Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo
September 3rd, 2014
Questo articolo descrive l'arricchimento di proteine associate con la membrana plasmatica sinaptica da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio discontinuo. La successiva preparazione di proteine di densità post-sinaptica è anche descritto. Preparati proteici sono adatti per western blotting o l'analisi 2D DIGE.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare il frazionamento subcellulare del tessuto cerebrale utilizzando un gradiente discontinuo di saccarosio per arricchire le proteine dalle membrane sinaptiche e dalle densità postsinaptiche. Ciò si ottiene omogeneizzando prima il tessuto cerebrale con un omogeneizzatore potenziatore. Successivamente ci sono una serie di fasi di centrifugazione per preparare estratti di proteine grezze di membrana.
Gli estratti di membrana vengono poi stratificati su un gradiente discontinuo di saccarosio per l'ultracentrifugazione. Il passaggio finale consiste nel raccogliere le proteine dal gradiente. In definitiva, i risultati possono mostrare cambiamenti nei livelli di proteina sinaptica attraverso l'analisi Western blot.
Questa è una tecnica ben consolidata che è stata utilizzata dai neuroscienziati per oltre 40 anni. Lo usiamo nel nostro laboratorio per capire come cambia la composizione proteica della sinapsi quando perturbiamo diversi sistemi di neurotrasmettitori. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come i gradienti per chiamata o i gradienti continui di saccarosio, è che i gradienti discontinui di saccarosio sono più facili da costruire a mano.
Questo protocollo si avvale di un omogeneizzatore in teflon in vetro motorizzato, sostituire sempre il pestello tra i campioni e risciacquare e asciugare. L'omogeneizzatore prima carica il tessuto sezionato in una provetta da 13 millilitri con quattro millilitri di soluzione di saccarosio tamponata HEPA molare da 0,32 molari. Quindi trasferire il fazzoletto in un omogeneizzatore di vetro pulito.
Impostare il motore a 900 giri/min e omogeneizzare il campione con 12 colpi in 30 secondi, utilizzando meno di quattro grammi di tessuto, garantisce un buon frazionamento, trasferire il campione nella provetta e conservare un'aliquota da 100 microlitri a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per l'analisi delle proteine. Quindi, separare il materiale nucleare facendo girare l'omogenato a 900 G per 10 minuti. A quattro gradi Celsius, trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 15 millilitri.
Il surnatante contiene la frazione grezza della membrana. Ora per arricchire per la centrifuga di sinaptosoma grezzo, il surnatante a 10.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante. Il pellet contiene la frazione grezza del sinaptosoma Resus.
Sospenderlo in un millilitro di soluzione di saccarosio 0,32 molare. Quindi, ad altri tre millilitri di soluzione nella sospensione, centrifugare la frazione grezza per 15 minuti. A 10.000 g a quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante. Ora pidocchiate velocemente il pellet, rimettete il pellet in un millilitro di acqua pura.
Quindi aggiungere rapidamente altri tre millilitri di acqua. Trasferisci questo nell'omogeneizzatore. Applicare tre passate a mano e trasferirle nuovamente nel tubo da 13 millilitri.
Regolare rapidamente il campione a quattro HEA millimolari con l'aggiunta di 16 microlitri di HEA a un molare e mescolarlo per inversione. Ora metti il campione su un rotatore a quattro gradi Celsius per mezz'ora. Per garantire la lisi del campione, terminare il frazionamento pellettando la frazione di due primi Lysed P.
Centrifugare a 25.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in un millilitro di soluzione di saccarosio. Questo contiene le membrane episomiali della sinape arricchite. Innanzitutto, pre-misura i tamponi per creare un gradiente discontinuo di saccarosio.
Caricare tre provette come segue, una con esattamente 3,5 millilitri di soluzione di saccarosio tamponato a 1,2 cumuli molari. Un altro con esattamente tre millilitri di soluzione molare 1,0 e il terzo con tre millilitri di soluzione molare 0,8. Successivamente, con una pipetta di vetro, trasferire la soluzione di saccarosio da 1,2 molari in una provetta per ultracentrifuga polimerica da 12 millilitri.
Con una nuova pipetta, sovrapporre con cura la soluzione molare 1,0 sulla soluzione molare 1,2. Non disturbare la soluzione 1,2 molare e non introdurre bolle con la pipetta. Usa la stessa tecnica per sovrapporre la soluzione molare da 0,8
.Fai attenzione. Piccole vibrazioni provenienti da un vortice da banco o da una microcentrifuga sono sufficienti per disturbare l'integrità del gradiente. È importante costruire le pendenze in modo accurato ed efficiente.
Se ci vuole troppo tempo o se il gradiente è esposto a vibrazioni, non sarai in grado di recuperare le membrane sinaptiche nei passaggi successivi. Ora con un'altra pipetta da pastore sovrapporre la frazione di membrana episomiale della sinape arricchita sopra il gradiente preparato. Bilancia con precisione il gradiente in un'ultracentrifuga in un rotore a secchiello oscillante.
Quindi centrifugare a 150.000 g per due ore a quattro gradi Celsius. Fare molta attenzione quando si rimuove il gradiente dal secchio dopo la centrifugazione, dovrebbero esserci strisce chiare di soluzione di saccarosio. Con frazioni proteiche in ogni interfaccia e un pellet, le frazioni non dovrebbero essere diffuse.
Utilizzando un ago calibro 18 e una siringa da un millilitro, perforare la parte più bassa dell'interfaccia molare a 1,2 molari e prelevare la banda bianca di proteina, che contiene le membrane plasmatiche sinaptiche. Registra il volume di questo livello. Trasferire lo strato in una provetta per ultracentrifuga con pareti spesse 3,5 millilitri.
Aggiungi esattamente 2,5 volumi di HEA da quattro millimolari. Quindi preparare una provetta bilanciatrice con soluzione di saccarosio tamponata HEA 0,32 molari in un rotore ad angolo fisso, ultracentrifugare il campione a 200.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi scartare la Senna e risospendere il pellet della membrana plasmatica sinaptica.
In 300 microlitri di HEA da 50 millimolari due soluzione di EDTA millimolare. La frazione di densità post-sinaptica o frazione PSD può ora essere raccolta con un ulteriore uso delle stesse tecniche. I passaggi sono chiaramente delineati nel protocollo di testo.
Un western blot è stato eseguito con una proteina totale, la membrana plasmatica sinaptica e le prime frazioni proteiche di densità post-sinaptica. La frazione PSD ha subito un solo trattamento detergente e il tessuto proveniva dallo striato di topo. Le proteine presinaptiche come il trasportatore della dopamina sono arricchite nella frazione SPM, ma vengono eliminate nella successiva fase detergente per l'arricchimento della PSD.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere tutti i campioni sul ghiaccio e di includere inibitori della proteasi e della fosfatasi Seguendo questa procedura. Possono essere eseguiti altri metodi come l'analisi del sangue occidentale o l'elettroforesi su gel bidimensionale. Quindi puoi rispondere a domande come il modo in cui il trattamento farmacologico influisce sui livelli dei recettori nella sinapsi.
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Panoramica
Questo articolo descrive il processo di arricchimento delle proteine associate alla membrana plasmatica sinaptica mediante ultracentrifugazione su un gradiente discontino di saccarosio. La procedura dimostra il frazionamento subcellulare del tessuto cerebrale per arricchire le proteine delle membrane sinaptiche e le densità postsinaptiche.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Analisi delle proteine
Sfondo
- Comprendere i livelli delle proteine sinaptiche è cruciale per la ricerca in neuroscienza.
- Le membrane sinaptiche e le densità postsinaptiche svolgono ruoli chiave nella comunicazione neuronale.
- L'ultracentrifugazione è una tecnica standard per l'arricchimento delle proteine.
- Il Western blotting e il 2D DIGE sono metodi comuni per l'analisi delle proteine.
Obiettivo dello studio
- Arricchire le proteine dalle membrane sinaptiche e dalle densità postsinaptiche.
- Preparare estratti proteici adatti per ulteriori analisi.
- Dimostrare l'efficacia di un gradiente discontino di saccarosio nell'arricchimento delle proteine.
Metodi utilizzati
- Omogenizzazione del tessuto cerebrale utilizzando un omogeneizzatore motorizzato.
- Serie di passaggi di centrifugazione per preparare estratti proteici di membrana grezza.
- Stratificazione degli estratti di membrana su un gradiente discontino di saccarosio.
- Ultracentrifugazione per raccogliere le proteine dal gradiente.
Risultati principali
- Arricchimento riuscito delle proteine della membrana plasmatica sinaptica.
- Preparazione delle proteine della densità postsinaptica per l'analisi.
- I risultati possono indicare cambiamenti nei livelli delle proteine sinaptiche.
- Adatto per l'analisi Western blot e 2D DIGE.
Conclusioni
- Il metodo arricchisce efficacemente le proteine dalle membrane sinaptiche.
- Fornisce una base per studiare la dinamica delle proteine sinaptiche.
- Può essere applicato a varie questioni di ricerca in neuroscienza.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Synaptic protein quantification enables mechanistic de-risking in CNS target validation by linking molecular changes to functional phenotypes. This subcellular fractionation method supports predictive confidence in early discovery by isolating disease-relevant synaptic compartments. It provides a disease-relevant system for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of synaptic plasma membrane and postsynaptic density protein trafficking.
- Operational Value: Provides a standardized approach to isolate synaptic compartments for target de-risking.
- Predictive Value: Supports biomarker alignment by measuring changes in presynaptic and postsynaptic protein levels following pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated synaptic protein fractions for use in phenotypic screening assays to evaluate compound effects on synaptic integrity.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative protein outputs suitable for assay standardization and high-content analysis.
- Scalability: The discontinuous sucrose gradient method allows batch processing of samples for consistent screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system modeling by isolating synaptic proteins from specific brain regions, such as striatum, to study neuropsychiatric targets.
- Operational Value: Supports translational biomarker development by providing quantifiable synaptic protein readouts correlated with functional outcomes.
- Risk Mitigation: Facilitates preclinical continuity by linking target modulation to measurable changes in synaptic protein composition.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative synaptic protein data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating synaptic compartments affected by neurotransmitter system perturbations.
- Screening: Enables assay readiness through production of enriched synaptic plasma membrane and PSD fractions suitable for Western blot or 2D DIGE analysis.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (protein band intensity) that allow comparison of synaptic protein levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling assessment of synaptic protein changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for synaptic protein isolation across multiple CNS projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct measurement of synaptic protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via a well-established discontinuous sucrose gradient protocol with defined centrifugation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative synaptic protein data that de-risks CNS target progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on measurable effects on synaptic protein composition and synaptic function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in subcellular fractionation, ultracentrifugation, and synaptic biology to ensure proper gradient formation and fraction collection.
- Dependent on access to ultracentrifuge with swinging bucket and fixed angle rotors, and capability to maintain samples at 4°C throughout processing.
- Necessitates cross-team standardization of gradient preparation, tissue homogenization, and protease/phosphatase inhibitor use to ensure reproducibility across sites.
- Requires adaptation considerations when applying to different brain regions or disease models due to variations in synaptic protein expression and tissue yield.
- Practical limitations include the need for fresh or properly stored tissue and careful handling to prevent gradient disruption from vibration or delays during setup.
