Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare un'interazione con il recettore proteico utilizzando il plasma di superficie e la risonanza. Ciò si ottiene mediante iniezione degli ioni nichel sulla matrice di acido nitro triacetico o NT a. Successivamente, una delle proteine, chiamata ligando, viene immobilizzata sul chip del sensore dopo un'iniezione in bianco.

La seconda proteina, chiamata analita, viene iniettata sopra il ligando immobilizzato. Al fine di rilevare un'interazione tra le due proteine, i risultati mostrano che le due proteine interagiscono transitoriamente con l'analita, si associano e si dissociano dal ligando. L'affinità dell'interazione può essere calcolata in base ai tassi di dissociazione e dissociazione misurati delle due proteine.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il pull down o l'immunoprecipitazione, è che può identificare interazioni transitorie o a bassa affinità che sono spesso di grandi conseguenze biologiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biochimica, ad esempio se la proteina di interesse si lega a un'altra proteina o a un'altra piccola molecola, è possibile determinare la natura dell'interazione e misurare l'affinità. Per preparare il campione, rimuovere tutti gli aggregati dalla proteina purificata come descritto nel protocollo di testo.

Preparare il tampone di corsa e filtrare tutti i tamponi e i campioni di proteine utilizzando filtri da 22 micron a punto zero. Assicurarsi che i filtri siano compatibili con le proteine in anticipo prima di collegare il flacone tampone funzionante all'ingresso della pompa. Tenere da parte 10 millilitri di tampone di corsa in un tubo separato.

Quindi diluire i campioni rispetto al tampone in esecuzione per evitare disallineamenti del buffer. Come regola generale, per la smobilizzazione stabile del ligando utilizzare basse concentrazioni di ligando con iniezioni più lunghe a basso flusso rispetto ad alte concentrazioni di ligando Con iniezioni più brevi ad alto flusso, diluire lo stock di ligando concentrato in un tampone di corsa fino a una concentrazione finale di circa 20 microgrammi per millilitro. Infine, diluire l'analita nel tampone di corsa alla concentrazione desiderata.

Per un sistema di affinità sconosciuta, testare un intervallo di concentrazioni dell'analita da 10 micromolari a 10 anomolari in diluizioni di dieci volte. In questa dimostrazione, viene riutilizzato un chip accoppiato NTA adatto a catturare proteine con un tag oli-istidina. Dopo aver estratto il truciolo immagazzinato dal tampone, sciacquare abbondantemente con acqua distillata doppia, asciugare delicatamente e riporlo nella guaina originale.

Per agganciare il chip allo strumento SPR, aprire lo sportello del chip del sensore e posizionare il chip nella sua guaina. Chiudi lo sportello e premi il chip del dock. Impostare la temperatura della cella del chip a 25 gradi Celsius.

Impostare il compartimento dei campioni a sette gradi Celsius per mantenere stabile la proteina durante l'esperimento. Dopo aver preparato le soluzioni per il caricamento e lo stripping come descritto nel protocollo di testo, adescare lo strumento SPR con il buffer in funzione. Per il passaggio successivo, impostare il flusso a 50 microlitri al minuto.

Definire i percorsi di flusso e la sottrazione di riferimento per ottenere i risultati qui descritti. Impostare i percorsi della cella di flusso numero uno e della cella di flusso numero due e della cella di flusso numero uno, sottratte dalla cella di flusso numero due, dopo aver selezionato il rack di campioni adatto, salvare il file dei risultati prima di iniziare l'esperimento in modo che i dati vengano salvati durante l'esecuzione. Ogni esperimento è composto da cicli.

Tenere un registro chiaro delle iniezioni effettuate in ogni ciclo e separare i ligandi che caricano l'iniezione in bianco del tampone e l'iniezione dell'analita in cicli diversi. Il primo ciclo è la preparazione dei trucioli e il caricamento del nichel. Assicurarsi che il flusso e i percorsi siano impostati, quindi iniettare EDTA da 350 millimolari per un minuto per lavare via le molecole rimanenti.

Quindi, impostare il flusso su 10 microlitri al minuto. Quindi iniettare 0,5 millimolari di cloruro di nichel per due minuti. Ora la resina del chip è rivestita da ioni nichel.

Il secondo ciclo è l'immobilizzazione del ligando. Impostare il flusso su 15 microlitri al minuto e impostare il percorso del flusso verso la cella di flusso. Numero due, iniettare il ligando A fino a raggiungere valori di unità di risposta o R ru che sono da 10 a 20 volte il peso molecolare del ligando.

Ad esempio, caricare un legante di 50 kilodalton tra 501.000 rus. Tenere traccia del valore di UR raggiunto. Quindi impostare il flusso a 15 microlitri al minuto e il percorso del flusso verso la cella di flusso numero uno, iniettare il ligando di controllo B fino allo stesso valore RU di quello del ligando a monitorare la sottrazione, sensori Graham online per aiutare a controllare la lunghezza dell'iniezione.

Quindi, impostare il flusso su 50 microlitri al minuto e il percorso del flusso verso la cella di flusso numero uno e la cella di flusso. Numero due, procedere al lavaggio del sistema per cinque-20 minuti fino a quando la linea di base non si stabilizza. Il terzo ciclo è l'iniezione del bianco.

Questa iniezione servirà per la sottrazione del bianco. Includere quindi tutti i componenti che verranno iniettati con l'analita, ad eccezione dell'analita stesso. La lunghezza dell'iniezione può variare a seconda del tempo necessario per raggiungere l'equilibrio.

Impostare il flusso su 15 microlitri al minuto e impostare il percorso del flusso sulla cella di flusso numero uno e sulla cella di flusso numero due e sulla cella di flusso numero uno, sottratta dalla cella di flusso. Numero due, inserire il comando del peso per 30 secondi per ottenere una linea di base stabile. Quindi iniettare il buffer in esecuzione per 13 secondi.

Attendere da 120 a 600 secondi per registrare la fase di dissociazione. La lunghezza di questo passaggio varia a seconda del kd. Più lenta è la dissociazione, più lungo deve essere questo passaggio.

Il quarto ciclo è l'iniezione di analita. Copia e incolla le condizioni esatte utilizzate nel terzo ciclo in modo che queste due iniezioni possano essere successivamente sottratte. Modificare la posizione della fessura nel rack da quella che contiene la soluzione di controllo a quella che contiene la soluzione dell'analita.

Scegliere una concentrazione leggermente superiore alla costante di dissociazione di equilibrio prevista. Se non sono disponibili conoscenze preliminari, scegli un micromolare come buon punto di partenza. Dopo aver eseguito una seconda volta l'iniezione del tampone e l'iniezione dell'analita, eseguire l'intervento dei chip del ciclo sette.

Impostare il flusso a 50 microlitri al minuto, quindi iniettare 350 millimolari di EDTA per un minuto. Ripeti questo passaggio altre due volte. Non utilizzare una singola iniezione di tre minuti in quanto ciò potrebbe danneggiare il chip.

Quindi, iniettare lo 0,25% di sodio dcal solfato per un minuto. Ripetere questo passaggio due volte. Non utilizzare una singola iniezione di tre minuti in quanto ciò potrebbe danneggiare il chip in seguito al caricamento del nichel, il trasportatore di interesse è immobilizzato sulla cella di flusso numero due fino a 3, 500 R rus.

Quindi, utilizzando lo stesso flusso e la stessa durata dell'iniezione, il ligando di controllo viene iniettato sulla cella di flusso numero uno, raggiungendo inizialmente solo fino a 3000 R per assicurarsi che quantità di proteine simili siano immobilizzate su entrambe le celle di flusso. Il ligando di controllo viene ulteriormente caricato con un'iniezione più breve monitorando il carico fino a 3.500 RDU. La forma della scala rappresenta l'aumento graduale della massa sulla cella di flusso numero uno ad ogni iniezione, mostrata qui è la cella di flusso numero uno, sottratta dalla cella di flusso.

In secondo luogo, è importante variare la durata dell'iniezione dei ligandi per ottenere un carico uguale. Al contrario, la durata dell'iniezione dell'analita deve essere mantenuta costante per tutte le concentrazioni utilizzate per ottenere dati quantitativi. Viene iniettato un intervallo di concentrazioni dell'analita.

Qui sono mostrate iniezioni di diverse concentrazioni di analita con una lunghezza di iniezione costante. Le diverse concentrazioni dell'analita vengono iniettate in ordine casuale e i grammi del sensore a doppio bianco vengono allineati sull'asse x prima dell'analisi per derivare l'affinità e la costante di velocità. Viene applicato un adattamento del modello.

La costante di dissociazione di equilibrio calcolata per l'interazione mod BCA è approssimativamente tre volte 10 al meno sei molare con un KA moderatamente veloce e un KD veloce Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita entro poche ore dalla visione di questo video. Dovresti avere una buona comprensione di come progettare ed eseguire un esperimento SPR utilizzando la tua proteina di interesse.