gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l'analisi della sequenza intera BRCA1, BRCA2, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage

Lo scopo del seguente esperimento è quello di analizzare la sequenza di 11 geni contemporaneamente con un protocollo molto semplice e relativamente veloce basato sulla tecnologia basata sulla trasposasi. Ciò si ottiene mediante l'azione di una trasposasi per ottenere 300 frammenti di DNA di coppie di basi direttamente legati con adattatori. La prima cattura con sonde specifiche, arricchisce i campioni nelle regioni di interesse.

Questo passaggio viene ripetuto ancora una volta per ottenere solo le sequenze target. Successivamente, viene eseguita l'amplificazione PCR al fine di aumentare la quantità di materiali per sequenziare i risultati ottenuti che mostrano variazioni genetiche nei geni in base all'allineamento delle sequenze e all'analisi bioinformatica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il sequenziamento Sanger, è la sua grande capacità che ci permette di analizzare 24 passioni per 11 geni completi in meno di due settimane.

A dimostrare la procedura sarà Sandy, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, prepara tutti i reagenti dal kit di arricchimento del DNA. Quando è pronto, aggiungere circa 50 nanogrammi di DNA genomico in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, iniziando la preparazione aggiungendo 25 microlitri di tampone TD e poi cinque microlitri di tampone TDE.

Per ogni pozzetto impostare una pipetta a 50 microlitri e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10 volte. Centrifugare brevemente, quindi posizionare la piastra in un termociclatore quando è pronta. Agitare la soluzione ST e aggiungere 15 microlitri a ciascun pozzetto contenente il campione.

Impostare la pipetta a 65 microlitri e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10 volte, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente prima della centrifusione. Successivamente, aggiungere 52 microlitri di microsfere magnetiche di purificazione precedentemente miscelate a ciascuna miscela di pozzetti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente prima di centrifugare. Dopo aver lavato le perle con etanolo, rimuovere la piastra dal supporto magnetico e aggiungere 22,5 microlitri di tampone RSB.

Dopo la miscelazione, posizionare la piastra sul supporto magnetico e incubare per due minuti. Assicurarsi che il surnatante appaia completamente limpido. Trasferire delicatamente 20 microlitri di rullante in una nuova piastra da 96 pozzetti.

Per iniziare il primo ciclo di amplificazione PCR, aggiungere 20 microlitri di LP PMM e cinque microlitri ciascuno di indice uno e indice due a ciascuno. Mescolare bene e coprire la piastra con una pellicola adesiva Micros EAL. Dopo la centrifugazione, posizionare la piastra nel termociclatore ed eseguire il primo programma.

Dopo aver purificato e determinato la resa del primo ciclo di PCR, iniziare la prima ibridazione prelevando fino a 12 campioni. Nella nuova piastra a 96 pozzetti, assicurando che il volume finale di ogni piscina non superi accuratamente i 40 microlitri, mescolare accuratamente la soluzione NCT one e aggiungere 50 microlitri a ciascun pozzetto. Dopo aver aggiunto 10 microlitri di CSO, mescolare e sigillare la piastra.

Dopo la centrifugazione, posizionare la piastra in un termociclatore ed eseguire il programma. Due. Per il primo lavaggio di ibridazione, rimuovere la piastra dal termociclatore e centrifugare. Rimuovere brevemente il coperchio adesivo con molta attenzione.

Trasferire 100 microlitri di miscela di reazione dalla piastra a una nuova piastra MIDI a 96 pozzetti e aggiungere 250 microlitri di soluzione Vortex SMB a pozzetti. Mescolare e sigillare la piastra prima di incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo aver lavato e scartato la supena, aggiungere 200 microlitri di soluzione WS two ben miscelata in pozzetti contenenti perle e mescolare accuratamente trasferendo l'intero volume in una nuova piastra da 96 pozzetti.

Sigillare la piastra e metterla in un termociclatore. Avviare il termociclatore a 42 gradi Celsius per 30 minuti. Una volta completata, posizionare immediatamente la piastra sul supporto magnetico per due minuti.

Assicurarsi che il surnatante appaia completamente limpido. Rimuovere il sigillo ed eliminare immediatamente tutto il surnatante. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico.

Aggiungere 200 microlitri di soluzione Ws three ben miscelata in pozzetti contenenti perle e mescolare accuratamente. Dopo aver lavato e rimosso il supinato, sigillare la piastra e centrifugare brevemente per estrarre il natante supino residuo. Posizionare la piastra sul supporto magnetico per due minuti.

Scartare il supinato residuo. Quindi, rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Aggiungere 23 microlitri di miscela precedentemente preparata.

Dopo aver mescolato, sigillare la piastra e lasciare agire per cinque minuti a temperatura ambiente prima di centrifugare. Dopo aver trasferito 21 microlitri di sate in una nuova piastra a 96 pozzetti, aggiungere quattro microlitri di soluzione ET two a ciascuna. Mescolare bene e sigillare la piastra prima della centrifusione.

Per iniziare la seconda ibridazione, rimuovere la pellicola adesiva e aggiungere 50 microlitri di NCT, 10 microlitri di CSO e 15 microlitri di acqua PCR Grade ai 25 microlitri di libreria. Dopo la centrifugazione, posizionare la piastra in un termociclatore ed eseguire il programma. Due. In una nuova piastra da 96 pozzetti miscelati 20 microlitri di evoluzione dal passaggio precedente.

Con 25 microlitri di T-C-P-M-M e cinque microlitri di PPC, sigillare la piastra dopo la miscelazione e la centrifugazione. Quindi, posizionare la piastra in un termociclatore ed eseguire il programma tre il giorno successivo, centrifugare la piastra e lavare le perle con etanolo. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e aggiungere 30 microlitri di tampone RSB.

Mescolare e incubare la piastra per due minuti. A temperatura ambiente, posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto magnetico e incubare per cinque minuti o fino a quando il surnatante S non appare completamente limpido. Trasferire delicatamente 28 microlitri di rullante in una nuova piastra da 96 pozzetti.

Il passaggio finale consiste nel determinare la qualità della libreria utilizzando un analizzatore di frammenti o QPCR. Durante la corsa, la densità del cluster dovrebbe essere compresa tra 801.000 K per millimetro quadrato. Immagini diverse corrispondono a bassa densità, alta densità e densità perfetta.

I risultati ottenuti con questa tecnologia sono molto facili da interpretare come mutazioni puntiformi o indel utilizzando la bioinformatica. Viene indicata la modifica della base e viene identificata direttamente la sequenza eliminata o inserita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di tre giorni se eseguita correttamente.