Un metodo altamente riproducibile e semplice da eseguire In Vivo Oculare enucleazione del mouse dopo apertura degli occhi
6 ottobre 2014
La rimozione degli occhi, chiamato anche enucleazione, fornisce una strategia utile per studiare gli aspetti di visual, cross-modale, e la plasticità dello sviluppo lungo il sistema visivo dei mammiferi poiché induce irreversibile parziale (monoculare) o completa (binoculare) perdita della vista. Qui si descrive un approccio altamente riproducibile e semplice da eseguire in vivo enucleazione.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rimuovere con successo un occhio da un topo anestetizzato in modo molto semplice e riproducibile. Ciò si ottiene spostando prima il bulbo oculare premendo delicatamente sul canto con una pinza curva. Il secondo passo della procedura consiste nel guidare il forcipe dietro l'occhio, per afferrare saldamente il nervo ottico.
Il terzo passo è fare movimenti circolari. Con la mano che tiene la pinza, il corpo del mouse si muoverà nella stessa direzione. Il passo finale consiste nell'aumentare gradualmente la velocità dei movimenti per garantire la costrizione del nervo ottico con conseguente distacco del bulbo oculare.
In definitiva, l'occhio può essere utilizzato per studiare longitudinalmente la via visiva AFR, ad esempio, rivelando diversi processi di plasticità della deprivazione sensoriale nel cervello del topo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, che spesso utilizzano la sutura e la dissezione smussata, è che il nostro metodo di iazione si basa semplicemente sulla costrizione del nervo ottico, che si traduce in un sanguinamento minimo o nullo ed è molto facile da imparare. Iniziare con l'anestetizzazione del topo utilizzando un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina e meine in soluzione fisiologica.
Confermare la sedazione controllando i riflessi del topo. Pizzicare le dita dei piedi con una pinza e verificare la risposta riflessa. Se non c'è risposta, usa un applicatore con punta di cotone e etanolo al 70% per pulire le palpebre e l'area intorno all'occhio.
Se non c'è risposta al battito delle palpebre, procedere con l'occhio in nucleazione. Posiziona il mouse su una superficie stabile, piana, liscia e asciutta. Sterilizzare le punte delle pinze seghettate curve in uno sterilizzatore a microsfere di vetro.
La migliore dimensione della punta da utilizzare è 0,5 per 0,4 millimetri. Quindi, premere delicatamente sul canto con la pinza fino a quando il bulbo oculare non viene spostato dall'alveolo e il nervo ottico è raggiungibile. Quindi guidare la pinza dietro l'occhio e premere con decisione e tenere premuto il nervo ottico con il nervo ottico afferrato Inizia lentamente a muovere la pinza in cerchio nella direzione di minor resistenza.
Tenendo il mouse contro il tavolo operatorio, il mouse deve essere fissato. Anche il suo corpo dovrebbe muoversi. Accelera gradualmente fino a quando dopo sette-15 movimenti circolari, il nervo ottico si restringe e il bulbo oculare si stacca.
Se le rotazioni sono troppo rapide o le pinze vengono tirate troppo forte, il nervo si romperà prematuramente e seguirà la supplica. Inizia con l'inversione dell'anestesia. Somministrare al topo un'iniezione intraperitoneale di aamaz tutto cloridrato in soluzione fisiologica.
Quindi somministrare per via intramuscolare 0,05. Millilitri di antidolorifico preparato come meloxicam e analgesia devono essere somministrati ogni 24 ore. Ora, applica un unguento per gli occhi sull'occhio rimanente per prevenire la disidratazione della cornea.
Se questo fosse stato applicato prima dell'intervento, si sarebbe spalmato sul tavolo. Sposta il mouse in una gabbia di contenimento, controlla la temperatura corporea del topo usando una piastra riscaldante o una coperta mentre si riprende, quando l'animale riacquista il controllo motorio, trasferiscilo di nuovo nella sua gabbia di casa. Una rimozione riuscita dell'occhio è caratterizzata dall'assenza di sanguinamento o da qualsiasi danno fisico apparente al tessuto orbitale o all'orbita oculare.
L'occhio enucleato dovrebbe avere le caratteristiche di un globo intatto come una cornea liscia e una coroide. Il nervo ottico deve essere ristretto alla base della retina. La lunghezza rimanente del nervo sull'animale dovrebbe mostrare un taglio netto e l'area cerebrale circostante non dovrebbe essere danneggiata.
Un esperimento è stato condotto utilizzando queste tecniche, seguito dal rilevamento dell'mRNA di Z 2 68 mediante ibridazione radioattiva in C 2 per scoprire l'attività neuronale indotta visivamente nella corteccia cerebrale. A differenza dei controlli stimolati visivamente, i topi con entrambi gli occhi e nucleati mostravano attività basale nella corteccia visiva sinistra e destra a causa della completa mancanza di input visivo. Pertanto, sono stati scoperti i confini tra la corteccia visiva e quella non visiva.
L'enucleazione monoculare ha rivelato che le due regioni guidate dal monoculare erano ipoattive nella corteccia visiva controlaterale al colorante rimosso. Queste regioni si trovano medialmente e lateralmente alla zona binoculare centrale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un minuto se eseguita correttamente.
Pertanto, fornisce un metodo efficiente per esaminare l'attività, la plasticità o altri fenomeni nel percorso visivo ORL.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo semplice per eseguire l'enucleazione in vivo nei topi, consentendo ai ricercatori di studiare la plasticità visiva e cross-modale. La tecnica minimizza il sanguinamento ed è facile da apprendere, rendendola adatta a diverse applicazioni sperimentali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Sistema Visivo
- Ricerca sulla Plasticità
Sfondo
- L'enucleazione induce perdita della vista, facilitando gli studi sul trattamento visivo.
- La procedura permette di esaminare gli effetti della privazione sensoriale sul cervello.
- I metodi esistenti spesso comportano tecniche complesse che possono portare a complicazioni.
- Questo metodo mira a fornire un'alternativa più sicura ed efficiente.
Scopo dello studio
- Descrivere una tecnica riproducibile per l’asportazione dell’occhio nei topi.
- Permettere lo studio delle vie visive e della plasticità cerebrale.
- Migliorare i metodi di enucleazione esistenti.
Metodi Utilizzati
- Anestesia del topo mediante una miscela di ketamina e soluzione salina.
- Spostamento del bulbo oculare utilizzando pinze curve.
- Afferrare e stringere il nervo ottico per staccare il bulbo oculare.
- Cura post-operatoria, compresa la somministrazione di analgesici e il monitoraggio del recupero.
Risultati principali
- La tecnica ha determinato un sanguinamento minimo e tessuti circostanti intatti.
- I topi enucleati hanno mostrato un'attività neuronale alterata nella corteccia visiva.
- L'enucleazione monoculare ha rivelato un'ipoattività in specifiche aree visive.
- La procedura può essere eseguita in modo efficiente in meno di un minuto.
Conclusioni
- Il metodo di enucleazione descritto è efficace per lo studio della plasticità visiva.
- Fornisce un approccio affidabile per indagare gli effetti della privazione sensoriale.
- Studi futuri possono sfruttare questa tecnica per ottenere approfondimenti più dettagliati sui processi di elaborazione visiva.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'enucleazione oculare in vivo affidabile nei topi consente un'indagine ad alto rendimento sulla plasticità del sistema visivo e sui meccanismi di privazione sensoriale, supportando la validazione precoce di bersagli in neurobiologia. La riproducibilità e la semplicità operativa del metodo riducono la variabilità procedurale, migliorando l'affidabilità predittiva delle analisi successive. Questa capacità è strategicamente rilevante per i team biofarmaceutici che cercano modelli preclinici robusti per studiare l'adattamento neurale e la plasticità crociata tra modalità sensoriali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette modelli di deafferentazione controllata per studi meccanicistici della plasticità neurale.
- Supporta la validazione funzionale delle target isolando le variabili di input sensoriale in vivo.
- Facilita l'analisi guidata da ipotesi sull'adattamento della via visiva.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una preparazione standardizzata di modelli animali per lo screening fenotipico riproducibile.
- Garantisce un danno tissutale minimo e un recupero post-operatorio costante, sostenendo l'affidabilità del saggio.
- Permette una valutazione quantitativa dei cambiamenti nell'attività neuronale in seguito a deprivazione sensoriale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per lo studio della neuroplasticità e della perdita sensoriale.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di bersagli neurali.
- Riduce il rischio biologico consentendo la generazione robusta e scalabile di modelli animali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di enucleazione si inserisce nel continuum che va dalla scoperta precoce alla fase preclinica, fornendo una base per la riduzione del rischio meccanicistico e la validazione del bersaglio nella ricerca neurobiologica.
- Biologia della scoperta: Facilita il test dell'ipotesi nulla consentendo la rimozione precisa degli stimoli sensoriali.
- Screening: Fornisce modelli animali riproducibili per saggi quantitativi successivi.
- Analisi: Permette la misurazione dell'attività neuronale e della plasticità corticale dopo l'enucleazione.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta di base a modelli preclinici di deprivazione sensoriale.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo scalabile e a bassa variabilità, adattabile a diversi modelli di roditori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli studi sull'adattamento neurale e sulla validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione degli animali, riducendo il carico di addestramento e la variabilità procedurale.
- Valore strategico: Consente decisioni efficienti di tipo go/no-go nei portafogli focalizzati sulla neuroplasticità.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei target e dei percorsi neurali in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'anestesia dei roditori e nella manipolazione microchirurgica.
- Necessita dell'accesso a pinze curve sterili e a infrastrutture per le cure post-operatorie.
- Richiede una standardizzazione tra i team per garantire la riproducibilità negli studi multicentrici.
- L'adattamento ad altre specie di roditori è possibile con modifiche minori.
- Non adatto per l'analisi del tessuto retinico a causa del potenziale danno procedurale.
