Name: Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per lalta Screening contenuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Impara a ordinare singole cellule in microcavità 3D per studiare la morfologia e la dinamica degli organelli cellulari. Questo metodo riduce la variabilità e migliora l'analisi in screening ad alto contenuto.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Riconosciamo L. Brino (impianto di screening Content IGBMC alta, Illkirch, Francia) per averci fornito l&#39;anticorpo anti-Giantin, M. Labouesse Lab. per C. elegans (IGBMC) e B. Séraphin Lab. per il lievito (IGBMC), E. Paluch e A. Hyman per le cellule HeLa fluorescenti (MPI-CBG, Dresda), J. Moseley (Dartmouth Medical School) e JQ Wu (Ohio State University) per le cellule di lievito di fissione; A. Hoël e ​​F. Evenou aiuto sperimentale, C. Rick (IBMC, Strasburgo, Francia) per assistenza tecnica, e JC Jeannot (Femto-st, Francia) per un aiuto nella microfabbricazione. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del CNRS, l&#39;Università di Strasburgo, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale e la ci-FRC di Strasburgo.

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li>
<li>Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+Micropatterned+Substrates+for+Single+Cell+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies.</a> PLoS ONE. 7, e37548(2012).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+cell+spreading+within+3D-micropatterned+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments.</a> Lab Chip. 11, 805-812 (2010).</li>
<li>Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-Engineered+3D+Scaffolds+for+Cell+Culture+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies.</a> Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).</li>
<li>Khetan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation-mediated+cellular+traction+directs+stem+cell+fate+in+covalently+crosslinked+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 12, 458-465 (2013).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat Meth. 7, 969-971 (2010).</li>
<li>Devices and methods for observing the cell division. , WO/2010/092116 (2010).</li>
<li>Ochsner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-well+arrays+for+3D+shape+control+and+high+resolution+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells.</a> Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).</li>
<li>Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , WO2013144302 (2012).</li>
<li>Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , WO2013135809 (2012).</li>
<li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotech%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).</li>
<li>Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolfe%2C+D+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).</li>
<li>Mehling, M., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Biotech%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture.</a> Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).</li>
<li>Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Still+and+rotating+myosin+clusters+determine+cytokinetic+ring+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction.</a> Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+single+cells+identifies+a+rare+subset+of+circulating+tumor+cells+with+malignant+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits.</a> Integr Biol. 6, 388-398 (2014).</li>
<li>Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">The promise of single-cell sequencing.</a> Nat Meth. 11, 25-27 (2014).</li>
<li>Allen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cell-free+extracts+of+Xenopus+eggs+and+demembranated+sperm+chromatin+for+the+assembly+and+isolation+of+in+vitro-formed+nuclei+for+Western+blotting+and+scanning+electron+microscopy+%28SEM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM).</a> Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).</li>
<li>Robbins, E., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotically+Synchronized+Mammalian+Cells%3A+a+Simple+Method+for+Obtaining+Large+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations.</a> Science. 144, (1964).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+binding+protein%2C+the+protein+that+binds+the+3%26%2334%3B+end+of+histone+mRNA%2C+is+cell+cycle+regulated+by+both+translational+and+posttranslational+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3&#34; end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).</li>
<li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Temporal+and+Spatial+Control+of+Cytokinesis+with+a+Myosin+II+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor.</a> Science. 299, 1743-1747 (2003).</li>
<li>Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoint+kinase+1+%28Chk1%29+is+required+for+mitotic+progression+through+negative+regulation+of+polo-like+kinase+1+%28Plk1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1).</a> Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).</li>
<li>Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRT-1%2FCalreticulin+and+the+E3+Ligase+EEL-1%2FHUWE1+Control+Hemidesmosome+Maturation+in+C.+elegans+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development.</a> Curr Biol. 20, 322-327 (2010).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> JoVE. , e4019(2012).</li>
<li>Saha, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin-related+protein+Mid1p+coordinates+the+assembly+of+the+cytokinetic+contractile+ring+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).</li>
<li>Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Drug+Efficacy+and+Toxicology+in+Three+Dimensions%3A+Using+Synthetic+Extracellular+Matrices+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery.</a> Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).</li>
<li>Futamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphobase%2C+an+Encyclopedic+Cell+Morphology+Database%2C+and+Its+Use+for+Drug+Target+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification.</a> Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

stampaggio replica è stato utilizzato per fabbricare i &#39;portauova. Il processo di fabbricazione non ha bisogno di una camera pulita; è facile e semplice, anche se una certa pratica può essere richiesto. In particolare, rilasciando il timbro PDMS è la fase più critica per produrre una vasta area di &#39;portauova&#39; alta qualità. Per questo motivo, particolare attenzione deve essere presa in questo passo. Se questo passaggio è più volte fallendo, prendere in considerazione per ottimizzare i parametri del plasma pul...

Di corrente in saggi cellulari in vitro sono bidimensionali (2D). Questa configurazione non è naturale per le cellule di mammifero e pertanto non è fisiologicamente rilevanti 1; cellule mostrano una varietà di forme, dimensioni e fenotipi eterogenee. Essi presentano gravi limitazioni aggiuntive quando applicato alle applicazioni di screening, come ad esempio una distribuzione disordinata all&#39;interno del piano e fenotipi estremi di organelli cellulari (fibre di stress, in particolare). Ciò è particolarmente importante in studi clinici per i test di droga, in cui i budget elevati vengono spesi ogni anno. La maggior parte di questi farmaci se non riescono quando applicata a modelli animali a causa della condizione coltura 2D artificiale nelle prime fasi di screening di farmaci. Inoltre, utilizzando questo approccio, organelli cellulari specifici non possono essere correttamente visualizzati, ad esempio l&#39;anello actomiosina cytokinetic durante la mitosi cellulare, e in generale strutture che si stanno evolvendo nel piano perpendicolare al piano di osservazione. Alcuninuovi test 2D sono stati proposti al fine di superare gli inconvenienti suddetti e importanti informazioni sull&#39;organizzazione citoscheletro sono stati osservati 2,3. Tuttavia, questi test ancora presenti una seria limitazione: celle mostrano un fenotipo molto diffuse a differenza di quanto si osserva in vivo, in cui le cellule presentano un&#39;architettura 3D. Tali artefatti associati al metodo di coltura possono innescare caratteristiche non fisiologici, come fibre di stress potenziate 1,4,5. Tridimensionali saggi di colture cellulari forniscono molteplici vantaggi rispetto ai 2D ambienti 6,7. Essi sono fisiologicamente più rilevanti, ed i risultati sono quindi significativi. Come esempio, cellule incorporati in idrogel mostrano strutture 3D-like ma le loro morfologie differiscono da una cella all&#39;altra 8,9. Tuttavia, le loro morfologie differiscono da una cella all&#39;altra, il che complica applicazioni di screening. Una strategia alternativa è quella di incorporare singolocellule in cavità microfabbricate 10,11. la posizione delle cellule, la forma, la polarità e l&#39;organizzazione interna delle cellule possono quindi diventare normalizzata. Oltre a fornire l&#39;architettura 3D-come le cellule, microcavità permette anche per gli studi di screening ad alto contenuto 10,12-14; singole cellule possono essere ordinati in microarray e organelli cellulari e le loro evoluzioni possono essere osservati in parallelo. Questa regolarità fornisce buone statistiche con un basso numero di cellule e migliori risoluzioni temporali / spaziale. Composti utili sono facili da identificare in maniera affidabile. In questo studio, dimostriamo la fabbricazione e l&#39;applicazione di un nuovo sistema di celle singola cultura 3D come ad alto contenuto di screening applicazioni 10,12,13. Il dispositivo è costituito da una matrice di microcavità elastomerici (10 5 cavità / cm 2), coniati &#39;eggcups&#39; (EC). Dimensioni e volume totale di CE in questo lavoro sono ottimizzati per il volume tipico delle singole cellule NIH3T3 e HeLadurante la divisione cellulare. Morfologia delle cavità cilindriche - - è selezionato per la forma delle cellule correttamente orientare per la visualizzazione dei processi attivi. Stampaggio replica viene utilizzato per una vasta gamma di modello CE su un (PDMS) strato sottile polidimetilsilossano aderito su un bicchiere coprivetrino 15,16. Le cellule vengono introdotti nella CE per centrifugazione. Riportiamo qui di osservazione e la normalizzazione degli organelli cellulari (stress fibers di actina, apparato del Golgi e nucleo) in 3D (CE) in confronto con le stesse celle 2D (piatta) superfici. Riportiamo anche l&#39;osservazione dei processi dinamici attivi quali la chiusura dell&#39;anello actomiosina cytokinetic durante la mitosi cellulare 17. Infine, mostriamo risultati di questa metodologia su altri sistemi con pareti rigide, come il lievito in erba, lievito di fissione e C. embrioni elegans che conferma l&#39;applicabilità della nostra metodologia per una vasta gamma di sistemi modello. Abbiamo poi presentiamo una p dettagliato ed esaustivoROTOCOLLO al fine di fabbricare e applicare le &quot;Portauova&quot; per microfabbricazione 3D. Il nostro approccio è semplice e non richiede una camera pulita. Prevediamo che questa nuova metodologia sarà particolarmente interessante per test di screening di farmaci e medicina personalizzata, in sostituzione di piastre di Petri. Infine, il dispositivo sarà utile per studiare le distribuzioni di cellule risposte a stimoli esterni, ad esempio nel cancro 18 o nella ricerca di base 19.

<table><tbody><tr><td>ddH20 (ultrapuro)</td><td>Millipore-Utilizzare</td><td></td> <td>sempre acqua fresca.</td></tr><tr><td>Parafilm (film plastico)</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Far aderire il Parafilm al banco da laboratorio utilizzando alcune gocce d'acqua e garantire una perfetta planarità della superficie.</td></tr><tr><td>Foto-maschera</td><td>Selba</td><td>-</td><td><a href="http://www.selba.ch/" name="RANGE! D4">http://www.selba.ch</a></td></tr><tr><td>Wafer di silicio</td><td>Siltronix</td><td>-</td><td><a href="http://www.siltronix.com/">http://www.siltronix.com/</a></td></tr><tr><td>SU-8 fotoresist</td><td>MicroChem</td><td>serie 2000</td><td><a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&nbsp; </a></td></tr> <tr><td>è necessario lavorare in una cappa aspirante; per ulteriori informazioni, consultare la scheda tecnica del produttore.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sviluppatore SU-8</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td><a href="http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm">http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&nbsp; </a></td></tr> <tr><td>è necessario lavorare in una cappa aspirante; controllare la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19030</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; regione=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; region=CA</a></td></tr><tr><td>Disponibile da più aziende.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote (reagente siliconizzante)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; regione=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; regione=FR&nbsp; </a</td></tr><tr><td>>dannoso, è necessario lavorare in una cappa aspirante; controlla la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorotrimetilsilano (TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">TMCS produce tossicità acuta per inalazione e per via cutanea, ed è altamente infiammabile (con ritorno di fiamma di accensione in grado di verificarsi a distanze considerevoli), di conseguenza dovrebbe essere utilizzato in una cappa aspirante lontano da fonti di accensione</td></tr><tr><td>Guanti in nitrile</td><td>Kleenguard</td><td>57372</td><td><a href="http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m">http://www.kcprofessional. com/products/ppe/guanti-mani/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m</a></td></tr><tr><td>Disponibile da più aziende.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti #0</td><td>Vetro lavorato a maglia</td><td>KN00010022593</td><td><a href="http://www.knittelglass.com/index_e.htm">http://www.knittelglass.com/index_e.htm</a></td></tr><tr><td>Molto fragile. Manipolare delicatamente.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta dritta affilata</td><td>SPI</td><td>0WSSS-XD</td><td>http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7</td></tr><tr><td>tubo da 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp</td></tr><tr><td>Disponibile da diverse aziende.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 kit</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN">http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN&nbsp; </a></td></tr><tr><td>La confezione contiene sia la base PDMS che l'agente indurente. Elastomeri simili sono disponibili da più aziende.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Dutscher</td><td>100001</td><td><a href="http://www.dutscher.com/frontoffice/search">http://www.dutscher.com/frontoffice/search</a></td></tr><tr><td>Disponibile da diverse aziende.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM mezzo ad alto contenuto di glucosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Siero di vitello bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8056-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; regione=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; regione=CA</a></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS è a 10x e dovrebbe essere diluito a 1x utilizzando ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21083-027</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Medium per atmosfere senza controllo</td><td></td><td></td><td></td>CO2</tr><tr><td>Fibronectina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termine=F1141-5MG& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& modalità=corrispondenza%20parzialemax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termine=F1141-5MG& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Penicillina & Streptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM</a></td></tr><tr><td>Piastra di Petri P35</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/</a></td></tr><tr><td>Piastra di Petri P60</td><td>Greiner</td><td>628163</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/</a></td></tr><tr><td>Piastra di Petri P94</td><td>Greiner</td><td>633179</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/</a></td></tr><tr><td>Paraformaldeide 3 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; regione=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; regione=FR&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Dannoso in particolare per gli occhi, è necessario lavorare in una cappa aspirante; controllare la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton 0,5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termine=93443-100ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& modalità=corrispondenza%20parzialemax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termine=93443-100ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488</td><td>InVitrogen</td><td>A12379</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=search-a12379">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=ricerca-a12379&nbsp; </a></td></tr><tr><td>sciogliere la polvere in 1,5 ml di metanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>InVitrogen</td><td>A21245</td><td>diluizione 1:200 in PBS 1x</td></tr><tr><td>coniglio policlonale anti-Giantin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>diluizione 1:500 in PBS 1x</td></tr><tr><td><a href="http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html">http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html&nbsp; </a></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>coniglio anti-anillina</td><td>Per gentile concessione di M. Glotzer, pubblicato in Piekny, A. J. & Glotzer, M. L'anillina è una proteina dell'impalcatura che collega RhoA, actina e miosina durante la citochinesi. Biologia attuale 18, 30&ndash; 6 (2008).</td><td></td><td>Diluizione 1:500 in PBS 1x</td></tr><tr><td>Laboratorio di trasduzione</td><td>anti-fosfotirosina</td><td>610000</td><td>http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000</td></tr><tr><td>Cy3 capra anti-coniglio&nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-166-047</td><td><a href="http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp">http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp&nbsp; </a></td></tr><tr><td>1:1.000 diluizione in PBS 1x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417&nbsp;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; regione=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; regione=FR&nbsp; </a></td></tr><tr><td>1 mg/ml per 1 min</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termine=G2025& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& modalità=corrispondenza%20parzialemax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termine=G2025& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termine=M8410-500ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& modalità=corrispondenza%20parzialemax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; termine=M8410-500ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Cellule HeLa</td><td>-</td><td>-</td><td>Le cellule di mammifero sono disponibili presso molte aziende. Vedi anche Tabella 1</td></tr><tr><td>NIH3T3 Le cellule</td><td>ATCC-Mammalian</td><td></td> <td>sono disponibili presso molte aziende. Vedi anche Tabella 1</td></tr><tr><td>Lievito di fissione&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Per dettagli sui ceppi, contattare l'autore corrispondente. Vedi anche Tabella 1</td></tr><tr><td>C. elegans worms</td><td>-</td><td>-</td><td>Per i dettagli, contattare l'autore corrispondente. Vedi anche Tabella 1</td></tr><tr><td>YES (Agar) + 5 Supplementi inclusi</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-732</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=Cerca">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=Cerca&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SÌ (Media) + 5 Integratori inclusi</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-522</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=Cerca">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=Cerca&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMM (Media)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=Cerca">http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=Cerca&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro sterilizzato EMM (Media) - Solo per imaging</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td>Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione. Filtro sterilizzare il terreno utilizzando un 0,22 &micro; filtro m invece della sterilizzazione in autoclave. Questo conferisce trasparenza al mezzo e riduce l'autofluorescenza.</td></tr><tr><td>Integratori (per EMM)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4104-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=Cerca">http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=Ricerca</a></td></tr><tr><td>&nbsp;( Aggiungere 225 mg/L nel terreno EMM prima della sterilizzazione in autoclave o del filtraggio)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtri sterili Stericup e Steritop Vaccum</td><td>Millipore</td><td>-</td><td><a href="http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2">http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2</a></td></tr></tbody></table>

ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3d confinamento: un nuovo dispositivo per l&#39;alta screening contenuti

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

cellule biologiche si osservano di solito su superfici piane (2D). Questa condizione non è fisiologico, e fenotipi e le forme sono molto variabili. Lo screening basato su cellule in tali ambienti sono quindi gravi limitazioni: organelli cellulari mostrano fenotipi estremi, morfologie di cellule e le dimensioni sono organelli cellulari eterogenee e / o specifiche non possono essere adeguatamente visualizzati. Inoltre, le cellule in vivo si trovano in un ambiente 3D; in questa situazione, le cellule mostrano diversi fenotipi principalmente a causa della loro interazione con la circostante matrice extracellulare del tessuto. Al fine di standardizzare e generare ordine delle singole cellule in un ambiente 3D fisiologicamente rilevanti per saggi cellulari, riportiamo qui la microfabbricazione e le applicazioni di un dispositivo per vitro coltura cellulare 3D. Questo dispositivo è costituito da una matrice 2D di microcavità (tipicamente 10 5 cavità / cm 2), ciascuna riempita di singole cellule o embrioni. cellulare posizione, la forma, la polarità e l&#39;organizzazione interna delle cellule diventano poi normalizzato che mostra un&#39;architettura 3D. Abbiamo usato stampaggio replica a modello una serie di microcavità, (PDMS) strato &#39;portauova&#39;, SU UN polidimetilsilossano sottile aderito su un vetrino. Cavità sono state coperte con fibronectina per facilitare l&#39;adesione. Le cellule sono state inserite mediante centrifugazione. percentuale di riempimento è stato ottimizzato per ciascun sistema consentendo fino al 80%. Le cellule ed embrioni viabilità è stata confermata. Abbiamo applicato questa metodologia per la visualizzazione di organelli cellulari, quali apparati nucleo e Golgi e studiare processi attivi, come la chiusura dell&#39;anello cytokinetic durante la mitosi cellulare. Questo dispositivo ha permesso l&#39;identificazione di nuove caratteristiche, come accumuli periodici e disomogeneità di miosina e actina durante la chiusura dell&#39;anello cytokinetic e fenotipi compattati per Golgi e l&#39;allineamento nucleo. Abbiamo caratterizzato il metodo per cellule di mammifero, lievito di fissione, lievito in erba, C. elegans wesimo adattamento specifico per ogni caso. Infine, le caratteristiche di questo dispositivo lo rendono particolarmente interessante per saggi di screening di farmaci e medicina personalizzata.

Le '' portauova (CE) sono un metodo di screening ad alto contenuto-romanzo che permette la visualizzazione di cellule orientate ed embrioni in un ambiente 3D. Inoltre, alcuni processi cellulari, che sono difficili da osservare nelle culture standard, 2D (flat), possono essere osservati da questo nuovo metodo. La figura 1a mostra una sintesi della procedura per la microfabbricazione CE (vedi anche la sezione 1 del protocollo sopra descritto ). Il metodo è semplice, veloce, efficiente e senza alcun requis...

Riportiamo un dispositivo ed un nuovo metodo per studiare le cellule ed embrioni. celle singole sono proprio ordinati in array microcavità. Il loro confinamento 3D è un passo verso ambienti 3D incontrate in condizioni fisiologiche e permette l&#39;orientamento organelli. Controllando la forma delle cellule, questa configurazione riduce al minimo la variabilità riportata nei test standard.

Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l&#39;alta Screening contenuti

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di osservare la morfologia e la dinamica degli organelli cellulari su una serie di microcavità che imitano l'ambiente 3D incontrato in condizioni fisiologiche. Per le cellule con pareti rigide, come il lievito di fissione, le cavità possono organizzare e orientare le strutture cellulari. Ciò si ottiene fabbricando prima una serie di pilastri PDMS da un master per ottenere una serie di microcavità PDMS, denominate portauova, mediante stampaggio di repliche.In una seconda fase, i portauova vengono funzionalizzati con proteine della matrice extracellulare e introdotti in una provetta con un pezzo di plastica cilindrico realizzato su misura, che supporta il campione di microcavità e consente l'introduzione di singole cellule di mammifero su ciascuna delle microcavità. Successivamente, i portauova riempiti con le cellule vengono rimossi e incubati con il farmaco o il composto di interesse al fine di studiare il fenotipo e i processi dinamici delle cellule in un confinamento 3D. Si ottengono risultati che mostrano differenze nel fenotipo cellulare e nuove strutture dinamiche osservate rispetto ai saggi 2D standard in vitro basati sul

ordering-single-cells-single-embryos-3d-confinement-new-device-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di singole cellule con una piattaforma microfluidica, che utilizza un nuovo concetto di progettazione di micropozzetti per consentire l'isolamento di singole cellule ad alta efficienza e la coltura clonale a lungo termine.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Presentiamo una procedura per controllare la forma di cluster iniziale delle cellule in una matrice extracellulare 3D per ottenere una formazione di reticolo ripetibile. Un dispositivo cubico contenente due diversi idrogeli è impiegato per realizzare multi-direzionale imaging per la formazione del reticolo di tessuto.

Controllo del Cluster iniziale delle cellule 3D in un ibrido Gel cubo dispositivo per reticolo ripetibile formazioni

Descriviamo un metodo per costruire dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari. Questo dispositivo consente l'analisi delle risposte cellulari ai segnali solubili in microambienti 3D con gradienti chemioattrattante definiti. Gli organoidi sono meglio di cellule singole al rilevamento di ingressi rumorosi deboli.

Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Questo protocollo spiega come preparare e montare campioni batterici per l'imaging tridimensionale dal vivo e come ricostruire la forma tridimensionale di E. coli da queste immagini.

Immagini tridimensionali di cellule batteriche per rappresentazioni cellulari accurate e localizzazione precisa delle proteine

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

L'intera struttura 3D e il contenuto cellulare degli organoidi, così come la loro somiglianza fenotipica con il tessuto originale possono essere catturati utilizzando il protocollo di imaging 3D a risoluzione singola descritto qui. Questo protocollo può essere applicato a una vasta gamma di organoidi che variano in origine, dimensione e forma.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Presentato qui è un protocollo per microiniettare e contemporaneamente immaginire più embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale utilizzando un imager a base di piastre e ad alto contenuto.

Preparazione e microiniezione dell'embrione Drosophila per microscopia a cellule vive eseguita utilizzando un analizzatore automatizzato ad alto contenuto

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per la produzione di tre diversi tipi di sferoidi in un modo che li rende adatti per lo screening e l'analisi ad alto contenuto su larga scala. Inoltre, vengono presentati esempi che mostrano come possono essere analizzati a livello sferoidale e di singole cellule.

Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

Impara a ordinare singole cellule in microcavità 3D per studiare la morfologia e la dinamica degli organelli cellulari. Questo metodo riduce la variabilità e migliora l'analisi in screening ad alto contenuto.

Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l'alta Screening contenuti

Esplora altri video