Name: Methylnitrosourea (MNU) indotta retinica degenerazione e rigenerazione in Zebrafish: istologica e Caratteristiche Funzionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri come indurre e quantificare la degenerazione e rigenerazione retinica in zebrafish adulti usando MNU. Questo protocollo combina analisi comportamentale, istologica e immunochimica per valutare i cambiamenti funzionali e morfologici nel tempo.

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Ringraziamo Monika Kilchenmann, Federica Bisignani e Agathe Duda per la loro eccellente assistenza tecnica.

Tutti gli esperimenti hanno aderito alla Dichiarazione per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research dell&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO). 1. Gli animali <ol><li> Mantenere il wild-type zebrafish (Danio rerio) del ceppo AB (Oregon) di età compresa tra 6-12 mesi in condizioni standard in acqua con una temperatura di 26,5 ° C e un 14/10 luce hr / ciclo scuro 15. </li><li> Seguire le linee guida per la cura degli animali delle istituzioni coinvolte per gli esperimenti sugli animali dopo l&#39;approvazione da parte dell&#39;Ufficio cantonale di veterinaria. </li></ol> 2 MNU Trattamento <ol><li> Preparare acqua contenente 150 mg / l di sostanza secca di N -methyl- N -nitrosourea (MNU). ATTENZIONE! MNU è tossico; può provocare il cancro, alterazioni genetiche ereditarie o danneggiare i bambini non ancora nati. </li><li> Incubare zebrafish in acqua contenente la MNU per 60 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare zebrafish rapidamente conacqua dolce e mettere il pesce in un nuovo serbatoio di pesce senza MNU. Mantenere i pesci in condizioni standard il tempo desiderato per gli esperimenti. </li></ol> 3. acuità visiva di misura <ol><li> Avviare il sistema optomotor, scegliere &#39;testing&#39; dal menu e impostare le opzioni di &quot;Simple Staircase&quot;, &quot;Acuity (Freq)&quot; e &quot;Randomized / separato&quot; 16. </li><li> Installare una bottiglia di infusione riempita con 500 ml di acqua circa 1 m sopra il sistema optomotor. </li><li> Mettere uno zebrafish nella camera di esame e collegarlo alla bottiglia di infusione. Posizionare la camera di esame nel sistema optomotor. </li><li> Avviare la misura e osservare il movimento degli occhi in tempo reale sullo schermo del computer. In tal modo, una risposta positiva (&quot;sì&quot;) è definito come saccadi consecutive nella direzione giusta, mentre una risposta negativa (&quot;no&quot;) rappresenta movimenti casuali degli occhi simili a quelli osservati con la stazionegrigliati ary. Se gli occhi della mostra zebrafish tre o più successive risposte optokinetic (okr), premere &#39;sì&#39;; se non, premere &#39;no&#39;. </li><li> Estrarre l&#39;acuità visiva, che è stato calcolato dal software determinando la soglia della frequenza spaziale dello stimolo optocinetico, alla voce &quot;Risultati&quot; nel menu. </li></ol> 4. Istologia <ol><li> Euthanize il zebrafish da un&#39;overdose di etil 3-aminobenzoato methanesulfonate (200-300 mg / L) e di enucleare gli occhi. </li><li> Fissare l&#39;intero occhi in 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C per 12 ore e poi disidratare i campioni in una serie graduata di alcol. </li><li> Incorpora i campioni in paraffina, tagliati 5 micron sezioni attraverso la testa del nervo ottico (TNO) e montarli su un vetrino. </li><li> Colorare le sezioni di paraffina deparaffized con hemalum per 4 min e immergere i vetrini due volte in acqua distillata seguita da 0,2% aci cloridricod e 0,8% di ammoniaca. Colorare le sezioni con eosina per 3 minuti dopo lo sviluppo della colorazione hemalum in acqua di rubinetto per almeno 10 min (H &amp; E). </li><li> Incorporare le diapositive disidratati in mezzo di montaggio e osservare i vetrini al microscopio luce. </li></ol> 5. Immunoistochimica <ol><li> Terminal deossinucleotidil transferasi etichettatura fine dUTP nick (TUNEL) <ol><li> Incubare le sezioni deparaffinate con 20 mg / ml di proteinasi K a temperatura ambiente per 15 min. Lavare le sezioni tre volte con Tris Buffered Saline (TBS) per 5 minuti ciascuno. </li><li> Incubare le sezioni con 50 microlitri miscela di reazione TUNEL (soluzione di etichettatura 10% e soluzione enzimatica del 90%) in una camera umidificata a 37 ° C per 60 min. Lavare tre volte con TBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Montare i vetrini con terreno contenente DAPI montaggio e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza. </li></ol></li><li> Nucleare di cellule proliferative Antigen (PCNA) colorazione <ol><li> Lessare le sezioni deparaffinate nel buffer di recupero dell&#39;antigene (Tris-EDTA + 0,05% Tween 20, pH 9.0) per 3 minuti e lavare tre volte con TBS per 5 minuti ciascuno. Blocco con 100 microlitri di blocco a temperatura ambiente la soluzione (TBS + 10% di siero di capra normale + 1% di albumina sierica bovina, pH7.6) per 1 ora. </li><li> Macchia con anti-PCNA anticorpi primari in una diluizione 1: 200 in una camera umidificata a 4 ° C per una notte. Lavare tre volte con TBS + Tween 20 per 5 minuti ciascuna. </li><li> Termina la rilevazione con gli appropriati anticorpi secondari in una diluizione 1: 500 a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Montare i vetrini con terreno contenente DAPI montaggio e osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In precedenza, il nostro gruppo ha trasferito il modello MNU di degenerazione dei fotorecettori dai roditori nel sistema zebrafish 9. Gli eventi successivi sono stati descritti e seguiti fino a 30 giorni. In questo periodo di tempo completa degenerazione morfologica della retina e la rigenerazione avvenuti dopo il trattamento iniziale. In primo luogo, istologia rivela una conta di cellule asta ridotto da 3 giorni su con un minimo al giorno 8 Corrispondentemente, TUNEL colorazione identifica l&#39;apoptosi dei...

Vision è il senso più essenziale per l&#39;essere umano e la sua perdita di valore ha un elevato impatto socio-economico. Nel mondo sviluppato, le malattie degenerative della retina sono la principale causa di perdita della vista e cecità tra gli adulti più anziani 1. La causa della maggior parte delle malattie degenerative della retina è solo parzialmente compreso e soluzioni terapeutiche per recuperare la vista perduta sono molto limitate. La retinite pigmentosa è un tipico esempio di una malattia degenerativa della retina con perdita dei fotorecettori primaria 2-3. N -methyl- N -nitrosourea (MNU) induce degenerazione retinica e quindi è ampiamente usato nei roditori per modellare malattie con fotorecettori primaria morte cellulare 4. Si tratta di un agente alchilante e porta a tumori benigni e maligni, che di solito compaiono diversi mesi dopo l&#39;esposizione 5-7. Inoltre, provoca la morte cellulare dei fotorecettori specifica entro un periodo di osservazione di breve termine. In tal modo, la perdita dello strato structu retinare e significativo assottigliamento della retina sono stati osservati in maniera concentrazione-dipendente. Cellule gliali retiniche sono stati attivati, ma non sono state trovate variazioni nel epitelio pigmentato retinico (RPE). Reticolo endoplasmatico (ER) apoptosi legati allo stress sembra essere la via principale di azione MNU nella retina 8. Abbiamo recentemente introdotto MNU come modello chimico per indurre degenerazione dei fotorecettori in zebrafish 9. Tra le altre ragioni, il pesce zebra (Danio rerio) è diventato importante nella ricerca visiva a causa della somiglianza del suo sistema visivo a quello di altri vertebrati 10. La retina esterna contiene i fotorecettori, che possono essere raggruppati in quattro diversi tipi di coni con sensibilità di punta in nell&#39;ultravioletto, a breve, medio e lungo lunghezze d&#39;onda dello spettro visibile e una canna tipo di fotorecettori. Nello strato nucleare interno (INL), i corpi cellulari dei bipolari, orizzontali, amacrine e interneuroni si trovano, come well come il soma cellulare delle cellule gliali Muller. Nello strato plessiforme esterno (OPL) si formano i contatti sinaptici tra fotorecettori e la retina interna, mentre lo strato di cellule più vicino alla lente è lo strato di cellule gangliari (GC), quali componenti formano lunghi assoni che costituiscono il nervo ottico e delle vie ottiche . Contatti sinaptici tra le cellule gangliari e le cellule nello strato nucleare interno si formano nello strato plessiforme interno (IPL) 11. La RPE si trova al di fuori della retina neurosensoriale e circonda i segmenti esterni dei fotorecettori con lunghi microvilli apicale 12. Inoltre, il pesce zebra è altamente rigenerativa e in grado di far ricrescere cervello lesionato, retina, midollo spinale, cuore, e di altri tessuti 13. Quando si verifica un danno retinico, le cellule del INL, che si pensa siano le cellule Müller, sono attivati ​​e hanno il potenziale di differenziarsi in vari tipi di cellule retiniche. Inoltre, essi generano anche progenitori asta, che si trovano nella ONL. Un altro modopubblico Fonte che alimenta la retina di zebrafish adulto con nuove cellule è la zona marginale ciliare. Questa fonte è necessaria per ottenere una densità costante di bastoncelli nel zebrafish continua crescita dell&#39;occhio 14. Il modello MNU può essere utilizzato come un approccio semplice e riproducibile degenerazione / rigenerazione di tessuto retinico. A causa di alcune somiglianze di processi biologici in zebrafish e negli esseri umani questo potrebbe aprire le porte ad individuare percorsi di morte cellulare coinvolti e per lo screening potenziali farmaci neuroprotettivi. Sulla base di un precedente studio del nostro gruppo, che ora illustreremo i metodi di questo modello zebrafish MNU indotta di de- retina e conseguente rigenerazione compresi i cambiamenti funzionali con funzione video laboratorio 9.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniaca</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>294993</td><td>0,80%</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI supporto</td><td>di montaggio Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>45260</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>2860</td><td>100%, 96%, 70%</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato sale metanosolfonato</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>E10521</td><td>Tricaina</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio Alexa 594</td><td>Life Technologies, Zugo, Svizzera&nbsp;</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Siero normale di capra</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>320331</td><td>0,20%</td></tr> <tr><td>Kit di rilevamento della morte cellulare in situ</td><td>Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Svizzera</td><td>11684795910</td><td>TUNEL Kit</td></tr><tr><td>Soluzione di emalum di Mayer</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Metilnitrosourea (MNU)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>N4766</td><td>OptoMotry Cerebrale</td></tr><tr><td></td><td>TossicoMechanics, Lethbridge, AB, Canada</td><td>n.a.Paraformaldeide</td><td></td></tr> <tr><td>(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S3004</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-PCNA&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA</td><td>sc-33756</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini Superfrost Plus</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germania</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Tris soluzione salina tamponata (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) ceppo</td><td>Università di Friburgo, Dipartimento di Biologia</td><td>n.a.Impianto</td> <td>ittico proprio</td></tr></tbody></table>

methylnitrosourea (mnu) indotta retinica degenerazione e rigenerazione in zebrafish: istologica e caratteristiche funzionali

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Malattie degenerative della retina, ad esempio, retinite pigmentosa, con conseguente danno conto fotorecettore per la maggior parte della perdita della vista nel mondo industriale. I modelli animali sono di fondamentale importanza per lo studio di tali malattie. A questo proposito la tossina specifica-fotorecettore N -methyl- N -nitrosourea (MNU) è stato ampiamente utilizzato nei roditori per indurre farmacologicamente degenerazione retinica. In precedenza, abbiamo stabilito un modello di degenerazione retinica MNU indotta in zebrafish, un altro sistema modello popolare in ricerca visiva. Una differenza affascinante per i mammiferi è la neurogenesi persistente nell&#39;adulto retina zebrafish e la loro rigenerazione dopo un danno. Per quantificare questa osservazione abbiamo impiegato le misure di acuità visiva in zebrafish adulto. In tal modo, il riflesso optocinetica è stata utilizzata per seguire i cambiamenti funzionali nei pesci non anestetizzato. Questo è stato integrato con istologia e immunoistochimica staining per apoptosi (TUNEL) e la proliferazione (PCNA) di correlare i cambiamenti morfologici in via di sviluppo. In sintesi, l&#39;apoptosi dei fotorecettori avviene tre giorni dopo il trattamento MNU, che è seguita da una marcata riduzione delle cellule nello strato nucleare esterno (ONL). Successivamente, la proliferazione delle cellule nello strato nucleare interno (INL) e ONL si osserva. Qui, ci rivelano che non solo istologica completa, ma anche una rigenerazione funzionale si verifica nel corso di un corso di 30 giorni. Ora si illustrano i metodi per quantificare e seguire zebrafish de- retina e rigenerazione utilizzando MNU in un video formato.

Acuità visiva: Il set-up sperimentale [frequenza spaziale: 0.042 circoli / grado (c / d); contrasto: 100%; velocità di deriva: 20 gradi / secondo (d / src); indietro luminanza luce: 152 cd / m 2] di questo studio ha permesso la valutazione okr di zebrafish adulto. La durata media della misurazione VA era circa 5-10 minuti per ogni zebrafish, che tollerato bene la procedura. L'acuità visiva prima dell'esposizione MNU era 0,577 ± 0,014 cicli / grado (c / d). Figura 1</strong...

Qui dimostriamo quantificazione dei de- retina e la rigenerazione e il suo impatto sulla funzione visiva con N -methyl- N -nitrosourea in zebrafish adulto. Perdita di acuità visiva e diminuito il numero dei fotorecettori sono state seguite dalla proliferazione nello strato nucleare interno. Completa rigenerazione morfologica e funzionale si è verificato 30 giorni dopo il trattamento iniziale.

Methylnitrosourea (MNU) indotta retinica degenerazione e rigenerazione in Zebrafish: istologica e Caratteristiche Funzionali

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre la degenerazione retinica e la conseguente rigenerazione nel pesce zebra adulto utilizzando n metile e nitro ueaa. Ciò si ottiene incubando prima il pesce zebra di tipo selvatico in acqua contenente N metile N nitrosa urea, o MNU. La funzione visiva successiva viene quantificata misurando la risposta optocinetica o OKR e calcolando l'acuità visiva in diversi punti temporali.Dopo il trattamento, quindi, il pesce zebra viene soppresso e gli occhi nucleati per esami istologici utilizzando la colorazione h ed e per osservare i cambiamenti morfologici nel tessuto retinico. Infine, i cambiamenti cellulari vengono visualizzati nella retina con colorazione specifica per la morte cellulare e la proliferazione. In definitiva, la misurazione dell'acuità visiva e la quantificazione dei cambiamenti morfologici e cellulari vengono utilizzate per visualizzare la D retinica e la rigenerazione.Il vantaggio principale di questo modello farmacologico è che è semplice e veloce da usare e induce una degenerazione e una rigenerazione regionali affidabili nei pesci zebra adulti. Per effettuare il trattamento NM metil n nitroso urea o MNU, iniziare preparando acqua contenente 150 milligrammi per litro di MNU secco. Procedere con cautela mentre si lavora con nm metile e nitrosa urea poiché è tossico e può causare danni genetici ereditari al cancro. Un nascituro mantiene il ceppo di tipo AB, zebrafish di età compresa tra sei e 12 mesi in condizioni standard.Trasferisci il pesce zebra nell'acqua MNU e incubalo per 60 minuti a temperatura ambiente. Quindi utilizzare acqua dolce per sciacquare rapidamente i pesci prima di trasferirli in un nuovo acquario senza MNU. Mantenere il pesce in condizioni standard per tutto il tempo desiderato per gli esperimenti.Prepararsi a misurare l'acuità visiva avviando il sistema motore. Quindi, dal menu, scegli test e imposta le opzioni su scala semplice. Installare una bottiglia per infusione riempita con 500 millilitri d'acqua a circa un metro sopra il sistema motore.Posizionare un pesce zebra nella camera d'esame e collegarlo al flacone per infusione. Quindi posizionare la camera d'esame nel sistema automobilistico. Successivamente, avvia la misurazione e osserva il movimento degli occhi in tempo reale sullo schermo del computer.Una risposta positiva o sì, è definita come secondi consecutivi nella direzione corretta, mentre una risposta negativa o no rappresenta movimenti oculari casuali simili a quelli osservati con i reticoli fissi. Se gli occhi del pesce zebra mostrano tre o più risposte optocinetiche successive o OKR, premere sì. In caso contrario, premere n.Nella sezione Risultati del menu, estrarre l'acuità visiva, che è stata calcolata dal software determinando la soglia della frequenza spaziale dello stimolo cinetico ottico per effettuare l'analisi istologica. Dopo l'eutanasia del pesce zebra secondo il protocollo di testo e nella nucleazione, gli occhi utilizzano il 4% di formaldeide in PBS per fissare gli occhi intatti a quattro gradi Celsius per 12 ore prima di utilizzare una serie di alcol graduato per disidratare i campioni, incorporare i campioni in paraffina, quindi tagliare sezioni di cinque micrometri attraverso la testa del nervo ottico o ONH e montarle su vetrini. Quindi, usa l'Alam per colorare le sezioni decarbonizzate per cinque minuti prima di immergere i vetrini in acqua distillata due volte, seguiti da acido cloridrico allo 0,2% e ammoniaca allo 0,8%.Sposta i vetrini nell'acqua del rubinetto per almeno 10 minuti. Trasferire le sezioni nell'eosina per tre minuti dopo il lavaggio e la disidratazione dei vetrini con una serie di etanolo. Utilizzare un mezzo di montaggio per incorporarli e un microscopio ottico per osservare i campioni per il terminale, l'ossinucleotide transferasi, la marcatura DUPT Nick n o il tunnel.Aggiungere 20 microgrammi per millilitro di pronasi K alle sezioni di deparize e incubarle a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo aver utilizzato la soluzione salina tamponata tris per lavare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna, aggiungere 50 microlitri della miscela di reazione a tunnel alle sezioni e incubarle in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Una volta che i campioni sono stati lavati e triss tre volte per cinque minuti ciascuno, utilizzare un terreno di montaggio contenente dappy per montare i vetrini davanti a loro sotto un microscopio a fluorescenza per eseguire la colorazione dell'antigene nucleare cellulare proliferante o del PCNA.Mettere i campioni nel recupero dell'antigene, tamponare e far bollire per tre minuti prima di lavarli in TB S3 volte per cinque minuti ogni ora utilizzando il tampone bloccante, incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente. Quindi con una diluizione da uno a 200 di anti-PC NA. Gli anticorpi primari incubano i campioni in una camera umidificata durante la notte a quattro gradi Celsius dopo aver lavato i campioni con TBS plus tween 23 volte per cinque minuti ciascuno. Utilizzare una diluizione da uno a 500 di anticorpi secondari per incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente.Una volta che i vetrini sono stati montati con un mezzo di montaggio contenente dpi, osservarli al microscopio a fluorescenza. Questa figura mostra l'andamento dell'acuità visiva per il pesce zebra adulto dopo l'applicazione di 150 microgrammi per litro di MNU. A partire dal primo giorno, le misurazioni hanno rivelato una forte diminuzione dell'acuità visiva raggiungendo i valori minimi al terzo giorno prima di un aumento dei valori.Ha proceduto all'ottavo giorno e ha raggiunto un recupero completo al giorno 30 come si vede attraverso l'analisi istologica della degenerazione retinica dell'occhio di zebrafish, che è stata seguita per 30 giorni dopo che il trattamento con MNU includeva l'interruzione dell'INL con formazione di carie dell'ONL a partire dal terzo giorno e con la perdita massima di Rod ONL osservata l'ottavo giorno attraverso la colorazione positiva del tunnel in vari strati della retina sensoriale. È stato osservato che la degenerazione retinica dopo il trattamento con MNU è stata causata dall'apoptosi con la maggior parte delle cellule tunnel positive trovate nell'ONL al terzo giorno. Tuttavia, nello stesso momento sono state osservate anche cellule morenti nell'INL.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la degenerazione della retina nel pesce zebra adulto utilizzando il trattamento m and you, nonché di come quantificare i cambiamenti funzionali e morfologici utilizzando la misurazione OKR e le procedure immunoistochimiche.

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