Name: RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri l'analisi RNA-Seq dell'espressione genica differenziale nel midollo spinale di embrioni di pollo elettroporati. Questo metodo consente di valutare i livelli di espressione genica con alta sensibilità.

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CYIY è supportato da FAPESP (2012/14421-5) e FMV è supportato da una borsa di studio di FAPESP (2009/53695-0). Ringraziamo il DNA Technologies Core dell'Università della California, Davis per la preparazione e il sequenziamento delle librerie di RNA-Seq utilizzate in questo lavoro, il team Galaxy per aver fornito un'interfaccia eccellente e gratuita per gli strumenti di analisi dei dati di sequenziamento ad alto rendimento e la dottoressa Marianne Bronner per averci permesso di filmare nel suo laboratorio.

1. elettroporazione il costrutto di interesse nei tubi neurali della HH12-13 pollo embrioni in ovo Utilizzare un reporter fluorescente, preferibilmente in una trascrizione bicistronico o fuso con la proteina di interesse con una intercalando 2a virale peptide 11, per consentire una rapida identificazione di individui con livelli soddisfacenti di trasfezione. NOTA: il tempo di incubazione tipico per questa fase è di circa 48 ore a 37,8 ° C. <ol><li> Aprire una piccola finestra nelle uova dopo la rimozione di 3 ml di albumina con una siringa accoppiato ad un 18 G x 1 1/2 ago. Per migliorare la visualizzazione dell&#39;embrione, iniettare una piccola quantità di inchiostro di china diluito 1:50 con soluzione sterile di Ringer sotto l&#39;embrione 1-4. </li><li> Dopo che copre l&#39;embrione con soluzione sterile di Ringer, iniezione di una soluzione 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 e 0,1% colorante alimentare (F, D &amp; C) contenente 2,5 mg / mL di DNA attraverso l&#39;estremità posteriore del tubo neurale fino a riempirefino alla regione romboencefalo. Per l&#39;elettroporazione, elettrodi di platino posizione (0,5 mm di diametro) separati di 4 mm 1 lungo la regione del fianco e consegnare 5 impulsi di 50 msec e 20 V con un intervallo di 100 msec tra loro 4. </li><li> Dopo l&#39;elettroporazione, incubare gli embrioni manipolati per 48 ore di più, fino a raggiungere fase HH23 e identificare persone fisiche che presentano elevato livello di trasfezione in corrispondenza della regione del fianco allo stereomicroscopio a fluorescenza. NOTA: La durata dell&#39;incubazione dopo elettroporazione dipende dalla scopo dell&#39;esperimento. I plasmidi elettroporate in grado di generare significativi livelli di espressione dopo 2 ore 2. Pertanto, se l&#39;interesse risiede nei geni insorgenza precoce del periodo di incubazione post-elettroporazione può essere ridotto. </li></ol> 2. Harvest trasfettate con successo embrioni e sezionare il Metà midollo spinale elettroporate NOTA: Questa procedura dura 2-3 ore per ogni 10 embrioni e rese 1-2 Mg di RNA totale per ogni embrione. La dissezione dei tubi neurali richiede movimenti fini e alcune sessioni di prove potrebbe essere necessario prima di applicarlo ai campioni sperimentali. <ol><li> Decontaminare strumenti di dissezione metalliche con soluzione RNase decontaminazione o di cottura a 150 ° C per 4 ore 12 e preparare DEPC trattati con PBS. Utilizzare solo nuovo plasticware RNasi-free certificata. NOTA: Dopo la raccolta, è importante seguire le cure standard per prevenire la contaminazione RNasi durante la dissezione. </li><li> Raccogliere gli embrioni con un paio di belle forbici dissezione e un cucchiaio di raccolta setacciato. Mantenere gli embrioni a freddo DEPC trattati con PBS in una capsula di Petri a 100 mm. </li><li> Con un paio di pinzette sottili, tagliare l&#39;intera regione del fianco (tra il limite posteriore della gemma dell&#39;arto anteriore e il limite anteriore del germoglio posteriore dell&#39;arto) e trasferire questa sezione in un piatto contenente freddo DEPC trattati con PBS. </li><li> Usare due aghi di vetro sottili di perforare a tre diversipunti su ogni lato dorsolaterale dell&#39;embrione tra il tubo neurale e il mesoderma parassiale. </li><li> Introdurre i due aghi di vetro nella foratura centrale e lentamente spostare uno di loro via lungo il tubo asse anteriore-posteriore neurale. Ripetere questa operazione per le perforazioni che non sono stati realizzati dai primi movimenti. Rimuovere il mesoderma parassiale indipendente con un paio di pinzette sottili. </li><li> Ruotare l&#39;embrione lateralmente, inserire le punte delle pinzette tra il tubo neurale e la notocorda e farli scorrere in direzioni opposte lungo l&#39;asse anteriore-posteriore per separare le due strutture. NOTA: Questo dovrebbe rimuovere la maggior parte del mesoderma ancora attaccato al tubo neurale. </li><li> Se necessario, rimuovere tutti i pezzi più grandi di tessuto mesodermica che rimangono attaccate tirando con un paio di pinzette, mentre con delicatezza il tubo neurale con un altro paio di pinzette. Al termine, trasferire delicatamente il tubo neurale ad un altro piatto contenente freddo DEPC trattati con PBS usando unaRNasi-free Pasteur pipetta di vetro accoppiato ad una pompa manuale pipetta e tenere in ghiaccio fino a quando tutti i tubi sono sezionati. </li><li> Dividere i tubi neurali in due metà. Per questo, inserire la punta affilata di un paio di pinzette chiuso nel lume e aprire la piastra di copertura spostando le pinzette attraverso esso. Dopo questo, separare le metà tagliando la piastra con le punte pinzette. </li><li> Ordina elettroporate da metà non elettroporate in un ambito dissezione fluorescenti e trasferire in una provetta da 1,5 ml riempito di ghiaccio freddo DEPC trattati con PBS. Se necessario, sfiora i microtubi delicatamente per rilasciare qualsiasi tessuto attaccato alle pareti di plastica e di promuovere sedimentazione dei tubi. </li><li> Spin a 100 xg per 3 secondi e rimuovere molto lentamente fino PBS possibile con un 1 ml micropipetta. Fate questo mentre guardando una fonte di luce che brilla attraverso la provetta per controllare se il materiale embrionale viene aspirato per la punta della pipetta; se questo accade, scarica lentamente e ripetere la centrifugazione. </li><li> Aggiungere 70 ml di soluzione di lisi per l&#39;estrazione dell&#39;RNA per la metà del tubo neurale e sfogliare la provetta per mescolare il contenuto. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e mescolare vigorosamente nel vortex. Ripetere il 5 min di incubazione e vortex altre due volte. Conservare a -80 ° C. </li><li> Raccogliere almeno otto metà del tubo neurale per campione per assicurare un rendimento adeguato per il passaggio successivo. Pool campioni più piccoli se diverse sessioni di elettroporazione / dissezione sono tenuti ad accumulare sufficiente numero di tubi neurali. Conservare i campioni sufficienti per duplicati o triplicati per ogni condizione. </li></ol> 3. Purificare RNA e preparare librerie per Illumina Sequencing <ol><li> Rimuovere i campioni da -80 ° C stoccaggio e disporli sul ghiaccio per 15-30 min. Riprendiamo scongelamento a temperatura ambiente fino a completa. </li><li> Vortex bene e lasciato a temperatura ambiente per 5 min. Nuovo Vortex e centrifugare a 15000 xg per 1 min a pellet materiale insolubile. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provettae procedere con l&#39;estrazione di RNA in base al totale isolamento di RNA istruzioni del manuale kit. Eluire nel volume minimo raccomandato per aumentare la concentrazione. NOTA: il trattamento DNasi dopo pulizia è consigliato al fine di evitare la potenziale contaminazione delle sequenze di DNA genomico in set di dati di RNA-Seq. </li><li> Flick la provetta per mescolare il contenuto e rimuovere 5 ml per l&#39;analisi di controllo della qualità. Conservare il campione restante a -80 ° C fino preparato libreria; questi campioni devono essere scongelati solo una volta per evitare la degradazione dell&#39;RNA. </li><li> Eseguire RNA purificato in uno strumento Bioanalyzer utilizzando il kit di RNA 6000 Nano; Valore RIN deve essere almeno superiore a 7 per procedere. </li><li> Generare le librerie utilizzando un kit di preparazione biblioteca RNA-Seq compatibile Illumina e multiplex fino a 4 librerie in una corsia di uno strumento HiSeq set di generare 100 bp singola legge. Se possibile, includere tutti i campioni nella stessa seduta di ridurre al minimo i potenziali artefatti tecnici. NOTA: Questo dovrebbe produrre fino a 50 milioni di reads per campione, che è più che sufficiente per ottenere la copertura per la maggior parte dei geni 13. </li></ol> 4. Confrontare i set di dati di RNA-Seq nel server Galaxy pubblici 10. NOTA: lo spazio di archiviazione del server è limitato e sperimentazioni a confronto molti campioni può richiedere la cancellazione dei file intermedi generati nelle fasi di filtraggio. <ol><li> Creare un account utente nel server pubblico Galaxy ( <a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ) e FTP caricare i dataset Illumina in formato FASTQ. </li><li> Preparare i file caricati con lo strumento FastqGroomer 14 sotto la NGS: menu di controllo di qualità e la manipolazione; se i punteggi di qualità sono già codificati in Phred + 33 (Sanger), saltare questo passaggio semplicemente cambiando il tipo di file fastqsanger sotto gli attributi per ciascun set di dati. </li><li> Analizzare la qualità generale di ogni set di dati utilizzando lo strumento FastQC sotto la NGS: QC e manipolazione menu. NOTA: Particolare attenzione dovrebbe essere data alla grafica che ne derivano per il contenuto sequenza per sequenza qualità di base e per la base, in quanto questi forniranno stime per i parametri utilizzati per tagliare le estremità della legge. </li><li> Trim legge di scartare 3 &#39;si conclude con i dati di bassa qualità con lo strumento FASTQ Qualità Trimmer 14 sotto la NGS: menu di controllo di qualità e la manipolazione. Impostare lo strumento per elaborare solo 3 &#39;finisce per punteggio di qualità inferiore a 20. </li><li> Rimuovere sequenze adattatore dalla legge utilizzando lo strumento Clip ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) sotto la NGS: menu di controllo di qualità e la manipolazione. Impostare lo strumento di scartare legge con meno di 45 bp a sinistra, la sequenza di ingresso della scheda utilizzata e scegliere l&#39;uscita di includere entrambe le sequenze tagliate e non tagliate. Inoltre, scegliere di non eliminare sequenze con basi sconosciute in quanto la maggior parte delle basi di bassa qualità sono stati già rimossi nell&#39;ultimo passaggio. </li&gt; <li> Utilizzando lo strumento sequenze Trim ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) sotto la NGS: QC e il menu di manipolazione, tagliare le prime basi della legge per rimuovere 5 &#39;pregiudizi sequenza rilevato dal FastQC (in genere 10). NOTA: A questo punto, è una buona idea per eseguire nuovamente FastQC e confrontare con l&#39;analisi precedente per determinare se la qualità del set di dati è stata migliorata. </li><li> Scaricare e scompattare l&#39;ultima assemblea del genoma del pollo per il genoma del browser UCSC da Illumina iGenomes ( <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ) e caricare l&#39;intero file in formato FASTA genoma e il file di formato GTF geni di annotazione alla storia Galaxy utilizzando il tool Upload File nel menu Dati. </li><li> Mappa legge per ciascun campione al genoma di pollo con l&#39;allineatore TopHat2 15 sottole NGS: menu Analysis RNA. Scegliere di utilizzare un genoma di Storia (selezionare il file FASTA caricato al punto 4.7). </li><li> Costruire un trascrittoma previsto per ogni campione mediante Gemelli 16 sotto i NGS: menu Analysis RNA. Scegliere di utilizzare l&#39;annotazione di riferimento come guida (selezionare il file GTF caricato al punto 4.7) e attivare le opzioni di eseguire la correzione Bias (dalla Storia, il file FASTA dal punto 4.7) e utilizzare multi-lettura corretta. </li><li> Unisci trascrittomi previsti per tutti i campioni che utilizzano Cuffmerge 16 sotto la NGS: menu di RNA analisi. Scegliere di utilizzare annotazioni di riferimento (file GTF dal punto 4.7) e dati di sequenza (dalla Storia, il file FASTA dal punto 4.7). </li><li> Confronta i file generati da BAM TopHat2 per ogni campione mediante Cuffdiff 16 sotto la NGS: menu di RNA analisi. Nelle trascrizioni di campo selezionare il metrascrittoma rged generato da Cuffmerge e attivare le opzioni di eseguire la correzione Bias (dalla Storia, il file FASTA dal punto 4.7) e utilizzare multi-lettura corretta. </li><li> Ordina espressione differenziale test tabelle numericamente ascendente nella colonna 13 (valore q) utilizzando lo strumento Dividi sotto il menu Filtro e ordinamento. NOTA: I geni / trascrizioni che mostrano espressione differenziale significativo tra le condizioni sperimentali presenterà i valori di q più bassi. </li><li> Per controllare i risultati visivamente con grafici di copertura, prima convertire i file in formato BAM bedGraph utilizzando lo strumento Crea una BedGraph di copertura del genoma 17 nel menu BEDTools. Disattivare la segnalazione delle regioni senza copertura, scegliere di trattare le voci giuntati come intervalli distinti e scalare la copertura di un fattore che normalizza la profondità sequenza per tutti i set di dati a confronto. </li><li> Convertire il file bedGraph risultante in formato pezzo grosso con ilstrumento parrucca / BedGraph-per-pezzo da novanta ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) sotto il menu Formati Converti. Caricare i file pezzo grosso come tracce personalizzati nel browser genoma UCSC ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) per il montaggio galGal4 e cercare un gene di interesse per visualizzare la copertura dei set di dati. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui forniamo linee guida per l&#39;analisi degli effetti dopo l&#39;elettroporazione del pollo midollo spinale. Anche se l&#39;elettroporazione di vettori di DNA viene più spesso utilizzato per iperespressione di un gene di interesse, si può anche usare costrutti codificanti dominanti negativi, proteine ​​quimeric o precursori per siRNA per generare condizioni di funzione del gene knock-down 19-21. In realtà, il confronto dei profili trascrittoma derivanti sia da GAIN- e analisi di perdita-di-funzione può not...

Gli studi genetici sugli organismi viventi utilizzano spesso l&#39;embrione di pollo come modello perché in elettroporazione ovo rappresenta un modo veloce ed economico per transfettare parzialmente strutture embrionali in vivo con il DNA costruisce 1-5. Vettori di espressione bicistronico che codificano una trascrizione contenente un reporter fluorescente insieme con il gene di interesse, quali pCIG 6 o pMES 7, consentono un rapido controllo di qualità trasfezione regione specifica allo stereomicroscopio prima di elaborare embrioni per l&#39;analisi a valle. Con i recenti progressi nel sequenziamento del DNA, è ora possibile ottenere interi profili di espressione del trascrittoma digitali da campioni di RNA utilizzando RNA-Seq 8,9. Pertanto, invece di metodi richiede tempo che consentono l&#39;analisi di pochi prodotti genici in parallelo, come ibridazione in situ, immunoistochimica e qPCR, preparazione di librerie di cDNA perhigh-throughput sequencing in grado di fornire le informazioni di tutto il trascrittoma. L&#39;osservazione degli effetti sperimentali sui livelli di espressione di ogni singolo gene può a sua volta fornire potenti approfondimenti sui percorsi alterati dal costrutto utilizzato. Ciò è particolarmente facile se un gruppo genomico per l&#39;organismo utilizzato è disponibile, pertanto l&#39;embrione pulcino è ancora un modello adatto. Se l&#39;utente ha accesso ad un affidabile centro di sequenziamento del genoma, il problema principale è l&#39;ottenimento di campioni di RNA di alta qualità. Questo lavoro illustra un metodo per ottenere campioni di RNA da tubi neurali transfettate idonee per l&#39;RNA-Seq, nonché le fasi a valle per analisi in silico delle serie di dati risultanti. Dopo l&#39;elettroporazione in HH12-13 seguito da 48 ore di incubazione, tronco transfettate metà del midollo spinale sono stati sezionati in condizioni di assenza di ribonucleasi, immediatamente lisate e ulteriormente protetto dalla degradazione da ultra-low di congelamento fino purificazione dell&#39;RNA e la biblioteca preparation. Il server pubblico Galaxy 10 fornisce l&#39;accesso alle risorse gratuite per l&#39;analisi di dati di sequenziamento high-throughput. La quantità di spazio offerto agli utenti registrati è sufficiente per piccoli esperimenti, eliminando così la necessità di infrastrutture computazionale locale. Analisi dei dati di RNA-Seq include il filtraggio, l&#39;allineamento e la quantificazione / confronto dell&#39;espressione genica. Anche se ci sono linee guida generali per l&#39;analisi dei dati di RNA-Seq, parametri di filtraggio dipenderà in larga misura la qualità della sequenza e devono essere determinate dopo l&#39;analisi di controllo della qualità dei dati grezzi. Questo protocollo descrive la procedura per ottenere e confrontare i profili di RNA-Seq da pollo embrionale midollo spinale trasfettate in vivo. Di conseguenza rappresentante, confronto di set di dati provenienti da due campioni di controllo indipendenti transfettate con un vettore vuoto ha mostrato che il metodo è riproducibile e dovrebbe permettere di identificare expres differenzialmentetrascrizioni sed in campioni sperimentali. Pertanto, l&#39;applicazione di questo metodo ha il potenziale di aumentare notevolmente il numero di scoperte dopo un solo esperimento e fornire così una grande quantità di dati per successive indagini.

<table><tbody><tr><td>Inchiostro di china</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 ago</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 3 ml</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>F D & C Blu 1</td><td>Spectra Colors Corporation</td><td>5.FC.0010P0</td><td>Colorante alimentare utilizzato per visualizzare l'iniezione</td></tr><tr><td>di DNA Soluzione di Ringer (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 7,2 g di NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,37 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,225 g di CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,217 g Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,02 g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O a 800 ml e regolazione del pH a 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O a 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Filtro e autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Soluzione tamponata con fosfato) (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 8 g di NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,2 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1,15 g Na2HPO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,2 g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O a 800 ml e regolazione del pH a 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O a 1 L e filtro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1 ml di DEPC (dietilpirocarbonato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Agitare energicamente e lasciare riposare per una notte a temperatura</td><td></td><td></td><td></td> ambiente</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cucchiaio setacciato</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 60 x 15 mm piastre di Petri in polistirene</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di decontaminazione RNaseZap RNasi</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche a punta fine</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette a punta fine dritte</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago di vetro tirato realizzato con tubi capillari di vetro da 1,1 x 75 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>40A502</td><td></td></tr><tr><td>9 '' pipetta di vetro Pasteur</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa per pipetta manuale</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trasparente 1,5 ml microcentrifuga provette in polipropilene</td><td>Corning Life Sciences</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione RNAlater per la stabilizzazione dell'RNA</td><td>Life Technologies</td><td>Kit di isolamento dell'RNA totale acquoso AM7020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>AM1912</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo per biologia molecolare</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>2100 Elettroforesi Strumento bioanalizzatore</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Kit di preparazione del campione di RNA Truseq v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001/RS-122-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-seq analisi di espressione genica differenziale in elettroporate chick embrionali del midollo spinale

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo l'elettroporazione del tubo neurale del pulcino è un metodo veloce ed economico per l'identificazione della funzione genica durante lo sviluppo neurale. L'analisi dell'intero genoma di trascritti differenzialmente espressi dopo una tale manipolazione sperimentale ha il potenziale per scoprire un quadro quasi completo degli effetti a valle causati dal costrutto trasfettato. Questo lavoro descrive un metodo semplice per confrontare i trascrittomi da campioni di midollo spinale embrionale trasfettato che comprende tutti i passaggi tra l'elettroporazione e l'identificazione dei trascritti differenzialmente espressi. La prima fase consiste nelle linee guida per l'elettroporazione e nelle istruzioni per la dissezione delle metà del midollo spinale trasfettate da embrioni HH23 in ambiente privo di ribonucleasi e nell'estrazione di campioni di RNA di alta qualità adatti al sequenziamento del trascrittoma. La fase successiva è quella dell'analisi bioinformatica con linee guida generali per il filtraggio e il confronto dei set di dati RNA-Seq nel server pubblico Galaxy, che elimina la necessità di una struttura computazionale locale per esperimenti su piccola e media scala. I risultati rappresentativi mostrano che i metodi di dissezione generano campioni di RNA di alta qualità e che i trascrittomi ottenuti da due campioni di controllo sono essenzialmente gli stessi, un requisito importante per la rilevazione di geni di espressione differenziale in campioni sperimentali. Inoltre, viene fornito un esempio in cui la sovraespressione sperimentale di un costrutto di DNA può essere verificata visivamente dopo il confronto con campioni di controllo. L'applicazione di questo metodo può essere un potente strumento per facilitare nuove scoperte sulla funzione dei fattori neurali coinvolti nello sviluppo precoce del midollo spinale.

Per convalidare il metodo descritto, due campioni di controllo sono stati generati da embrioni elettroporate con i pMES vuoto vettore 7 e un campione da embrioni trasfettate con lo stesso vettore contenente l'inserto costruire SCRT2-ZNF, che codifica i domini zinc-finger di pollo SCRT2 18. I campioni che producono 11-22 mg di RNA totale sono stati ottenuti da ciascun pool di 8 a 12 embrioni. Tutti e tre i campioni ottenuto un valore ottimale RIN 10 a un controllo di qualità eseguito con lo strument...

Questo video mostra i passaggi di base per eseguire l'analisi dell'intero trascrittoma su campioni di midollo spinale embrionale di pollo sezionati dopo la trasfezione con elettroporazione in ovo.

RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare i livelli di espressione di tutti i geni e campioni di midollo spinale embrionale di pollo elettroporato. Ciò si ottiene prima in ovo, esaminando il lato destro dei tubi neurali embrionali precoci e riincubando gli embrioni allo stadio desiderato. Il secondo passo della procedura consiste nel sezionare le metà del tubo neurale trasfettate con successo in un ambiente privo di RNA e procedere alla lisi il più rapidamente possibile.Il terzo passo consiste nell'isolare l'RNA e sottoporre i campioni alla preparazione della libreria e al sequenziamento ad alto rendimento. Il passaggio finale consiste nell'elaborare i set di dati per rimuovere gli artefatti di sequenziamento. Mappare le nidificazioni sul genoma e assegnare livelli di espressione a ciascun gene.In definitiva, i risultati possono mostrare geni differenzialmente espressi attraverso il confronto dei livelli di espressione in condizioni di controllo e sperimentali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale come dissezione del tubo neuronale. I passaggi sono difficili da imparare perché è necessaria familiarità con la manipolazione degli embrioni.Per questa dimos

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Questo video viene illustrato come visualizzare i percorsi assonale di gruppi geneticamente definita di neuroni nel midollo spinale embrionale pulcino...

Decifrare Percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale Chick Utilizzando In ovo Elettroporazione

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Per valutare la funzione e la regolazione dei geni durante lo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalo, si descrive un metodo che...

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Un metodo di espressione genica nel tubo neurale può essere downregulated in una cella di tipo-specifico, tracciabile modo descritto. Noi dimostrare...

In elettroporazione ovo di miRNA-based plasmidi nel tubo neurale sviluppo e valutazione di fenotipi da Injection DiI in Open-book Preparazioni

Come le reti neuronali sono stabiliti nel cervello embrionale è una questione fondamentale nella neurobiologia dello sviluppo. Qui abbiamo combinato una tecnica di elettroporazione con nuovi strumenti genetici, come ad esempio Cre / Lox-plasmidi e PiggyBac-mediata sistema trasposizione del DNA nel romboencefalo aviaria di etichettare interneuroni dorsali e monitorare le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche a vari stadi di sviluppo.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Descriviamo una tecnica per utilizzare le cellule staminali embrionali murine per generare due o tre corpi embrionali tridimensionali. Abbiamo poi spiegato come indurre la differenziazione neuronale delle cellule del corpo embrionali di acido retinoico, e come analizzare il loro stato di differenziazione dal marcatore di cellule progenitrici immunofluorescenza e immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell'indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell'hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo.

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Qui, descriviamo un'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il protocollo di preparazione libreria ChIP-seq per generare profili epigenomic globale da campioni di embrionali di pollo di basso-abbondanza.

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Presentato qui è un protocollo per eseguire il knock-out genico limitato nel tempo e nello spazio nei midollo spinale axolotl iniettando il complesso CAS9-gRNA nel canale centrale del midollo spinale seguito dall'elettroporazione.

Knock-out gene diretto delle cellule staminali neurali del midollo spinale ad axolotl tramite elettroporazione dei complessi CAS9 Protein-gRNA

Qui descriviamo una caratterizzazione proteomica basata sulla spettrometria di massa di linee cellulari con destini tissutali noti nell'embrione vertebrato di Xenopus laevis .

Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)

Scopri l'analisi RNA-Seq dell'espressione genica differenziale nel midollo spinale di embrioni di pollo elettroporati. Questo metodo consente di valutare i livelli di espressione genica con alta sensibilità.

RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

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