In tempo reale Imaging del trasporto assonale di Quantum Dot-etichettato BDNF in neuroni primari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di tracciare il trasporto assonale retrogrado del fattore neurotrofico derivato dal cervello o BDNF mediante imaging dal vivo. Ciò si ottiene assemblando prima le camere microfluidiche su vetrini di copertura rivestiti in polilisina. Nella seconda fase, i neuroni ippocampali dissociati E 18 del ratto vengono sezionati e piastrati nel compartimento del corpo cellulare della camera microfluidica.

Successivamente, i neuroni vengono coltivati per consentire l'estensione degli assoni attraverso i micro solchi nel compartimento assonale della camera. Nella fase finale, il BDNF marcato con punto quantico viene aggiunto al compartimento dell'assone. In definitiva, la microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per valutare il movimento del BDNF all'interno degli assoni del neurone ippocampale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come B-D-F-E-G-I-P, o l'etichettatura delle ciliegie BDFM è che l'etichettatura BDF con punto quantico consente l'imaging della luce di un singolo dimero BDF all'interno degli assoni, dimostrando che la procedura sarà, sarà. Disegna un punto di post dai miei tre sinistri, inizia lavando a mano le camere microfluidiche all'1% di aox, seguito da tre risciacqui di 30 minuti in acqua milli Q. Quindi, dopo aver lavato a mano le camere in etanolo al 70%, stenderle ad asciugare su param in una cappa a flusso laminare, sterilizzare entrambi i lati delle camere sotto luce UV per 20 minuti, quindi conservare le camere irradiate in un piatto sterile di 15 centimetri sigillato con param a temperatura ambiente.

Quindi, immergere 24 x 40 millimetri. Il coperchio in vetro numero uno scivola in acido cloridrico al 10% durante la notte su un rotatore, seguito da tre lavaggi di 30 minuti con acqua dopo l'ultimo lavaggio. Sterilizzare ogni vetrino coprioggetti immergendolo in etanolo al 100%, quindi cuocendolo a fiamma su un bruciatore bunsen e conservandoli asciutti in una capsula di Petri sterile a temperatura ambiente.

Per rivestire i vetrini, adagiarli in una piastra di coltura da 15 centimetri e poi sovrapporre ciascuno con 0,7 millilitri di poli-L lisina allo 0,01%. Dopo un'incubazione di un'ora nella cappa di coltura tissutale, sciacquare nuovamente i vetrini di copertura tre volte con acqua sterile, quindi asciugarli con un vuoto e metterli in una capsula di coltura di sei centimetri. Quindi posizionare una delle camere sterilizzate con il lato della microscanalatura rivolto verso il basso su un vetrino coprioggetti rivestito di poli-L lisina.

Facendo attenzione a non toccare le micro scanalature e utilizzare una punta per micropipette per premere delicatamente sulla camera e sigillare ermeticamente la camera microfluidica assemblata. Ora ho inserito due Hippo Campi di ratto da E 17 a E 18 in un tubo conico da 15 millilitri contenente due millilitri di tampone di dissezione e risciacquato i tessuti tre volte con cinque millilitri di tampone di dissezione ogni volta. Quindi rimuovere la maggior parte possibile del lavaggio e aggiungere 900 microlitri di tampone di dissezione fresco per digerire il tessuto.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tripsina al 2,5% ai tessuti e posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti di digestione, aggiungere 100 microlitri di DNA e utilizzare una pipetta di vetro PE lucidata a fuoco per tritappare delicatamente i tessuti su e giù da cinque a 10 volte subito dopo la miscelazione. Spegnere la tryin con due millilitri di terreno di coltura e lasciare che i detriti si depositino sul fondo della provetta per cinque minuti nella cappa di coltura tissutale.

Quindi, trasferire con cura due millilitri di surnatante in una provetta conica sterile da 15 millilitri pulita e centrifugare le cellule di risutura. Sospendere il pellet in 50 microlitri di mezzo di placcatura e, dopo il conteggio, caricare da 15 a 20 microlitri di sospensione cellulare in uno scomparto della camera microfluidica. Incubare la camera per 10 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al vetrino coprioggetto, quindi aggiungere altro mezzo di placcatura per riempire entrambi gli scomparti della camera.

Dopo un giorno di incubazione, sostituire il terreno di placcatura con un terreno di mantenimento sia nel corpo cellulare che nei compartimenti assonali. Il terzo giorno, gli assoni dei neuroni dell'ippocampo iniziano ad attraversare i micro solchi raggiungendo il compartimento degli assoni tra il quinto e il settimo giorno. Durante questo periodo, sostituire metà del terreno di coltura con nuovi terreni di manutenzione ogni 24-48 ore prima dell'imaging dal vivo del trasporto assonale BDNF marcato quantisticamente.

Sciacquare accuratamente entrambi i compartimenti della camera microfluidica con terreno neurobasale libero da siero libero da BDNF ogni 30 minuti per due ore durante la deplezione del BDNF, incubare 50 dimeri BDNF mono biotinilati nano molari con 50 quanti nanomolari. Eseguire 6, 5, 5 coniugati strippin in mezzi neurobasali su ghiaccio per 60 minuti. Quindi sostituire il terreno nel compartimento dell'assone con 300 microlitri di BDNF marcato con punti quantici per quattro ore a 37 gradi Celsius per ridurre al minimo la diffusione del BDNF marcato con punti quantici nel compartimento del corpo cellulare.

È molto importante mantenere sempre un livello più elevato di terreno nel compartimento del corpo cellulare rispetto al compartimento degli assoni alla fine dell'incubazione, del riscaldamento e del microscopio invertito, dotato di un obiettivo ad olio 100x e di una camera ambientale a una temperatura costante di 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante il riscaldamento dell'apparecchiatura. Lavare via il punto quantico non legato etichettato BDNF dalla camera microfluidica, quindi utilizzare una serie di cubi di eccitazione ed emissione rossi del Texas per visualizzare il segnale del punto quantico 6 5 5. Infine, utilizza una fotocamera CCD per acquisire immagini time-lapse all'interno degli assoni medi alla velocità di un fotogramma al secondo per un totale di due minuti.

Utilizzare micro solchi senza assoni che non hanno QD come controllo per l'infiltrazione e analizzare il trasporto BDNF utilizzando il software di analisi delle immagini appropriato nell'imaging time-lapse del trasporto del segnale BDNF marcato con punti quantici I segnali dei punti quantici sono osservati nella maggior parte dei micro solchi con assoni, mentre nessun segnale quantistico è visto nei micro solchi senza assoni indicando una diffusione minima o nulla del segnale del punto quantico dal compartimento degli assoni al compartimento del corpo cellulare qui. Un segmento lungo 80 micrometri di un assone di un neurone ippocampale è stato registrato in fluorescenza per 100 secondi. Un totale di sei.

I segnali quantistici di BDNF sono stati chiaramente notati durante l'imaging e tre sono stati osservati muoversi unidirezionalmente verso il corpo cellulare. È stato osservato che un segnale si muove dolcemente verso il corpo cellulare attraversando l'intero campo in circa 70 secondi. Un altro è stato osservato muoversi in direzione retrograda per i primi 20 secondi, passare al movimento antrogrado per 10-20 secondi e poi cambiare nuovamente direzione verso il corpo cellulare per gli ultimi 20 secondi.

Anche il terzo evento è stato notato muoversi in direzione retrograda, ma poi fermarsi per circa 20 secondi durante la metà del movimento. In questo primo grafico a campana rappresentativo del trasporto BDNF marcato con punti quantici, il BDNF marcato con punto quantico si è mosso rapidamente e senza intoppi verso il corpo cellulare attraversando il campo di 80 micrometri in circa 60 secondi. Con pause molto brevi in questo secondo cronografo, il BDNF quantistico ha percorso circa 50 micrometri in 120 secondi in direzione retrograda con almeno tre segmenti di pause più lunghe.

Infine, i grafici a dispersione misurano la velocità di movimento, la velocità media e il tempo di pausa di ogni singolo punto quantico etichettato BDNF. Le velocità di movimento del punto quantico etichettato BDNF erano relativamente elevate, comprese tra 0,47 e 1,97 micrometri al secondo, con una media di 1,06 più o meno 0,05 micrometri al secondo. A causa della pausa del BDNF durante il trasporto, la velocità media era molto più bassa della velocità di movimento con una media di 0,48 più o meno 0,03 micrometri al secondo con una durata media delle pause di 15,88 più o meno 1,30 secondi dopo lo sviluppo.

Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo delle neuroscienze di esplorare il traffico di neurotrofine e recettori in neuroni sani e malati.