Name: gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per lanalisi della sequenza intera BRCA1, BRCA2, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri l'arricchimento del gDNA con tecnologia a trasposasi-NGS per analizzare 11 geni di riparazione del DNA, inclusi BRCA1 e BRCA2. Questo metodo rapido consente il sequenziamento simultaneo in meno di due settimane.

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Ringraziamo la Ligue contre le Cancer de Côte d'Or e il Centre Georges-François Leclerc per il loro sostegno finanziario. Ringraziamo Philip Bastable per l'editing del manoscritto.

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<li>Risch, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+BRCA1+and+BRCA2+mutation+frequencies+and+cancer+penetrances%3A+a+kin-cohort+study+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).</li>
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<li>Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA+and+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.O.P%22%5BJournal%5D)">BRCA and pancreatic cancer.</a> J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

L&#39;uso diffuso di dispositivi e tecnologie NGS ha fornito nuove opportunità nello studio dei tumori e malattie genetiche. Oltre al sequenziamento dell&#39;intero genoma o RNA sequenziamento, l&#39;analisi di una grande quantità di sequenze di gDNA selezionati in numerosi pazienti contemporaneamente offre grandi prospettive nella diagnosi. Qui, abbiamo sviluppato uno specifico progetto (disponibile su richiesta), utilizzando la tecnologia Nextera per studiare 11 geni completi in 24 pazienti contemporaneamente con un d...

Nel 2010, quasi 1,5 milioni di persone (essenzialmente donne) hanno sviluppato il cancro al seno in tutto il mondo. Si stima che dal 5 al 10% di questi casi erano ereditarie. Quasi 20 anni fa, BRCA1 e BRCA2 sono stati identificati come coinvolti in seno ereditario e tumori ovarici 1. Da circa 15 anni fa, BRCA1 e BRCA2 regioni codificanti sono stati sequenziati per determinare la predisposizione genetica al cancro della mammella e dell&#39;ovaio. Alterazioni in BRCA1 e BRCA2 sono rilevati in 10 al 20% delle famiglie selezionate 2 suggeriscono che l&#39;analisi di queste regioni non è sufficiente per lo screening efficace. Recentemente, l&#39;analisi di sequenze non codificanti (introni, promotore, 3-&#39;UTR) di BRCA1 e BRCA2 ha sottolineato che le nuove mutazioni / varianti potrebbero essere collegati ad un più elevato rischio di cancro al seno 3-6. Proteine ​​BRCA1 e BRCA2 sono coinvolti nella ricombinazione omologa Repair (HHR), che è completato da numerosi partner 7. Mentre le alterazioni in BRCA1 o BRCA2 indurre difetti nella riparazione del DNA, gli altri partner possono anche influenzare il rischio di cancro al seno. Questa ipotesi sembra essere stato convalidato dal BRIP1 8 e 9 PALB2 avere un impatto provato sul cancro del collo dell&#39;utero e della mammella, rispettivamente. Inoltre, due altri geni di suscettibilità &quot;rischio moderato&quot; cancro al seno, ATM e CHEK2, possono anche essere studiati sistematicamente 10. A seguito di questi studi, abbiamo deciso di sviluppare un protocollo per l&#39;analisi di 11 geni (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, rad50, RAD51C, RAP80, e TP53) in 24 pazienti simultaneamente utilizzando un programma molto semplice e relativamente protocollo veloce basato sulla tecnologia trasposasi, con l&#39;arricchimento e il sequenziamento su un dispositivo di throughput medio. Graziea questa tecnica, abbiamo sequenziato i geni completi dall&#39;inizio del promotore al fine di 3&#39;-UTR, tranne RAP80, per cui una regione intronic di 2.500 bp non era coperto (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Questo rappresenta un totale di circa 1.000.300 bp studiato con 2.734 sonde. Di solito, BRCA1 e BRCA2 sequenze exonic vengono analizzati da Sanger sequenziamento, che ha bisogno di 1,5 mesi per meno di 20 pazienti. Con la presente protocollo (Figura 1), nello stesso tempo, 11 geni completi per più di 75 pazienti potrebbero essere analizzati.

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>Dispositivo di sequenziamento/media produttività</td></tr><tr><td>Nextera Kit di arricchimento</td><td>Illumina</td><td>FC-123-1208</td><td>Tecnologia basata sulla trasposasi</td></tr><tr><td>Cartuccia a 300 cicli</td><td>Illumina</td><td>15033624</td><td></td></tr><tr><td>Perline di ampure</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Perle di purificazione magnetiche</td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>Piastre MIDI a 96 pozzetti</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>Questa guarnizione è necessaria solo per l'amplificazione della PCR. Altri sigilli standard possono essere utilizzati durante l'esperimento</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Fornito con il dispositivo di sequenziamento software Experiment Manager Indirizzo Internet: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Strumento del sito web del produttore</td></tr></tbody></table>

gdna arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-ngs per l'analisi della sequenza intera brca1, brca2, e 9 geni coinvolti nella riparazione del dna damage

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

L&#39;uso diffuso di Next Generation Sequencing ha aperto nuove strade per la ricerca sul cancro e la diagnosi. NGS porterà enormi quantità di nuovi dati sul cancro, e soprattutto la genetica del cancro. Le conoscenze attuali e future scoperte renderà necessario studiare un gran numero di geni che potrebbero essere coinvolti in una predisposizione genetica al cancro. A questo proposito, abbiamo sviluppato un progetto Nextera per studiare 11 geni completi coinvolti nella riparazione del DNA danni. Questo protocollo è stato sviluppato per studiare in modo sicuro 11 geni (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, e TP53) dal promotore a 3&#39;-UTR in 24 pazienti contemporaneamente. Questo protocollo, basato sulla tecnologia trasposasi e gDNA arricchimento, dà un grande vantaggio in termini di tempo per la diagnosi genetica grazie a campione multiplexing. Questo protocollo può essere utilizzato in modo sicuro con gDNA sangue.

Risultati campione di QC La capacità di questo metodo per determinare sequenze di geni bersaglio si basa sulla qualità del gDNA (Figura 2A) e la qualità del passo tagmentation. Se il tagmentation non è sufficiente (Figura 2B, pannello superiore), il sequenziamento non sarà soddisfacente. Come accennato in precedenza, dopo la purificazione tagmentation, il gDNA opportuno tagmented in frammenti da 150 bp a 1.000 bp con la maggior parte dei frammenti di circa 300 ...

l'arricchimento del gDNA per il sequenziamento NGS è uno strumento facile e potente per lo studio delle mutazioni costituzionali. In questo articolo, presentiamo la procedura per analizzare semplicemente la sequenza completa di 11 geni coinvolti nella riparazione del danno al DNA.

gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l'analisi della sequenza intera BRCA1, BRCA2, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Lo scopo del seguente esperimento è quello di analizzare la sequenza di 11 geni contemporaneamente con un protocollo molto semplice e relativamente veloce basato sulla tecnologia basata sulla trasposasi. Ciò si ottiene mediante l'azione di una trasposasi per ottenere 300 frammenti di DNA di coppie di basi direttamente legati con adattatori. La prima cattura con sonde specifiche, arricchisce i campioni nelle regioni di interesse.Questo passaggio viene ripetuto ancora una volta per ottenere solo le sequenze target. Successivamente, viene eseguita l'amplificazione PCR al fine di aumentare la quantità di materiali per sequenziare i risultati ottenuti che mostrano variazioni genetiche nei geni in base all'allineamento delle sequenze e all'analisi bioinformatica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il sequenziamento Sanger, è la sua grande capacità che ci permette di analizzare 24 passioni per 11 geni completi in meno di due settimane.A dimostrare la procedura sarà Sandy, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, prepara tutti i reagenti dal kit di arricchimento del DNA. Quando è pronto, aggiungere circa 50 nanogrammi di DNA genomico in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, iniziando la preparazione aggiungendo 25 microlitri di tampone TD e poi cinque microlitri di tampone TDE.Per ogni pozzetto impostare una pipetta a 50 microlitri e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10 volte. Centrifugare brevemente, quindi posizionare la piastra in un termociclatore quando è pronta. Agitare la soluzione ST e aggiungere 15 microlitri a ciascun pozzetto contenente il campione.Impostare la pipetta a 65 microlitri e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10 volte, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente prima della centrifusione. Successivamente, aggiungere 52 microlitri di microsfere magnetiche di purificazione precedentemente miscelate a ciascuna miscela di pozzetti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente prima di centrifugare. Dopo aver lavato le perle con etanolo, rimuovere la piastra dal supporto magnetico e aggiungere 22,5 microlitri di tampone RSB.Dopo la miscelazione, posizionare la piastra sul supporto magnetico e incubare per due minuti. Assicurarsi che il surnatante appaia completamente limpido. Trasferire delicatamente 20 microlitri di rullante in una nuova piastra da 96 pozzetti.Per iniziare il primo ciclo di amplificazione PCR, aggiungere 20 microlitri di LP PMM e cinque microlitri ciascuno di indice uno e indice due a ciascuno. Mescolare bene e coprire la piastra con una pellicola adesiva Micros EAL. Dopo la centrifugazione, posizionare la piastra nel termociclatore ed eseguire il primo programma.Dopo aver purificato e determinato la resa del primo ciclo di PCR, iniziare la prima ibridazione prelevando fino a 12 campioni. Nella nuova piastra a 96 pozzetti, assicurando che il volume finale di ogni piscina non superi accuratamente i 40 microlitri, mescolare accuratamente la soluzione NCT one e aggiungere 50 microlitri a ciascun pozzetto. Dopo aver aggiunto 10 microlitri di CSO, mescolare e sigillare la piastra.Dopo la centrifugazione, posizionare la piastra in un termociclatore ed eseguire il programma. Due. Per il primo lavaggio di ibridazione, rimuovere la piastra dal termociclatore e centrifugare. Rimuovere brevemente il coperchio adesivo con molta attenzione.Trasferire 100 microlitri di miscela di reazione dalla piastra a una nuova piastra MIDI a 96 pozzetti e aggiungere 250 microlitri di soluzione Vortex SMB a pozzetti. Mescolare e sigillare la piastra prima di incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo aver lavato e scartato la supena, aggiungere 200 microlitri di soluzione WS two ben miscelata in pozzetti contenenti perle e mescolare accuratamente trasferendo l'intero volume in una nuova piastra da 96 pozzetti.Sigillare la piastra e metterla in un termociclatore. Avviare il termociclatore a 42 gradi Celsius per 30 minuti. Una volta completata, posizionare immediatamente la piastra sul supporto magnetico per due minuti.Assicurarsi che il surnatante appaia completamente limpido. Rimuovere il sigillo ed eliminare immediatamente tutto il surnatante. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico.Aggiungere 200 microlitri di soluzione Ws three ben miscelata in pozzetti contenenti perle e mescolare accuratamente. Dopo aver lavato e rimosso il supinato, sigillare la piastra e centrifugare brevemente per estrarre il natante supino residuo. Posizionare la piastra sul supporto magnetico per due minuti.Scartare il supinato residuo. Quindi, rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Aggiungere 23 microlitri di miscela precedentemente preparata.Dopo aver mescolato, sigillare la piastra e lasciare agire per cinque minuti a temperatura ambiente prima di centrifugare. Dopo aver trasferito 21 microlitri di sate in una nuova piastra a 96 pozzetti, aggiungere quattro microlitri di soluzione ET two a ciascuna. Mescolare bene e sigillare la piastra prima della centrifusione.Per iniziare la seconda ibridazione, rimuovere la pellicola adesiva e aggiungere 50 microlitri di NCT, 10 microlitri di CSO e 15 microlitri di acqua PCR Grade ai 25 microlitri di libreria. Dopo la centrifugazione, posizionare la piastra in un termociclatore ed eseguire il programma. Due. In una nuova piastra da 96 pozzetti miscelati 20 microlitri di evoluzione dal passaggio precedente.Con 25 microlitri di T-C-P-M-M e cinque microlitri di PPC, sigillare la piastra dopo la miscelazione e la centrifugazione. Quindi, posizionare la piastra in un termociclatore ed eseguire il programma tre il giorno successivo, centrifugare la piastra e lavare le perle con etanolo. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e aggiungere 30 microlitri di tampone RSB.Mescolare e incubare la piastra per due minuti. A temperatura ambiente, posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto magnetico e incubare per cinque minuti o fino a quando il surnatante S non appare completamente limpido. Trasferire delicatamente 28 microlitri di rullante in una nuova piastra da 96 pozzetti.Il passaggio finale consiste nel determinare la qualità della libreria utilizzando un analizzatore di frammenti o QPCR. Durante la corsa, la densità del cluster dovrebbe essere compresa tra 801.000 K per millimetro quadrato. Immagini diverse corrispondono a bassa densità, alta densità e densità perfetta.I risultati ottenuti con questa tecnologia sono molto facili da interpretare come mutazioni puntiformi o indel utilizzando la bioinformatica. Viene indicata la modifica della base e viene identificata direttamente la sequenza eliminata o inserita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di tre giorni se eseguita correttamente.

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