Name: RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri l'analisi RNA-Seq dell'espressione genica differenziale nel midollo spinale di embrioni di pollo elettroporati. Questo metodo consente di valutare i livelli di espressione genica con alta sensibilità.

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CYIY è supportato da FAPESP (2012/14421-5) e FMV è supportato da una borsa di studio di FAPESP (2009/53695-0). Ringraziamo il DNA Technologies Core dell'Università della California, Davis per la preparazione e il sequenziamento delle librerie di RNA-Seq utilizzate in questo lavoro, il team Galaxy per aver fornito un'interfaccia eccellente e gratuita per gli strumenti di analisi dei dati di sequenziamento ad alto rendimento e la dottoressa Marianne Bronner per averci permesso di filmare nel suo laboratorio.

1. elettroporazione il costrutto di interesse nei tubi neurali della HH12-13 pollo embrioni in ovo Utilizzare un reporter fluorescente, preferibilmente in una trascrizione bicistronico o fuso con la proteina di interesse con una intercalando 2a virale peptide 11, per consentire una rapida identificazione di individui con livelli soddisfacenti di trasfezione. NOTA: il tempo di incubazione tipico per questa fase è di circa 48 ore a 37,8 ° C. <ol><li> Aprire una piccola finestra nelle uova dopo la rimozione di 3 ml di albumina con una siringa accoppiato ad un 18 G x 1 1/2 ago. Per migliorare la visualizzazione dell&#39;embrione, iniettare una piccola quantità di inchiostro di china diluito 1:50 con soluzione sterile di Ringer sotto l&#39;embrione 1-4. </li><li> Dopo che copre l&#39;embrione con soluzione sterile di Ringer, iniezione di una soluzione 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 e 0,1% colorante alimentare (F, D &amp; C) contenente 2,5 mg / mL di DNA attraverso l&#39;estremità posteriore del tubo neurale fino a riempirefino alla regione romboencefalo. Per l&#39;elettroporazione, elettrodi di platino posizione (0,5 mm di diametro) separati di 4 mm 1 lungo la regione del fianco e consegnare 5 impulsi di 50 msec e 20 V con un intervallo di 100 msec tra loro 4. </li><li> Dopo l&#39;elettroporazione, incubare gli embrioni manipolati per 48 ore di più, fino a raggiungere fase HH23 e identificare persone fisiche che presentano elevato livello di trasfezione in corrispondenza della regione del fianco allo stereomicroscopio a fluorescenza. NOTA: La durata dell&#39;incubazione dopo elettroporazione dipende dalla scopo dell&#39;esperimento. I plasmidi elettroporate in grado di generare significativi livelli di espressione dopo 2 ore 2. Pertanto, se l&#39;interesse risiede nei geni insorgenza precoce del periodo di incubazione post-elettroporazione può essere ridotto. </li></ol> 2. Harvest trasfettate con successo embrioni e sezionare il Metà midollo spinale elettroporate NOTA: Questa procedura dura 2-3 ore per ogni 10 embrioni e rese 1-2 Mg di RNA totale per ogni embrione. La dissezione dei tubi neurali richiede movimenti fini e alcune sessioni di prove potrebbe essere necessario prima di applicarlo ai campioni sperimentali. <ol><li> Decontaminare strumenti di dissezione metalliche con soluzione RNase decontaminazione o di cottura a 150 ° C per 4 ore 12 e preparare DEPC trattati con PBS. Utilizzare solo nuovo plasticware RNasi-free certificata. NOTA: Dopo la raccolta, è importante seguire le cure standard per prevenire la contaminazione RNasi durante la dissezione. </li><li> Raccogliere gli embrioni con un paio di belle forbici dissezione e un cucchiaio di raccolta setacciato. Mantenere gli embrioni a freddo DEPC trattati con PBS in una capsula di Petri a 100 mm. </li><li> Con un paio di pinzette sottili, tagliare l&#39;intera regione del fianco (tra il limite posteriore della gemma dell&#39;arto anteriore e il limite anteriore del germoglio posteriore dell&#39;arto) e trasferire questa sezione in un piatto contenente freddo DEPC trattati con PBS. </li><li> Usare due aghi di vetro sottili di perforare a tre diversipunti su ogni lato dorsolaterale dell&#39;embrione tra il tubo neurale e il mesoderma parassiale. </li><li> Introdurre i due aghi di vetro nella foratura centrale e lentamente spostare uno di loro via lungo il tubo asse anteriore-posteriore neurale. Ripetere questa operazione per le perforazioni che non sono stati realizzati dai primi movimenti. Rimuovere il mesoderma parassiale indipendente con un paio di pinzette sottili. </li><li> Ruotare l&#39;embrione lateralmente, inserire le punte delle pinzette tra il tubo neurale e la notocorda e farli scorrere in direzioni opposte lungo l&#39;asse anteriore-posteriore per separare le due strutture. NOTA: Questo dovrebbe rimuovere la maggior parte del mesoderma ancora attaccato al tubo neurale. </li><li> Se necessario, rimuovere tutti i pezzi più grandi di tessuto mesodermica che rimangono attaccate tirando con un paio di pinzette, mentre con delicatezza il tubo neurale con un altro paio di pinzette. Al termine, trasferire delicatamente il tubo neurale ad un altro piatto contenente freddo DEPC trattati con PBS usando unaRNasi-free Pasteur pipetta di vetro accoppiato ad una pompa manuale pipetta e tenere in ghiaccio fino a quando tutti i tubi sono sezionati. </li><li> Dividere i tubi neurali in due metà. Per questo, inserire la punta affilata di un paio di pinzette chiuso nel lume e aprire la piastra di copertura spostando le pinzette attraverso esso. Dopo questo, separare le metà tagliando la piastra con le punte pinzette. </li><li> Ordina elettroporate da metà non elettroporate in un ambito dissezione fluorescenti e trasferire in una provetta da 1,5 ml riempito di ghiaccio freddo DEPC trattati con PBS. Se necessario, sfiora i microtubi delicatamente per rilasciare qualsiasi tessuto attaccato alle pareti di plastica e di promuovere sedimentazione dei tubi. </li><li> Spin a 100 xg per 3 secondi e rimuovere molto lentamente fino PBS possibile con un 1 ml micropipetta. Fate questo mentre guardando una fonte di luce che brilla attraverso la provetta per controllare se il materiale embrionale viene aspirato per la punta della pipetta; se questo accade, scarica lentamente e ripetere la centrifugazione. </li><li> Aggiungere 70 ml di soluzione di lisi per l&#39;estrazione dell&#39;RNA per la metà del tubo neurale e sfogliare la provetta per mescolare il contenuto. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e mescolare vigorosamente nel vortex. Ripetere il 5 min di incubazione e vortex altre due volte. Conservare a -80 ° C. </li><li> Raccogliere almeno otto metà del tubo neurale per campione per assicurare un rendimento adeguato per il passaggio successivo. Pool campioni più piccoli se diverse sessioni di elettroporazione / dissezione sono tenuti ad accumulare sufficiente numero di tubi neurali. Conservare i campioni sufficienti per duplicati o triplicati per ogni condizione. </li></ol> 3. Purificare RNA e preparare librerie per Illumina Sequencing <ol><li> Rimuovere i campioni da -80 ° C stoccaggio e disporli sul ghiaccio per 15-30 min. Riprendiamo scongelamento a temperatura ambiente fino a completa. </li><li> Vortex bene e lasciato a temperatura ambiente per 5 min. Nuovo Vortex e centrifugare a 15000 xg per 1 min a pellet materiale insolubile. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provettae procedere con l&#39;estrazione di RNA in base al totale isolamento di RNA istruzioni del manuale kit. Eluire nel volume minimo raccomandato per aumentare la concentrazione. NOTA: il trattamento DNasi dopo pulizia è consigliato al fine di evitare la potenziale contaminazione delle sequenze di DNA genomico in set di dati di RNA-Seq. </li><li> Flick la provetta per mescolare il contenuto e rimuovere 5 ml per l&#39;analisi di controllo della qualità. Conservare il campione restante a -80 ° C fino preparato libreria; questi campioni devono essere scongelati solo una volta per evitare la degradazione dell&#39;RNA. </li><li> Eseguire RNA purificato in uno strumento Bioanalyzer utilizzando il kit di RNA 6000 Nano; Valore RIN deve essere almeno superiore a 7 per procedere. </li><li> Generare le librerie utilizzando un kit di preparazione biblioteca RNA-Seq compatibile Illumina e multiplex fino a 4 librerie in una corsia di uno strumento HiSeq set di generare 100 bp singola legge. Se possibile, includere tutti i campioni nella stessa seduta di ridurre al minimo i potenziali artefatti tecnici. NOTA: Questo dovrebbe produrre fino a 50 milioni di reads per campione, che è più che sufficiente per ottenere la copertura per la maggior parte dei geni 13. </li></ol> 4. Confrontare i set di dati di RNA-Seq nel server Galaxy pubblici 10. NOTA: lo spazio di archiviazione del server è limitato e sperimentazioni a confronto molti campioni può richiedere la cancellazione dei file intermedi generati nelle fasi di filtraggio. <ol><li> Creare un account utente nel server pubblico Galaxy ( <a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ) e FTP caricare i dataset Illumina in formato FASTQ. </li><li> Preparare i file caricati con lo strumento FastqGroomer 14 sotto la NGS: menu di controllo di qualità e la manipolazione; se i punteggi di qualità sono già codificati in Phred + 33 (Sanger), saltare questo passaggio semplicemente cambiando il tipo di file fastqsanger sotto gli attributi per ciascun set di dati. </li><li> Analizzare la qualità generale di ogni set di dati utilizzando lo strumento FastQC sotto la NGS: QC e manipolazione menu. NOTA: Particolare attenzione dovrebbe essere data alla grafica che ne derivano per il contenuto sequenza per sequenza qualità di base e per la base, in quanto questi forniranno stime per i parametri utilizzati per tagliare le estremità della legge. </li><li> Trim legge di scartare 3 &#39;si conclude con i dati di bassa qualità con lo strumento FASTQ Qualità Trimmer 14 sotto la NGS: menu di controllo di qualità e la manipolazione. Impostare lo strumento per elaborare solo 3 &#39;finisce per punteggio di qualità inferiore a 20. </li><li> Rimuovere sequenze adattatore dalla legge utilizzando lo strumento Clip ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) sotto la NGS: menu di controllo di qualità e la manipolazione. Impostare lo strumento di scartare legge con meno di 45 bp a sinistra, la sequenza di ingresso della scheda utilizzata e scegliere l&#39;uscita di includere entrambe le sequenze tagliate e non tagliate. Inoltre, scegliere di non eliminare sequenze con basi sconosciute in quanto la maggior parte delle basi di bassa qualità sono stati già rimossi nell&#39;ultimo passaggio. </li&gt; <li> Utilizzando lo strumento sequenze Trim ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) sotto la NGS: QC e il menu di manipolazione, tagliare le prime basi della legge per rimuovere 5 &#39;pregiudizi sequenza rilevato dal FastQC (in genere 10). NOTA: A questo punto, è una buona idea per eseguire nuovamente FastQC e confrontare con l&#39;analisi precedente per determinare se la qualità del set di dati è stata migliorata. </li><li> Scaricare e scompattare l&#39;ultima assemblea del genoma del pollo per il genoma del browser UCSC da Illumina iGenomes ( <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ) e caricare l&#39;intero file in formato FASTA genoma e il file di formato GTF geni di annotazione alla storia Galaxy utilizzando il tool Upload File nel menu Dati. </li><li> Mappa legge per ciascun campione al genoma di pollo con l&#39;allineatore TopHat2 15 sottole NGS: menu Analysis RNA. Scegliere di utilizzare un genoma di Storia (selezionare il file FASTA caricato al punto 4.7). </li><li> Costruire un trascrittoma previsto per ogni campione mediante Gemelli 16 sotto i NGS: menu Analysis RNA. Scegliere di utilizzare l&#39;annotazione di riferimento come guida (selezionare il file GTF caricato al punto 4.7) e attivare le opzioni di eseguire la correzione Bias (dalla Storia, il file FASTA dal punto 4.7) e utilizzare multi-lettura corretta. </li><li> Unisci trascrittomi previsti per tutti i campioni che utilizzano Cuffmerge 16 sotto la NGS: menu di RNA analisi. Scegliere di utilizzare annotazioni di riferimento (file GTF dal punto 4.7) e dati di sequenza (dalla Storia, il file FASTA dal punto 4.7). </li><li> Confronta i file generati da BAM TopHat2 per ogni campione mediante Cuffdiff 16 sotto la NGS: menu di RNA analisi. Nelle trascrizioni di campo selezionare il metrascrittoma rged generato da Cuffmerge e attivare le opzioni di eseguire la correzione Bias (dalla Storia, il file FASTA dal punto 4.7) e utilizzare multi-lettura corretta. </li><li> Ordina espressione differenziale test tabelle numericamente ascendente nella colonna 13 (valore q) utilizzando lo strumento Dividi sotto il menu Filtro e ordinamento. NOTA: I geni / trascrizioni che mostrano espressione differenziale significativo tra le condizioni sperimentali presenterà i valori di q più bassi. </li><li> Per controllare i risultati visivamente con grafici di copertura, prima convertire i file in formato BAM bedGraph utilizzando lo strumento Crea una BedGraph di copertura del genoma 17 nel menu BEDTools. Disattivare la segnalazione delle regioni senza copertura, scegliere di trattare le voci giuntati come intervalli distinti e scalare la copertura di un fattore che normalizza la profondità sequenza per tutti i set di dati a confronto. </li><li> Convertire il file bedGraph risultante in formato pezzo grosso con ilstrumento parrucca / BedGraph-per-pezzo da novanta ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) sotto il menu Formati Converti. Caricare i file pezzo grosso come tracce personalizzati nel browser genoma UCSC ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) per il montaggio galGal4 e cercare un gene di interesse per visualizzare la copertura dei set di dati. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui forniamo linee guida per l&#39;analisi degli effetti dopo l&#39;elettroporazione del pollo midollo spinale. Anche se l&#39;elettroporazione di vettori di DNA viene più spesso utilizzato per iperespressione di un gene di interesse, si può anche usare costrutti codificanti dominanti negativi, proteine ​​quimeric o precursori per siRNA per generare condizioni di funzione del gene knock-down 19-21. In realtà, il confronto dei profili trascrittoma derivanti sia da GAIN- e analisi di perdita-di-funzione può not...

Gli studi genetici sugli organismi viventi utilizzano spesso l&#39;embrione di pollo come modello perché in elettroporazione ovo rappresenta un modo veloce ed economico per transfettare parzialmente strutture embrionali in vivo con il DNA costruisce 1-5. Vettori di espressione bicistronico che codificano una trascrizione contenente un reporter fluorescente insieme con il gene di interesse, quali pCIG 6 o pMES 7, consentono un rapido controllo di qualità trasfezione regione specifica allo stereomicroscopio prima di elaborare embrioni per l&#39;analisi a valle. Con i recenti progressi nel sequenziamento del DNA, è ora possibile ottenere interi profili di espressione del trascrittoma digitali da campioni di RNA utilizzando RNA-Seq 8,9. Pertanto, invece di metodi richiede tempo che consentono l&#39;analisi di pochi prodotti genici in parallelo, come ibridazione in situ, immunoistochimica e qPCR, preparazione di librerie di cDNA perhigh-throughput sequencing in grado di fornire le informazioni di tutto il trascrittoma. L&#39;osservazione degli effetti sperimentali sui livelli di espressione di ogni singolo gene può a sua volta fornire potenti approfondimenti sui percorsi alterati dal costrutto utilizzato. Ciò è particolarmente facile se un gruppo genomico per l&#39;organismo utilizzato è disponibile, pertanto l&#39;embrione pulcino è ancora un modello adatto. Se l&#39;utente ha accesso ad un affidabile centro di sequenziamento del genoma, il problema principale è l&#39;ottenimento di campioni di RNA di alta qualità. Questo lavoro illustra un metodo per ottenere campioni di RNA da tubi neurali transfettate idonee per l&#39;RNA-Seq, nonché le fasi a valle per analisi in silico delle serie di dati risultanti. Dopo l&#39;elettroporazione in HH12-13 seguito da 48 ore di incubazione, tronco transfettate metà del midollo spinale sono stati sezionati in condizioni di assenza di ribonucleasi, immediatamente lisate e ulteriormente protetto dalla degradazione da ultra-low di congelamento fino purificazione dell&#39;RNA e la biblioteca preparation. Il server pubblico Galaxy 10 fornisce l&#39;accesso alle risorse gratuite per l&#39;analisi di dati di sequenziamento high-throughput. La quantità di spazio offerto agli utenti registrati è sufficiente per piccoli esperimenti, eliminando così la necessità di infrastrutture computazionale locale. Analisi dei dati di RNA-Seq include il filtraggio, l&#39;allineamento e la quantificazione / confronto dell&#39;espressione genica. Anche se ci sono linee guida generali per l&#39;analisi dei dati di RNA-Seq, parametri di filtraggio dipenderà in larga misura la qualità della sequenza e devono essere determinate dopo l&#39;analisi di controllo della qualità dei dati grezzi. Questo protocollo descrive la procedura per ottenere e confrontare i profili di RNA-Seq da pollo embrionale midollo spinale trasfettate in vivo. Di conseguenza rappresentante, confronto di set di dati provenienti da due campioni di controllo indipendenti transfettate con un vettore vuoto ha mostrato che il metodo è riproducibile e dovrebbe permettere di identificare expres differenzialmentetrascrizioni sed in campioni sperimentali. Pertanto, l&#39;applicazione di questo metodo ha il potenziale di aumentare notevolmente il numero di scoperte dopo un solo esperimento e fornire così una grande quantità di dati per successive indagini.

<table><tbody><tr><td>Inchiostro di china</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 ago</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 3 ml</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>F D & C Blu 1</td><td>Spectra Colors Corporation</td><td>5.FC.0010P0</td><td>Colorante alimentare utilizzato per visualizzare l'iniezione</td></tr><tr><td>di DNA Soluzione di Ringer (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 7,2 g di NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,37 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,225 g di CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,217 g Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,02 g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O a 800 ml e regolazione del pH a 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O a 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Filtro e autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Soluzione tamponata con fosfato) (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 8 g di NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,2 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1,15 g Na2HPO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,2 g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O a 800 ml e regolazione del pH a 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O a 1 L e filtro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1 ml di DEPC (dietilpirocarbonato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Agitare energicamente e lasciare riposare per una notte a temperatura</td><td></td><td></td><td></td> ambiente</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cucchiaio setacciato</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 60 x 15 mm piastre di Petri in polistirene</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di decontaminazione RNaseZap RNasi</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche a punta fine</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette a punta fine dritte</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago di vetro tirato realizzato con tubi capillari di vetro da 1,1 x 75 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>40A502</td><td></td></tr><tr><td>9 '' pipetta di vetro Pasteur</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa per pipetta manuale</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trasparente 1,5 ml microcentrifuga provette in polipropilene</td><td>Corning Life Sciences</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione RNAlater per la stabilizzazione dell'RNA</td><td>Life Technologies</td><td>Kit di isolamento dell'RNA totale acquoso AM7020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>AM1912</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo per biologia molecolare</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>2100 Elettroforesi Strumento bioanalizzatore</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Kit di preparazione del campione di RNA Truseq v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001/RS-122-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-seq analisi di espressione genica differenziale in elettroporate chick embrionali del midollo spinale

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo l'elettroporazione del tubo neurale del pulcino è un metodo veloce ed economico per l'identificazione della funzione genica durante lo sviluppo neurale. L'analisi dell'intero genoma di trascritti differenzialmente espressi dopo una tale manipolazione sperimentale ha il potenziale per scoprire un quadro quasi completo degli effetti a valle causati dal costrutto trasfettato. Questo lavoro descrive un metodo semplice per confrontare i trascrittomi da campioni di midollo spinale embrionale trasfettato che comprende tutti i passaggi tra l'elettroporazione e l'identificazione dei trascritti differenzialmente espressi. La prima fase consiste nelle linee guida per l'elettroporazione e nelle istruzioni per la dissezione delle metà del midollo spinale trasfettate da embrioni HH23 in ambiente privo di ribonucleasi e nell'estrazione di campioni di RNA di alta qualità adatti al sequenziamento del trascrittoma. La fase successiva è quella dell'analisi bioinformatica con linee guida generali per il filtraggio e il confronto dei set di dati RNA-Seq nel server pubblico Galaxy, che elimina la necessità di una struttura computazionale locale per esperimenti su piccola e media scala. I risultati rappresentativi mostrano che i metodi di dissezione generano campioni di RNA di alta qualità e che i trascrittomi ottenuti da due campioni di controllo sono essenzialmente gli stessi, un requisito importante per la rilevazione di geni di espressione differenziale in campioni sperimentali. Inoltre, viene fornito un esempio in cui la sovraespressione sperimentale di un costrutto di DNA può essere verificata visivamente dopo il confronto con campioni di controllo. L'applicazione di questo metodo può essere un potente strumento per facilitare nuove scoperte sulla funzione dei fattori neurali coinvolti nello sviluppo precoce del midollo spinale.

Per convalidare il metodo descritto, due campioni di controllo sono stati generati da embrioni elettroporate con i pMES vuoto vettore 7 e un campione da embrioni trasfettate con lo stesso vettore contenente l'inserto costruire SCRT2-ZNF, che codifica i domini zinc-finger di pollo SCRT2 18. I campioni che producono 11-22 mg di RNA totale sono stati ottenuti da ciascun pool di 8 a 12 embrioni. Tutti e tre i campioni ottenuto un valore ottimale RIN 10 a un controllo di qualità eseguito con lo strument...

Questo video mostra i passaggi di base per eseguire l'analisi dell'intero trascrittoma su campioni di midollo spinale embrionale di pollo sezionati dopo la trasfezione con elettroporazione in ovo.

RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare i livelli di espressione di tutti i geni e campioni di midollo spinale embrionale di pollo elettroporato. Ciò si ottiene prima in ovo, esaminando il lato destro dei tubi neurali embrionali precoci e riincubando gli embrioni allo stadio desiderato. Il secondo passo della procedura consiste nel sezionare le metà del tubo neurale trasfettate con successo in un ambiente privo di RNA e procedere alla lisi il più rapidamente possibile.Il terzo passo consiste nell'isolare l'RNA e sottoporre i campioni alla preparazione della libreria e al sequenziamento ad alto rendimento. Il passaggio finale consiste nell'elaborare i set di dati per rimuovere gli artefatti di sequenziamento. Mappare le nidificazioni sul genoma e assegnare livelli di espressione a ciascun gene.In definitiva, i risultati possono mostrare geni differenzialmente espressi attraverso il confronto dei livelli di espressione in condizioni di controllo e sperimentali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale come dissezione del tubo neuronale. I passaggi sono difficili da imparare perché è necessaria familiarità con la manipolazione degli embrioni.Per questa dimostrazione, gli embrioni sono stati trasformati con il costrutto che esprime GFP nel tubo neurale. Preparati a passare due ore a lavorare su un massimo di 10 embrioni per raccogliere uno o due microgrammi di RNA totale per embrione. In condizioni libere di RNA, raccogliere gli embrioni utilizzando forbici da dissezione fine e un cucchiaio di raccolta SVE trasferire ogni embrione a freddo.DEPC trattato. PBS ha utilizzato una soluzione per tutte le fasi di isolamento del tubo neurale che procedono utilizzando una pinzetta sottile per rimuovere l'intera regione del fianco di un embrione tra le gemme dell'arto. Sposta questa sezione su una soluzione fredda fresca con il tessuto rivolto verso l'alto.Utilizzare due aghi di vetro sottili per perforare tre punti su ciascun lato laterale dorsale dell'embrione tra il tubo neurale e il mesoderma pariale. Ora introduci i due aghi di vetro nella perforazione centrale e allontanali lungo l'asse AP. Fallo attraverso ogni perforazione secondo necessità per staccare infine il mesoderma parale, rimuovere e scartare questo tessuto.Quindi, gira l'embrione lateralmente e introduci le punte di due pinzette tra il tubo neurale e il cordone nodale. Separali lungo l'asse AP per dividere le strutture. Termina di rimuovere pezzi più grandi di tessuto meder dal tubo neurale fissandolo delicatamente con una pinzetta mentre rimuovi il mesoderma in eccesso.Quindi trasferire delicatamente il tubo neurale in una soluzione fresca e fredda. Utilizzando una pipetta di vetro con una pompa manuale, raccogliere tutti i tubi neurali necessari e tenerli in ghiaccio prima di procedere. Ora, dividi ciascuno dei tubi neurali in due metà.Inserisci una pinzetta a punta affilata nel lume e strappa la piastra del tetto. Quindi usa le pinzette per tagliare la piastra del pavimento e dividere il fazzoletto a metà. Utilizzando un microscopio da dissezione a fluorescenza, separare le metà elettroporate da quelle non elettroporate.Trasferire le metà del tubo neurale ordinate in una provetta da 1,5 millilitri con soluzione fresca. Muovi questi tubi per far scendere tutto il tessuto sul fondo. Quindi, fai girare i tubi a 100 GS per alcuni secondi.Quindi, con molta attenzione sotto una luce intensa, aspirare lo snat. Se il tessuto è aspirato, espellerlo lentamente e ripetere la rotazione. Una volta che le metà del tubo neurale sono state ripulite dalla soluzione, aggiungere 70 microlitri per tubo neurale, metà del tampone di lisi al tubo.Agitare la provetta e incubarla a temperatura ambiente per 15 minuti ogni cinque minuti, agitare energicamente la provetta e procedere con la raccolta dell'RNA per purificare l'RNA Per il sequenziamento, avere almeno otto metà del tubo neurale per campione. Altre collezioni di tubi neurali del liceo conservati a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius possono essere raggruppate nella collezione. Inizia scongelandoli con ghiaccio per 15-30 minuti, quindi completa lo scongelamento a temperatura ambiente.Una volta scongelati, agitare energicamente tutti i campioni e lasciarli riposare per cinque minuti. Quindi agitare nuovamente i campioni e centrifugarli a 15.000 GS per un minuto. Per eliminare il materiale insolubile, trasferire il surnatante in un nuovo tubo e procedere con l'estrazione.Utilizzando un kit di isolamento dell'RNA, completare il processo eludendo l'RNA alla massima concentrazione possibile. Questo protocollo richiede un account del sito Web Galaxy per garantire la quota di spazio necessaria. Innanzitutto, carica i file FASTQ tramite FTP sul sito, a meno che i punteggi di qualità non siano già codificati in Shred plus 33.Innanzitutto, preparare i set di dati caricati utilizzando lo strumento di selezione FASTQ nel menu NGS QC e manipolazione. In caso contrario, in attributi, modificare il tipo di file in Mittente FASTQ. Successivamente, nel menu NGS QC e manipolazione, utilizzare lo strumento FAST QC per analizzare la qualità generale dei set di dati.Selezionare il trimmer di qualità FASTQ nello stesso menu per scartare le tre estremità prime di bassa qualità. Deve essere elaborato un punteggio di qualità pari o superiore a 20. Ora vai allo strumento clip nello stesso menu.Impostare questo strumento per scartare le letture con meno di 45 coppie di basi. Immettere la sequenza dell'adattatore. Disabilita l'opzione per eliminare le letture con basi sconosciute e scegli l'output per includere sequenze ritagliate e non ritagliate.Procedi con lo strumento delle sequenze di ritaglio. Usalo per tagliare le prime basi della lettura per rimuovere la distorsione della sequenza a cinque numeri primi rilevata da FAST qc. Il prossimo passo è scaricare e decomprimere l'ultimo assemblaggio del genoma del pollo dal sito del genoma Illumina I.Quindi carica l'intero file in formato più veloce del genoma e il file in formato GTF di annotazione del gene nella Cronologia delle Galassie. Ora mappa le letture per ogni campione sul genoma accedendo al menu di analisi N-G-S-R-N-A e selezionando lo strumento top hat two. Seleziona il file fasta caricato dalla Cronologia galattica come genoma di riferimento.Quindi, scegli lo strumento gemelli nello stesso menu per creare un trascrittoma previsto. Per ogni campione, scegliere il file GTF da utilizzare come guida per le annotazioni di riferimento. Selezionare Esegui correzione distorsione utilizzando il file FASTA per i dati della sequenza e abilitare l'opzione Usa correzione lettura multipla.Quindi unisci tutti i trascrittomi di assemblaggio utilizzando lo strumento di unione del bracciale. Con questo strumento, scegli il file GTF per l'annotazione di riferimento e il file FASTA per i dati della sequenza. Ora confronta i file BAM generati da top hat due per ogni campione utilizzando lo strumento TIFF del bracciale sempre nel menu di analisi dell'RNA.Nel campo trascrizioni, selezionare il trascrittoma di unione generato dall'unione dei bracciali e abilitare le opzioni. Utilizzare la lettura multipla corretta ed eseguire la correzione della distorsione utilizzando il file FASTA per i dati della sequenza. Il passaggio successivo consiste nell'ordinare le tabelle differenziali Utilizzando la colonna del valore Q, selezionare lo strumento di ordinamento dal menu di filtro e ordinamento.Le sequenze con differenze significative tra le condizioni sperimentali avranno i valori di Q più bassi sulla colonna 13. Ora dai un'occhiata ai grafici di copertura. Innanzitutto, convertire i file BAM in file grafici bed utilizzando lo strumento di conversione nel menu strumenti bed sotto le opzioni, disabilitare la segnalazione delle regioni senza copertura e scegliere di trattare le voci giuntate come intervalli distinti.Ridimensionare anche la copertura in base a un fattore che normalizza tutte le coperture nell'esperimento. Quindi converti il file del grafico del letto risultante nel formato della parrucca grande utilizzando lo strumento nel menu di conversione dei formati e carica il file della parrucca grande come traccia personalizzata sul server UCSE. Sulla pagina del browser del genoma USCS, utilizzare l'assemblaggio GAL four e le ricerche geniche per la copertura visiva dei set di dati utilizzando i metodi descritti in cui sono stati raccolti tubi neurali che esprimono vettori PS vuoti per il loro RNA.Questo è stato fatto in duplicato e l'RNA risultante era di qualità molto alta con un valore RIN ottimale di 10 come previsto. Il confronto globale dei trascrittomi dei controlli a vettore vuoto duplicati non ha mostrato differenze evidenti e il coefficiente di correlazione di Pearson era di 99 punti. Inoltre, c'è stato un chiaro aumento del numero di reads mappate sulla sequenza genica scratch two in un campione sperimentale che esprime i domini scratch two zinc finger.Pertanto, i metodi erano abbastanza sensibili da rilevare l'arricchimento previsto. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di isolare il tubo neuronale embrionale e avere una buona comprensione di come elaborare e confrontare il set di dati IC per trovare geni espressi in modo differenziale seguendo i passaggi dell'analisi del silicio nella sezione quattro del protocollo.

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Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

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Presentato qui è un protocollo per eseguire il knock-out genico limitato nel tempo e nello spazio nei midollo spinale axolotl iniettando il complesso CAS9-gRNA nel canale centrale del midollo spinale seguito dall'elettroporazione.

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Qui descriviamo una caratterizzazione proteomica basata sulla spettrometria di massa di linee cellulari con destini tissutali noti nell'embrione vertebrato di Xenopus laevis .

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Scopri l'analisi RNA-Seq dell'espressione genica differenziale nel midollo spinale di embrioni di pollo elettroporati. Questo metodo consente di valutare i livelli di espressione genica con alta sensibilità.

RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

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