RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare i livelli di espressione di tutti i geni e campioni di midollo spinale embrionale di pollo elettroporato. Ciò si ottiene prima in ovo, esaminando il lato destro dei tubi neurali embrionali precoci e riincubando gli embrioni allo stadio desiderato. Il secondo passo della procedura consiste nel sezionare le metà del tubo neurale trasfettate con successo in un ambiente privo di RNA e procedere alla lisi il più rapidamente possibile.

Il terzo passo consiste nell'isolare l'RNA e sottoporre i campioni alla preparazione della libreria e al sequenziamento ad alto rendimento. Il passaggio finale consiste nell'elaborare i set di dati per rimuovere gli artefatti di sequenziamento. Mappare le nidificazioni sul genoma e assegnare livelli di espressione a ciascun gene.

In definitiva, i risultati possono mostrare geni differenzialmente espressi attraverso il confronto dei livelli di espressione in condizioni di controllo e sperimentali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale come dissezione del tubo neuronale. I passaggi sono difficili da imparare perché è necessaria familiarità con la manipolazione degli embrioni.

Per questa dimostrazione, gli embrioni sono stati trasformati con il costrutto che esprime GFP nel tubo neurale. Preparati a passare due ore a lavorare su un massimo di 10 embrioni per raccogliere uno o due microgrammi di RNA totale per embrione. In condizioni libere di RNA, raccogliere gli embrioni utilizzando forbici da dissezione fine e un cucchiaio di raccolta SVE trasferire ogni embrione a freddo.

DEPC trattato. PBS ha utilizzato una soluzione per tutte le fasi di isolamento del tubo neurale che procedono utilizzando una pinzetta sottile per rimuovere l'intera regione del fianco di un embrione tra le gemme dell'arto. Sposta questa sezione su una soluzione fredda fresca con il tessuto rivolto verso l'alto.

Utilizzare due aghi di vetro sottili per perforare tre punti su ciascun lato laterale dorsale dell'embrione tra il tubo neurale e il mesoderma pariale. Ora introduci i due aghi di vetro nella perforazione centrale e allontanali lungo l'asse AP. Fallo attraverso ogni perforazione secondo necessità per staccare infine il mesoderma parale, rimuovere e scartare questo tessuto.

Quindi, gira l'embrione lateralmente e introduci le punte di due pinzette tra il tubo neurale e il cordone nodale. Separali lungo l'asse AP per dividere le strutture. Termina di rimuovere pezzi più grandi di tessuto meder dal tubo neurale fissandolo delicatamente con una pinzetta mentre rimuovi il mesoderma in eccesso.

Quindi trasferire delicatamente il tubo neurale in una soluzione fresca e fredda. Utilizzando una pipetta di vetro con una pompa manuale, raccogliere tutti i tubi neurali necessari e tenerli in ghiaccio prima di procedere. Ora, dividi ciascuno dei tubi neurali in due metà.

Inserisci una pinzetta a punta affilata nel lume e strappa la piastra del tetto. Quindi usa le pinzette per tagliare la piastra del pavimento e dividere il fazzoletto a metà. Utilizzando un microscopio da dissezione a fluorescenza, separare le metà elettroporate da quelle non elettroporate.

Trasferire le metà del tubo neurale ordinate in una provetta da 1,5 millilitri con soluzione fresca. Muovi questi tubi per far scendere tutto il tessuto sul fondo. Quindi, fai girare i tubi a 100 GS per alcuni secondi.

Quindi, con molta attenzione sotto una luce intensa, aspirare lo snat. Se il tessuto è aspirato, espellerlo lentamente e ripetere la rotazione. Una volta che le metà del tubo neurale sono state ripulite dalla soluzione, aggiungere 70 microlitri per tubo neurale, metà del tampone di lisi al tubo.

Agitare la provetta e incubarla a temperatura ambiente per 15 minuti ogni cinque minuti, agitare energicamente la provetta e procedere con la raccolta dell'RNA per purificare l'RNA Per il sequenziamento, avere almeno otto metà del tubo neurale per campione. Altre collezioni di tubi neurali del liceo conservati a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius possono essere raggruppate nella collezione. Inizia scongelandoli con ghiaccio per 15-30 minuti, quindi completa lo scongelamento a temperatura ambiente.

Una volta scongelati, agitare energicamente tutti i campioni e lasciarli riposare per cinque minuti. Quindi agitare nuovamente i campioni e centrifugarli a 15.000 GS per un minuto. Per eliminare il materiale insolubile, trasferire il surnatante in un nuovo tubo e procedere con l'estrazione.

Utilizzando un kit di isolamento dell'RNA, completare il processo eludendo l'RNA alla massima concentrazione possibile. Questo protocollo richiede un account del sito Web Galaxy per garantire la quota di spazio necessaria. Innanzitutto, carica i file FASTQ tramite FTP sul sito, a meno che i punteggi di qualità non siano già codificati in Shred plus 33.

Innanzitutto, preparare i set di dati caricati utilizzando lo strumento di selezione FASTQ nel menu NGS QC e manipolazione. In caso contrario, in attributi, modificare il tipo di file in Mittente FASTQ. Successivamente, nel menu NGS QC e manipolazione, utilizzare lo strumento FAST QC per analizzare la qualità generale dei set di dati.

Selezionare il trimmer di qualità FASTQ nello stesso menu per scartare le tre estremità prime di bassa qualità. Deve essere elaborato un punteggio di qualità pari o superiore a 20. Ora vai allo strumento clip nello stesso menu.

Impostare questo strumento per scartare le letture con meno di 45 coppie di basi. Immettere la sequenza dell'adattatore. Disabilita l'opzione per eliminare le letture con basi sconosciute e scegli l'output per includere sequenze ritagliate e non ritagliate.

Procedi con lo strumento delle sequenze di ritaglio. Usalo per tagliare le prime basi della lettura per rimuovere la distorsione della sequenza a cinque numeri primi rilevata da FAST qc. Il prossimo passo è scaricare e decomprimere l'ultimo assemblaggio del genoma del pollo dal sito del genoma Illumina I.

Quindi carica l'intero file in formato più veloce del genoma e il file in formato GTF di annotazione del gene nella Cronologia delle Galassie. Ora mappa le letture per ogni campione sul genoma accedendo al menu di analisi N-G-S-R-N-A e selezionando lo strumento top hat two. Seleziona il file fasta caricato dalla Cronologia galattica come genoma di riferimento.

Quindi, scegli lo strumento gemelli nello stesso menu per creare un trascrittoma previsto. Per ogni campione, scegliere il file GTF da utilizzare come guida per le annotazioni di riferimento. Selezionare Esegui correzione distorsione utilizzando il file FASTA per i dati della sequenza e abilitare l'opzione Usa correzione lettura multipla.

Quindi unisci tutti i trascrittomi di assemblaggio utilizzando lo strumento di unione del bracciale. Con questo strumento, scegli il file GTF per l'annotazione di riferimento e il file FASTA per i dati della sequenza. Ora confronta i file BAM generati da top hat due per ogni campione utilizzando lo strumento TIFF del bracciale sempre nel menu di analisi dell'RNA.

Nel campo trascrizioni, selezionare il trascrittoma di unione generato dall'unione dei bracciali e abilitare le opzioni. Utilizzare la lettura multipla corretta ed eseguire la correzione della distorsione utilizzando il file FASTA per i dati della sequenza. Il passaggio successivo consiste nell'ordinare le tabelle differenziali Utilizzando la colonna del valore Q, selezionare lo strumento di ordinamento dal menu di filtro e ordinamento.

Le sequenze con differenze significative tra le condizioni sperimentali avranno i valori di Q più bassi sulla colonna 13. Ora dai un'occhiata ai grafici di copertura. Innanzitutto, convertire i file BAM in file grafici bed utilizzando lo strumento di conversione nel menu strumenti bed sotto le opzioni, disabilitare la segnalazione delle regioni senza copertura e scegliere di trattare le voci giuntate come intervalli distinti.

Ridimensionare anche la copertura in base a un fattore che normalizza tutte le coperture nell'esperimento. Quindi converti il file del grafico del letto risultante nel formato della parrucca grande utilizzando lo strumento nel menu di conversione dei formati e carica il file della parrucca grande come traccia personalizzata sul server UCSE. Sulla pagina del browser del genoma USCS, utilizzare l'assemblaggio GAL four e le ricerche geniche per la copertura visiva dei set di dati utilizzando i metodi descritti in cui sono stati raccolti tubi neurali che esprimono vettori PS vuoti per il loro RNA.

Questo è stato fatto in duplicato e l'RNA risultante era di qualità molto alta con un valore RIN ottimale di 10 come previsto. Il confronto globale dei trascrittomi dei controlli a vettore vuoto duplicati non ha mostrato differenze evidenti e il coefficiente di correlazione di Pearson era di 99 punti. Inoltre, c'è stato un chiaro aumento del numero di reads mappate sulla sequenza genica scratch two in un campione sperimentale che esprime i domini scratch two zinc finger.

Pertanto, i metodi erano abbastanza sensibili da rilevare l'arricchimento previsto. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di isolare il tubo neuronale embrionale e avere una buona comprensione di come elaborare e confrontare il set di dati IC per trovare geni espressi in modo differenziale seguendo i passaggi dell'analisi del silicio nella sezione quattro del protocollo.