Name: In tempo reale citotossicità saggi in Human Sangue intero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Scopri come misurare la citotossicità di cellule tumorali target in sangue intero umano con risoluzione a singola cellula. Questo metodo combina imaging ad alta velocità con analisi quantitativa per valutare l'efficacia di anticorpi terapeutici in tempo reale.

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Ringraziamo programma IMAT National Cancer Institute dal NIH per il finanziamento di questo lavoro [R33 CA174616-01A1].

1. Obiettivo delle cellule Preparazione <ol><li> Mantenere (cellule di linfoma ad es. Raji) cellule bersaglio in terreni di coltura (RPMI 1640 medium di coltura, con il 10% di siero inattivato al calore fetale bovino (FBS), 4Nm L-glutammina, e 500 UI / ml di penicillina / streptomicina) a 37 ° C in un incubatore CO 2 al 5%. </li><li> Centrifugare il campione per agglomerare le cellule bersaglio in un tubo da 15 ml. Tempo di centrifugazione varia con diversi tipi di cellule; centrifugare per 3 minuti a 468 xg per le cellule Raji. </li><li> Prima aspirare eventuali bolle formate sulla superficie del surnatante, e rimuovere l&#39;intero surnatante. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione salina in tubo. Risospendere le cellule pipettando la soluzione su e giù più volte per rompere il ciuffo cellulare. </li><li> Centrifugare il campione per 3 min a 468 x g. </li><li> Aspirare eventuali bolle formate sulla superficie del surnatante, e rimuovere l&#39;intero surnatante. </li></ol> 2. Preparazione dei microarrays cellulari <ol><li> Oadesione cellulare btain 96 kit pozzetti o singoli array di celle 8 diapositive da camera e (vedi tabella dei materiali / reagenti). </li><li> Applicare 1,2 ml di Activator al reagente DNA dal kit. Tappare il flacone, capovolgere, e scuotere delicatamente per miscelare la soluzione. </li><li> Lasciare la soluzione di reagire per 20 minuti a RT. </li><li> Applicare la soluzione miscelata al pellet di cellule bersaglio (nel tubo 15 ml). </li><li> Aggiungere coloranti di fluorescenza citosoliche verdi ad una concentrazione finale di 500 nM. </li><li> Incubare le cellule bersaglio con la soluzione mista e la tintura per 30 min a temperatura ambiente su un agitatore orbitale. </li><li> Lavare le cellule due volte con 5 ml di PBS e risospendere le cellule in 10 ml di mezzi di crescita. </li><li> Applicare 100 microlitri della soluzione proveniente dal passaggio 2,7 a ciascun pozzetto. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Assicurarsi che i numeri di cellulare variano tra 5 × 04-01 ottobre × 10 6 cellule per pozzetto. </li><li> Dopo 10-15 minuti di incubazione a temperatura ambiente, lavare delicatamente i campioni due volte con 200-300 supporti di crescita microlitri per rimuovere tutte le cellule non legato. NOTA: A proposito di 5-10 mezzi di crescita microlitri rimane in ciascun pozzetto dopo il lavaggio. </li></ol> 3. Sangue intero citotossicità saggi <ol><li> Aggiungere 180 ml di sangue umano intero a ciascun pozzetto. </li><li> Ottenere soluzione di anticorpo anti-CD20 a 5 mg / ml, ed eseguire diluizioni seriali per fare 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ug / ml di soluzione di anticorpi anti-CD20 in provette da 1,5 ml. Aggiungere 20 ml di ciascuna concentrazione di anticorpi anti-CD20 per ogni campione e fare triplicato. </li><li> Aggiungere propidio ioduro ad una concentrazione finale di 500 nM di ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la piastra risultante a 37 ° C con 5% di CO 2 per 16 ore. </li><li> Immagine le cellule sulle diapositive o piastre da 96 pozzetti con un sistema di imaging automatico con 8X ingrandimento. </li><li> Utilizzare il programma di conteggio delle cellule del sistema di imaging automatico per quantificare i risultati. NOTA: Il software del sistema di imaging automatico fornisce semplicepasso-passo le operazioni di conteggio delle cellule. Il protocollo di utilizzo di questo software sono disponibili sul sito web del fornitore. </li><li> Selezionare [Risultati Recensione] dalla pagina principale del software. </li><li> Selezionare [Il file salvato per i campioni]. </li><li> Prima porta FITC significa intensità&gt; 50, quindi cancello TxRed significa intensità&gt; 20. </li><li> Selezionare [Panoramica Piastra]. </li><li> Selezionare [Tabelle Esporta]. NOTA: La formula uccisione delle cellule percentuale del programma è la seguente: Uccisione% cella di destinazione = (numero di cellule colorate sia verde e rosso / # di cellule colorate verde) * 100% </li></ol>

<ol><li>Hutchinson, L., Kirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+drug+attrition+rates--where+are+we+going+wrong%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">High drug attrition rates--where are we going wrong.</a> Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).</li>
<li>Moreno, L., Pearson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attrition+rates+be+reduced+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Informa+healthcare%22%5BJournal%5D)">Attrition rates be reduced in cancer drug discovery.</a> Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).</li>
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<li>Suntharalingam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+storm+in+a+phase+1+trial+of+the+anti-CD28+monoclonal+antibody+TGN1412%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412.</a> N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).</li>
<li>Eastwood, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+TGN1412+trial+failure+explained+by+species+differences+in+CD28+expression+on+CD4%2B+effector+memory+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells.</a> Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).</li>
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<li>Gerlier, D., Thomasset, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+MTT+colorimetric+assay+to+measure+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation.</a> Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).</li>
<li>Toriello, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microfluidic+bioprocessor+for+single-cell+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).</li>
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<li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+trends+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Novel trends in high-throughput screening.</a> Current opinion in pharmacology. 9, 580(2009).</li>
<li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).</li>
<li>Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+for+high-content+screening+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis for high-content screening and analysis.</a> J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).</li>
<li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening%3A+solution-+and+cell-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 47(2000).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+is+more+than+genomic+medicine%3A+confusion+over+terminology+impedes+progress+towards+personalized+healthcare%5BTitle%5D)+AND+%22PERS+MED%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare.</a> PERS MED. 9, 85(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

WCA è un fondamentale strumento di screening in vitro anti-cancro con risoluzione di singola cellula 12-16, idealmente utilizzato dopo tradizionali proiezioni di destinazione, come CDC e test ADCC 9-11, e prima che i test sugli animali preclinici. Attualmente, obiettivo primario test di screening come il CDC o test ADCC sono tutte eseguite in un supporto semplificato o un sistema tampone. Tuttavia, farmaci candidati che mostrano efficacia in questi sistema tampone semplificata non sono sem...

I recenti progressi nel settore farmaceutico hanno portato ad un crescente interesse per la realizzazione delle identificazioni di anticorpi specifici di cellule tumorali e trattamenti contro il cancro personalizzati; Tuttavia, molti di ostacoli nel processo. Solo il 5% degli agenti che hanno attività antitumorale in fase di sviluppo preclinico sono concessi in licenza dopo aver mostrato sufficiente efficacia di fase II-III test 1,2. Le strategie preclinici (in vitro e in vivo) sono ottimali altrettanti esempi hanno dimostrato che i farmaci antitumorali si comportano diversamente nell&#39;uomo e in animali da laboratorio principalmente a causa dei diversi componenti del sangue 3-5. Per affrontare la necessità di una piattaforma di screening di farmaci antitumorali e per fornire un controllo di punti prima sperimentazione animale costosa e sperimentazioni cliniche, un intero saggio di citotossicità sangue umano (WCA) viene proposto per valutare l&#39;efficacia dei farmaci antitumorali in ambiente biologico più rilevante. Laintero test di citotossicità sangue può essere utilizzato per valutare la risposta delle cellule individuali anticorpi e altri farmaci candidati nel sangue umano intero. Il WCA è sviluppato incorporando la tecnologia high-throughput posizionamento cella con high-throughput e ad alto contenuto di imaging 6. Utilizzando un sistema di imaging automatizzato, il numero sia delle cellule viventi e morti può essere determinata con un elevato grado di precisione. A causa del fatto che le cellule bersaglio sono immobilizzati sullo stesso piano focale, WCA è in grado di fornire analisi citotossicità quantitativa in tempo reale senza la rimozione dei globuli rossi. Inoltre, il sistema di imaging automatico fornisce diversi vantaggi come quella che solo le cellule bersaglio che hanno raggiunto i criteri specificati (ad es., Le cellule fluorescente, e la morfologia delle cellule) sono recintati e trasformati. Inoltre, permette la produzione di 144 lastre al giorno. Di conseguenza, la capacità di imaging e il throughput permette funzionamento di high-cONTENUTO e gli esperimenti high-throughput contemporaneamente. Combinando WCA e il sistema di imaging automatizzato, alta velocità di analisi di citotossicità delle cellule quantitativa può essere raggiunto all&#39;interno di un ambiente biologico più rilevante.

<table><tbody><tr><td>Kit di piastre da 96 pozzetti per l'attacco delle celle&nbsp;</td><td>Adheren</td><td>AP9601</td><td></td></tr><tr><td>Sospensione Array di cellule singole Vetrino a 8 pozzetti</td><td>Adheren</td><td>SS0801</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino a 8 pozzetti</td><td>Adheren</td><td>SS0802</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare di linfoma CD20+</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Cellule di Raji</td></tr><tr><td>Linea cellulare di linfoma CD20-ATCC</td><td></td> <td>CRL-8083</td><td>MC/CAR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo</td><td>SH30070.01HI</td><td></td></tr><tr><td>Peni/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Colorante citosolico</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Cell Tracker</td></tr><tr><td>Rituxan verde (biosimilare)&nbsp;</td><td>Eureka Therapeutics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sangue intero umano</td><td>Allcells</td><td>WB001</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging automatico</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Contatta</td><td>il fornitore Cell Reporter</td></tr><tr><td>Programma di conteggio delle cellule</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Contatta il fornitore</td><td>Cell Reporter</td></tr></tbody></table>

in tempo reale citotossicità saggi in human sangue intero

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Un live a base di cellule del sangue intero test di citotossicità (WCA) che consente l&#39;accesso alle informazioni temporali della citotossicità delle cellule complessivo è sviluppato con high-throughput tecnologia di posizionamento delle cellule. Le popolazioni di cellule tumorali mirate in primo luogo sono preprogrammati per l&#39;immobilizzazione in un formato matrice, ed etichettati con verdi coloranti fluorescenti citosoliche. Dopo la formazione matrice di celle, farmaci anticorpali sono aggiunti in combinazione con sangue umano intero. Ioduro di propidio (PI) viene poi aggiunto per valutare la morte cellulare. La matrice di celle viene analizzato con un sistema di imaging automatico. Mentre tintura citosolico etichette le popolazioni di cellule tumorali mirate, PI etichette le popolazioni di cellule tumorali morte. Pertanto, la percentuale di cancro bersaglio uccisione delle cellule può essere quantificata calcolando il numero di cellule sopravvissute mirati al numero di cellule bersaglio morte. Con questo metodo, i ricercatori possono accedere dipendente dal tempo e informazioni citotossicità cellulare dipendente dalla dose. Sorprendentemente, nessuna radio pericolosivengono utilizzati prodotti chimici. Il WCA qui presentato è stato testato con linfoma, leucemia, e le linee cellulari di tumori solidi. Pertanto, WCA permette ai ricercatori di valutare l&#39;efficacia dei farmaci in una grande rilevanza ex vivo condizione.

Anti-CD20 anticorpi e cellule di linfoma (cellule Raji e MC / CAR) sono stati scelti come sistema modello per dimostrare tutto il test di citotossicità sangue (WCA) 7,8. Cellule Raji aveva elevato numero di copie di CD20 sulla superficie cellulare, mentre le cellule MC / auto era basso numero di copie di CD20 sulla loro membrana. Cellule bersaglio sono stati colorati con coloranti di fluorescenza verde citosoliche verde e disposte sulla piastra a 96 pozzetti. 10.000 - 50.000 cellule di linfoma bersaglio sono ...

L&#39;intero test di citotossicità sangue (WCA) è un test di citotossicità sviluppato incorporando high-throughput tecnologia di posizionamento delle cellule con un microscopio a fluorescenza e l&#39;elaborazione automatizzata delle immagini. Qui, descriviamo come cellule di linfoma trattati con un anticorpo anti-CD20 possono essere analizzati in tempo reale nel sangue intero umano per fornire un&#39;analisi quantitativa citotossicità cellulare.

In tempo reale citotossicità saggi in Human Sangue intero

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Lo scopo di questa procedura è misurare la citotossicità delle cellule tumorali bersaglio nel sangue intero umano con risoluzione di una singola cellula In primo luogo, viene generato un array di singole cellule tumorali bersaglio. Il sangue intero umano viene aggiunto all'array cellulare e vengono applicati farmaci come gli anticorpi. Le cellule vengono quindi incubate con un colorante di vitalità cellulare, come il propidio, lo ioduro, e l'imaging ad alto rendimento viene utilizzato per misurare il numero di cellule tumorali bersaglio morte colorate di rosso, fornendo in ultima analisi l'efficacia della citotossicità del farmaco.Il vantaggio principale di questa tecnologia rispetto ai metodi esistenti, come il test LDH e cromo, è che l'uccisione delle cellule tumorali può essere eseguita nel sangue intero umano con capacità di imaging. Questo metodo può valutare la citotossicità degli anticorpi in vitro prima dello studio sugli animali Inizia ottenendo l'attacco cellulare 96. Kit di piastre a pozzetti o vetrini a camera a otto pozzetti a cella singola qui, verrà utilizzata la piastra a 96 pozzetti.Applicare 1,2 microlitri di attivatore sulla provetta contenente il reagente DNA de

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Il saggio di rilascio di cromo, un test comune per rilevare l'attività delle cellule T citotossiche, ha diversi limiti. Utilizzando cellule T CD8 antigene-specifici e la linea tumorale umano cancro al seno, SKBR3, nel presente articolo, un approccio basato impedenza è stata esaminata per la capacità di rilevare uccisione delle cellule.

Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence

Questo video dimostra un metodo per monitorare l'attività delle cellule T CAR contro le cellule tumorali attraverso misurazioni dell'impedenza elettrica in tempo reale. Il monitoraggio dei cambiamenti nell'impedenza valuta l'efficacia delle cellule CAR T nell'indurre la citolisi delle cellule tumorali, fornendo informazioni sulle loro capacità citotossiche.

Un test di citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule CAR T

Descriviamo una singola cellula saggio ad alta prestazione per misurare la citotossicità delle cellule T quando incubati con cellule tumorali bersaglio. Questo metodo impiega una densa matrice elastomerica di sub-nanolitri pozzetti (~ 100.000 pozzetti / matrice) per confinare spazialmente le cellule T e le cellule bersaglio con rapporti definiti ed è accoppiato al microscopio a fluorescenza per monitorare effettore-bersaglio coniugazione e apoptosi successiva.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Questo protocollo descrive un sensibile test di citotossicità basato su cellule. Enumerando la diminuzione della frequenza delle cellule T CD4+ bersaglio vive in presenza di un numero crescente di cellule T CD8+ effettrici, questo test consente la valutazione diretta dell'attività citolitica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.

Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

Questo lavoro descrive un flusso di lavoro avanzato per la determinazione accurata e rapida della conta delle cellule NK (Natural Killer) e della citotossicità delle cellule NK in campioni di sangue umano.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Descriviamo un sistema quantitativo di analisi della citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico che prendono di mira le cellule tumorali liquide e solide. Questo protocollo può essere esteso per valutare altre cellule echeggiatrici immunitarie, così come i trattamenti combinati.

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Il protocollo descrive un saggio rapido, ad alta produttività, affidabile, economico e imparziale per determinare in modo efficiente la vitalità cellulare. Questo saggio è particolarmente utile quando i mitocondri delle cellule sono stati danneggiati, il che interferisce con altri saggi. Il saggio utilizza il conteggio automatizzato delle celle macchiate con due coloranti nucleari: Hoechst 33342 e propidium ioduro.

Un saggio di colorazione nucleare differenziale automatizzato per una determinazione accurata della citotossicità mitocana

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Saggio su sangue intero con doppia co-stimolazione per l'analisi antigene-specifica dell'immunità dell'ospite a patogeni fungini e virali

Qui, descriviamo un metodo per creare goccioline a doppia emulsione che incapsulano una cellula T e una cellula bersaglio del cancro per esaminare l'uccisione cellulare a livello di singola cellula. Questo metodo consente la doppia quantificazione sia delle molecole citotossiche che dell'apoptosi delle cellule bersaglio all'interno di un'ampia popolazione di cellule T.

Saggio di citotossicità basato su goccioline per valutare le cellule T del recettore dell'antigene chimerico a livello di singola cellula

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro in vitro standardizzato per la misurazione coerente della citotossicità naturale, mediata dai recettori degli antigeni chimerici e dipendente dagli anticorpi delle cellule naturali umane, utilizzando imaging a cellule vive e citometria di flusso.

Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Scopri come misurare la citotossicità di cellule tumorali target in sangue intero umano con risoluzione a singola cellula. Questo metodo combina imaging ad alta velocità con analisi quantitativa per valutare l'efficacia di anticorpi terapeutici in tempo reale.

In tempo reale citotossicità saggi in Human Sangue intero

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