Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l'alta Screening contenuti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di osservare la morfologia e la dinamica degli organelli cellulari su una serie di microcavità che imitano l'ambiente 3D incontrato in condizioni fisiologiche. Per le cellule con pareti rigide, come il lievito di fissione, le cavità possono organizzare e orientare le strutture cellulari. Ciò si ottiene fabbricando prima una serie di pilastri PDMS da un master per ottenere una serie di microcavità PDMS, denominate portauova, mediante stampaggio di repliche.

In una seconda fase, i portauova vengono funzionalizzati con proteine della matrice extracellulare e introdotti in una provetta con un pezzo di plastica cilindrico realizzato su misura, che supporta il campione di microcavità e consente l'introduzione di singole cellule di mammifero su ciascuna delle microcavità. Successivamente, i portauova riempiti con le cellule vengono rimossi e incubati con il farmaco o il composto di interesse al fine di studiare il fenotipo e i processi dinamici delle cellule in un confinamento 3D. Si ottengono risultati che mostrano differenze nel fenotipo cellulare e nuove strutture dinamiche osservate rispetto ai saggi 2D standard in vitro basati sull'orientamento delle cellule.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi standard di coltura cellulare 2D, è che le cellule di mammifero nei covoni delle uova sperimentano un ambiente 3D simile ai microambienti logici, ma sono disposte in un grado ordinato e standardizzato. Anche l'ordine e l'orientamento sono miglioramenti significativi nel caso del lievito di fissione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello scheletro cellulare e della scoperta di farmaci, come l'identificazione di farmaci nuovi e antitumorali con screening ad alto contenuto.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di malattie multifattoriali come il cancro, perché i test di screening dei farmaci possono essere facilmente eseguiti e analizzati per mezzo di portauova, rendendo questo metodo particolarmente interessante per la medicina personalizzata. Questo metodo può fornire la chiave interna per le strutture e le dinamiche organizzate nelle singole cellule di mammifero e nelle cellule di lievito di fissione, e può anche essere applicato allo studio organizzato, allo sviluppo di embrioni come C.elegans e ri-so-flu-a. In questo protocollo, una serie di microcavità o portauova viene modellata su uno strato di polidimetilsilossano o PDMS fatto aderire su un vetrino coprioggetti mediante stampaggio replica.

Il primo passo è la fabbricazione del master, che non verrà mostrato, ma è descritto nel protocollo di testo. Una volta creato il master, il passo successivo è quello di fabbricare la replica PDMS. In un tubo da 50 millilitri, mescolare accuratamente il reticolante e il prepolimero in un rapporto peso/peso o volume/volume da uno a 10 per un totale di 30 grammi.

Centrifugare la provetta a 1, 800 volte g per cinque minuti per rimuovere le bolle d'aria. Far cadere delicatamente il PDMS sopra il master. Se compaiono delle bolle, degassare la miscela.

Mettere il campione in forno a 65 gradi Celsius per quattro ore. Dopo che il PDMS è indurito, utilizzare un bisturi per tagliare delicatamente l'area di interesse di circa un centimetro quadrato, che comprende circa 10-5 microcavità, o portauova. Staccare delicatamente il timbro PDMS.

Per iniziare la procedura per lo stampaggio della replica, attivare il timbro PDMS mediante trattamento al plasma di ossigeno per 30 secondi. Conservare temporaneamente il timbro attivato in una capsula di Petri chiusa per evitare il deposito di polvere. Lavorando in una cappa aspirante, posizionare il timbro PDMS attivato con il lato rivolto verso l'alto o capovolto in una capsula di Petri accanto a un tappo da 15 millilitri.

Riempire il tappo con 200 microlitri di trimetilclorosilano. Chiudere la capsula di Petri e lasciare salinizzare lo stampo per sette minuti. Posizionare il timbro PDMS sulla centrifuga con le strutture capovolte.

Mettere una piccola goccia di PDMS liquido sopra le strutture. Centrifugare lo strato a 1500 giri/min per 30 secondi per depositare un sottile strato di PDMS sulla parte superiore delle strutture. Posizionare il timbro in forno a 65 gradi Celsius per quattro ore per polimerizzare lo strato PDMS centrifugato depositato.

Quindi, attivare il sottile strato PDMS posizionando il timbro PDMS capovolto insieme a un vetrino coprioggetto in un pulitore al plasma di ossigeno per 30 secondi. Posizionare immediatamente il timbro a contatto con il vetrino coprioggetto e premere delicatamente su tutta la superficie del timbro con una pinzetta per l'incollaggio. Dopodiché, mantieni una pressione costante sulla parte superiore del timbro per circa 10 secondi.

30 minuti dopo, staccare delicatamente il timbro dal vetrino coprioggetti per liberare i portauova. Fare molta attenzione a non rompere il campione. Sciacquare accuratamente i portauova con etanolo e asciugarli.

Se i portauova PDMS non si trovano sul vetrino di copertura e si staccano durante la fase di sgancio, prendere in considerazione la possibilità di regolare le impostazioni del pulitore al plasma e riavviare la procedura per lo stampaggio della replica. Per facilitare la successiva manipolazione del campione, si consiglia di incollare un piccolo pezzo di PDMS polimerizzato sul bordo del vetrino coprioggetto. Nel caso delle cellule di mammifero presentate in questo video, la superficie del PDMS deve essere funzionalizzata con proteine di adesione della matrice extracellulare.

Idrofilizzare i portauova nel pulitore al plasma di ossigeno per 30 secondi. Dopodiché, sterilizzare i portauova con luce ultravioletta per cinque minuti. Depositare una piccola goccia di soluzione di fibronectina per coprire l'intera area del portauovo e incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Proteggere il campione dall'essiccazione. Sciacquare delicatamente i portauova con circa un millilitro di PBS, utilizzando una pipetta erogatrice in plastica. Ripeti per un totale di tre volte.

Quindi, posiziona un pezzo di plastica cilindrico su misura in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere 13 millilitri di terreno di coltura cellulare alla provetta. Il mezzo deve raggiungere almeno due centimetri sopra il pezzo cilindrico per garantire la completa immersione del campione.

Utilizzando una pinzetta affilata e diritta per tenere il campione per l'impugnatura del PDMS, posizionare con cura i portauova all'interno della provetta, premendo delicatamente il vetrino coprioggetti fino a quando non si trova sopra il lato superiore del pezzo di plastica ed è completamente immerso. Le cellule da introdurre nei portauova devono essere coltivate con una confluenza compresa tra l'80 e il 100% e risospese in cinque millilitri di terreno di coltura. Pipettare 200 microlitri di cellule sopra i portauova, lasciando cadere le cellule il più centrate possibile sopra i portauova, ma evitando il contatto fisico.

In questo modo si eviteranno rotture e/o danni al campione. Centrifugare la provetta da 50 millilitri a 1.800 volte g per due minuti. Pipettare altri 200 microlitri di cellule sopra i portauova e centrifugare nuovamente a 1.800 volte g per due minuti.

Ripetere per un totale di tre volte in modo da ottimizzare la percentuale di riempimento. Dopo l'ultima centrifugazione, controllare la percentuale di riempimento dei portauova con un microscopio. Utilizzando le pinzette per tenere l'impugnatura del PDMS, rimuovere con cautela il campione dalla provetta senza disturbare le cellule nei portauova e posizionare il campione in una capsula di Petri con un terreno.

Per rimuovere le cellule in eccesso che non si trovano nei portauova, risciacquare pipettando delicatamente su e giù tre volte accanto a ciascun lato dell'array di microstrutture. Infine, sostituisci il terreno con un terreno nuovo per rimuovere le cellule non attaccate. Per osservare gli organelli cellulari fissi, posizionare i portauova con un campione fisso sul tavolino di un microscopio invertito a epifluorescenza e selezionare l'obiettivo ad olio 60x.

In questo esempio, il campione è costituito da fibroblasti NIH 3T3, dove sono stati colorati l'apparato di Golgi, il nucleo e le fibre di actina. Metti a fuoco con attenzione usando la luce del campo luminoso fino a quando i portauova e le cellule non si trovano nel piano di osservazione. Seleziona e metti a fuoco la regione di interesse e avvia l'acquisizione dell'immagine.

Iniziare questa procedura inserendo i portauova in un supporto per microscopio e riempiendolo con un millilitro di terreno di coltura cellulare FCS L15 al 10%. Installare il supporto sul tavolino del microscopio. Per evitare l'evaporazione, posizionare un coperchio di vetro sopra il supporto.

Osservare le cellule con un microscopio invertito a epifluorescenza dotato di un obiettivo ad olio 60x. Questo esempio utilizza cellule HeLa che esprimono miosina e actina marcate in modo fluorescente, due molecole chiave coinvolte nella chiusura dell'anello citocinetico durante la mitosi. Seleziona la regione di interesse e cerca un anello citocinetico, utilizzando il canale GFP o Texas Red.

Metti a fuoco con precisione. Eseguire l'acquisizione automatica in entrambi i canali fino alla completa chiusura dell'anello. Le immagini al microscopio elettronico a scansione dei portauova mostrano che la loro forma e dimensione sono molto regolari.

Per le cellule con pareti rigide come il lievito di fissione, i portauova possono orientare l'anello citocinetico. Per le cellule di mammifero, un confronto tra le cellule dei portauova 3D e le superfici piane 2D rivela che le prime formano una matrice ordinata con il fenotipo omogeneo di tipo sferico, mentre le seconde mostrano una morfologia disordinata ed eterogenea. Le cellule sui portauova mostrano anche una riduzione del numero di fibre da stress, come indicato dal numero di modesti effetti del trattamento con Blebbistatin.

L'apparato di Golgi nelle colture 2D mostra tipicamente un fenotipo esteso, mentre nelle coppe mostra un fenotipo più compatto. Ciò è stato confermato da una quantificazione dei fenotipi del Golgi. Infine, su superfici 2D, il nucleo cellulare è orientato in modo casuale, mentre sui portauova è orientato ortogonalmente sul piano xy, sia nelle cellule wild type che in quelle trattate con Blebbistatina.

Una determinazione dei valori di sfericità del nucleo rivela che i portauova non influenzano la normale sfericità del nucleo cellulare. Tuttavia, la differenza tra le cellule wild type e quelle trattate con blebbistatina sui portauova suggerisce che i portauova stanno rivelando un effetto reale del farmaco che è mascherato in 2D. Gli studi su cellule vive con portauova consentono l'identificazione di nuovi processi attivi, che non sono visibili nelle colture standard.

Ad esempio, nelle cellule HeLa sono stati osservati accumuli periodici di miosina che si muovono radialmente mentre l'anello citocinetico si chiude durante la mitosi. Una volta padroneggiati, i portauova possono essere preparati da una replica in meno di sei ore e il riempimento delle celle può essere effettuato in circa 15 minuti. Durante il tentativo di questo processo, è importante avere le dimensioni dei portauova per le cellule oggetto di studio.

Questa procedura può essere ulteriormente adattata alle piattaforme di screening ad alto contenuto nelle aziende farmaceutiche per attività di screening di massa e anche in saggi diagnostici personalizzati dei pazienti nella valutazione di singoli trattamenti specifici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare e utilizzare le microcavità dei portauova. I portauova standardizzano e generano ordine in una varietà di sistemi simili, che vanno da singole cellule senza pareti, come le cellule dei mammiferi, a sistemi con pareti, come lievito ed embrione.