per la ricerca neuro(immuno)logica. Questo modello può essere analizzato utilizzando varie tecniche sperimentali, tra cui RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria a flusso.

Stabilire colture cellulari miste neuronali e gliali da cervelli di topo embrionali per studiare l'infezione e l'immunità innata

Questo protocollo descrive una co-coltura microglia-neuronale stabilita da cellule neuronali primarie isolate da embrioni di topo ai giorni embrionali 15-16 e microglia primaria generata dal cervello di topi neonatali nei giorni post-natali 1-2.

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Impara a genotipizzare rapidamente i topi neonati e a stabilire colture neuronali primarie su strato alimentante gliale. Questo metodo efficiente facilita lo studio di modelli murini letali neonatali.

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

Esplora altri video