Name: Propagazione di Virus-01 Homalodisca coagulata Via Homalodisca vitripennis Cell Culture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Impara a propagare il virus HoCV-1 in colture cellulari di Homalodisca vitripennis. Questo protocollo virologico permette di estrarre e quantificare l'RNA virale tramite qRT-PCR per studiare la replicazione in vitro.

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Vorremmo ringraziare il Texas Pierce's Disease Research and Education Program e USDA-APHIS per il loro sostegno finanziario a questo progetto. Vorremmo anche ringraziare Hema Kothari dell'Università del Texas Health Science Center di Tyler per la sua assistenza con la microscopia confocale.

Cultura 1. cellulare NOTA: linee cellulari Homalodisca vitripennis stabiliti dal laboratorio Dr. Wayne Hunter presso l&#39;USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) sono stati utilizzati per avviare un magazzino laboratorio composto da fasi cellulari misti inclusi i fibroblasti ei monostrati iniziali. <ol><li> Eseguire le seguenti procedure in un ambiente di laboratorio sterile mantenuta ad una temperatura compresa tra 20-24 ° C con 25 cm 2 fiasche di coltura. </li><li> Coltivare e mantenere le culture in 25 cm 2 fiasche di coltura tissutale utilizzando H2G + Leafhopper medio, una versione modificata del supporto api WH2 10 (Tabella 1). </li><li> Incubare fiasche di coltura a 24 ° C con il ~ 53% di umidità. </li><li> Utilizzare un microscopio invertito a un ingrandimento totale (TM) di 100X per monitorare la crescita della cultura, ad esempio, controllare l&#39;eventuale crescita cellulare anormale, monitorare eventuali contaminanti potenziali, e verificare i progressi di crescita in tutto il culsuperficie tura. </li><li> Eseguire un cambiamento di terreno completo (~ 4 ml di terreno di coltura per bombola) ogni 7 - 10 giorni senza disturbare la superficie cultura. </li><li> Passare culture quando la superficie cultura è circa l&#39;80% coperto da crescita cellulare (confluente) con 0,25% di tripsina contenente acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per dissociare le cellule. Aggiungere ~ 2 - 3 ml di tripsina per ciascun pallone di coltura e di esporre la cultura (s) per l&#39;enzima per brevi periodi di tempo (5-10 minuti) per raggiungere dissociazione cellulare completo. </li><li> Aggiungere una quantità uguale di mezzo fresco al pallone di coltura (s) (~ 2 - 3 ml) per arrestare l&#39;attività enzimatica e trasferire l&#39;intera soluzione in una provetta per centrifuga. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 4 ° C per 6 min a 350 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet di cellule e aggiungere ~ 8 ml di terreno fresco ad ogni provetta. Omogeneizzare delicatamente cellule utilizzando una pipetta. </li><li> Culture Split in un rapporto 1: 2 per 25 centimetri 2 palloni (~ 4 ml di soluti cellularesu ogni pallone) e lasciare culture appena passati indisturbati per 48 ore per permettere le cellule in sospensione per fissare saldamente alla superficie del pallone. NOTA: La coltivazione di cellule in 48 pozzetti piastre di coltura tissutale sterili con una superficie di crescita di 1 cm 2 è anche possibile e che può essere mantenuta allo stesso modo come fiasche di coltura con una riduzione del volume di terreno di coltura per ~ 250 microlitri. </li></ol> 2 Estrazione Virus intero <ol><li> Omogeneizzare corpi interi di virus H. positivo vitripennis in tampone fosfato, pH ~ 7.2, con 0,02% di sodio triidrato dietilditiocarbamato (DETCA) di vortex per ~ intervalli di 10 sec fino a quando non ci sono più grandi ciuffi di tessuto presente. Estrarre virus via SuperSpeed ​​centrifugazione a 124.500 xg per 4 ore a 4 ° C o 22.000 xg per 16 ore a 4 ° C. Se si forma un precipitato nella parte superiore, rimuoverlo con un tampone di cotone sterile 11. </li><li> Eliminare il surnatante. </li><li> Raccogliere il pellet esciogliere con 5 ml di 10 mM tampone fosfato (senza DETCA), pH ~ 7,2, contenente lo 0,4% di acido Na-deoxycholic e 4% etere di glicole polietilenico esadecile (Brij 52). <ol><li> Mescolare bene il pellet, rimuovere il pellet dal lato del tubo e schiacciare fino in soluzione, se necessario. </li><li> Aggiungere più 10 mM tampone fosfato in ~ incrementi di 5 ml per aiutare il pellet va in soluzione, se necessario, e si combinano in 2 tubi 11. </li></ol></li><li> Centrifugare la soluzione a 300 xg per 15 min 11. </li><li> Rimuovere il surnatante e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 micron, e raccogliere il filtrato in provetta grande collezione 11. </li><li> Trasferimento filtrato ad una membrana di dialisi con un peso molecolare tagliato (MWCO) di 3,5 kD, utilizzando piccole quantità di tampone fosfato 10 mM (pH 7) non contenente DETCA se necessario 11. </li><li> Posizionare la membrana di dialisi in un grande bicchiere pieno di DDH 2 O a 4 ° C. Modificare il DDH 2 O ogni ora fo 5-6 ore, fino a quando un bianco precipitato nella membrana 11. </li><li> Raccogliere il virus purificato dal di dentro la membrana e sottoporre la soluzione virus al 100% per una serie di diluizioni di 10 volte con l&#39;aggiunta di 10 ml di soluzione a 90 ml di DDH 2 O. Successivamente, aggiungere 10 ml della diluizione per altri 90 ml di DDH 2 O fino a raggiungere una diluizione di 1: 100.000. </li><li> Soluzione virus Conservare a -80 ° C. </li></ol> 3 replicazione virale <ol><li> Cellule seme in piastre di coltura 48 pozzetti e crescono tutte le righe fino a quando la crescita cellulare è di 80% confluenti (circa il post-passa 72 ore se le cellule stanno crescendo a un tasso medio). </li><li> Inoculare ciascuna riga di celle con il virus diluito seriale volta la crescita cellulare raggiunge la confluenza, cioè, una riga di una diluizione 1:10, una riga di una diluizione 1: 100, ecc, ad eccezione della fila superiore. Utilizzare la riga superiore come controllo e aggiungere 10 ml di DDH 2 O a ciascun pozzetto come controlli del volume. <ol><li> Al fine di stabilire una concentrazione di partenza del cellulare di base per il confronto con conta di cellule sperimentali, dissociare e contare il primo pozzo di ogni riga prima della inoculazione iniziale di eventuali pozzi nelle culture con il virus. </li></ol></li><li> Monitorare piastre di coltura ogni 24 ore dopo l&#39;inoculazione virale per qualsiasi cambiamento di colore nel terreno che indica un cambiamento di pH e di eventuali modifiche di morfologia cellulare. </li><li> Immagine una colonna della piastra di prova in ogni punto di tempo, utilizzando un microscopio invertito a 100X TM. </li><li> Rimuovere tutti i media dalla colonna che è stato ripreso in ogni punto di tempo di 24 ore e conservarla a breve termine a -20 ° C per l&#39;estrazione dell&#39;RNA e la quantificazione virale o lungo termine a -80 ° C. </li><li> Dissociare le cellule dai pozzetti dopo la rimozione del mezzo come precedentemente descritto nei passaggi 1,6-1,9, utilizzando solo ~ 250 ml di 0,25% tripsina EDTA e mezzo fresco di fermare l&#39;attività enzimatica e ~ 250 ml di mezzo fresco di ri-sospendere la pelle cellat. </li><li> Aggiungere 10 ml di 0,4% trypan blu macchia in ogni provetta contenente le cellule per eseguire la conta delle cellule dopo la dissociazione delle cellule per ogni periodo di 24 ore più di una settimana. Lasciare macchia riposare per 10 minuti prima di eseguire la conta delle cellule. <ol><li> Eseguire la conta delle cellule entro 1 ora di esposizione a macchiare o cellule vitali inizierà ad assorbimento macchia così come le cellule non vitali. </li></ol></li><li> Aggiungere lentamente 10 ml di soluzione di cellule macchiata a ogni lato di un emocitometro standard utilizzando una micropipetta. Lasciare la soluzione da adottare da un&#39;azione capillare per evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Contare il numero di (non tinto), le cellule vitali su entrambi i lati del emocitometro (l&#39;equivalente di 4 conteggi delle 16 piazze del emocitometro). Eseguire la conta delle cellule per ciascun pozzetto della colonna che è stato rimosso. </li><li> Calcolare la media dei conteggi di cella da ogni colonna e utilizzare la seguente formula per ottenere il numero totale conta delle cellule: (numero medio di cellule / 4) x fattore di diluizione = numero di cellule x 10 <sup&gt; 4 ml. Questa è la densità cellulare o il numero di cellule vitali in coltura. </li></ol> 4. Virus Estrazione da coltura cellulare <ol><li> Rimuovere trattati H. vitripennis cellule da fiasche di coltura come precedentemente descritto nei passaggi 1,6-1,8, utilizzando solo ~ 250 ml di 0,25% tripsina EDTA e mezzo fresco per fermare l&#39;attività enzimatica. </li><li> Eliminare il surnatante. </li><li> Estratto virus dalle cellule di coltura seguendo il protocollo precedentemente descritto nei passaggi 2,3-2,8. </li></ol> 5. RNA Estrazione <ol><li> Estrarre l&#39;RNA da campioni medie raccolti durante ogni prova di virus di una settimana con un estrazione tiocianato-fenolo-cloroformio guanidina progettato per campioni liquidi per il protocollo del produttore. </li><li> Conservare estratto campioni a -80 ° C. </li></ol> 6 RT-PCR <ol><li> Stabilire norme virali per RT-PCR eseguendo PCR tradizionale con ilcoppia di primer HoCV RT-PCR Primer 1 (forward 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, 5&#39;-inversione ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;) con il virus isolato da tutto il corpo H. vitripennis. </li><li> Oggetto del prodotto PCR per gel elettroforesi per 60 min a 120 V in un gel di agarosio al 2% contenente 0,1% di bromuro di etidio. </li><li> Accise le bande dal gel e purificare utilizzando un kit di estrazione di gel secondo il protocollo del produttore. </li><li> Pool tutti asportato e gel purificato prodotto e purificare ulteriormente per precipitazione di base di etanolo. Eluire il prodotto precipitazioni in circa 30 ml di Tris EDTA (TE) per aumentare la concentrazione complessiva del campione. </li><li> Quantificare il livello di cDNA in campioni aggregati mediante spettrofotometria con 260/230 impostazioni di lunghezza d&#39;onda per il rilevamento degli acidi nucleici. </li><li> Eseguire una serie di diluizioni seriali di dieci volte del campione purificato che vanno da 57 ng / ml a 57 ag / ml (10 -18). Eseguire la diluizione seriale simile a quella descritta in 2.8 con rettifiche apportate per la differenza nei requisiti di concentramento. </li><li> Determinare i limiti di rilevazione delle serie di diluizioni eseguendo qRT-PCR utilizzando un kit qRT-PCR con quantificazione affidabile di trascritti bassa abbondanza. NOTA: le concentrazioni virali inferiori a 5 x 10 -3 copie non sono rilevabili. </li><li> Estrarre l&#39;RNA da campioni sperimentali come descritto in precedenza al punto 5.1 e quantificare con spettrofotometria. </li><li> Normalizza tutti i campioni estratti a 5 ng / ml con acqua priva di nucleasi. </li><li> Eseguire qRT-PCR su tutti i campioni, in duplicati, come le reazioni di 25 microlitri utilizzando un one-step kit qRT-PCR con la capacità di percepire basso numero di copie come segue: 50 ° C premuto per 10 min; 95 ° C in attesa per 5 min; 30 cicli di 95 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec; fondere 50-99 ° C per 5 sec su ogni passo. <ol><li> Rendere il master mix in modo che ogni miscela di reazione contiene 12,5 ml di maste 1xmix R, 1,0 ml (0,3 micron) di primer in avanti, 1,0 ml (0,3 micron) di primer reverse, 0,25 ml di trascrittasi inversa e di quantità variabili di modello in base ai valori di normalizzazione. </li><li> Portare il volume totale di reazione a 25 ml con acqua priva di RNasi. </li><li> Includi cinque concentrazioni standard in ogni PCR eseguiti con i seguenti numeri di copie: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, e 5 x 10 -2 copie. Impostare la soglia per ogni corsa appena sotto una fluorescenza di 10x -2.5 per ridurre il rumore durante l&#39;acquisizione anticipata all&#39;inizio di ogni esecuzione. </li></ol></li></ol> 7 Microscopia confocale <ol><li> Crescere cellule Homalodisca vitripennis in dodici piatto contenente anche vetrini di misura 18 mm di diametro in ciascun pozzetto. </li><li> Seminare una colonna sul piatto ogni 24 ore per un periodo di quattro giorni, una volta un monostrato è raggiunto. Assicurarsi che ogni column contiene un controllo bene, una diluizione virale bassa (1,10) bene e una diluizione virale elevata (1: 100.000) bene. Utilizzare soluzioni antivirus ottenute dal punto 2.8. </li><li> Rimuovere tutti i supporti il ​​quinto giorno e lavare le cellule due volte con PBS 1x (pH 7,4). </li><li> Fissare le cellule con freddo 4% paraformaldeide a 4 ° C per 30 min. </li><li> Aggiungere 500 ml di 1x tampone fosfato (PBS) per le cellule e lavare per 10 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo a bassa velocità. Lavare le cellule tre volte. </li><li> Aggiungere 500 ml di 0,1% Triton X-100 per le celle a permeabilize loro. Lasciate riposare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule di nuovo come precedentemente descritto al punto 7.5. </li><li> Aggiungere 500 ml di una soluzione al 5% albumina sierica bovina (BSA) per bloccare le cellule a temperatura ambiente. Lasciare riposare per 2 ore e poi rimuovere. </li><li> Diluire magazzino Rhodamine falloidina rosso-coniugato (RCP) 1: 250 in 1x PBS contenente 5% di BSA e aggiungere 250 ml di diluizione per ciascun bene a macchia di F-actina. </li><li> Piastra di copertura in alluminio folio per evitare che il colorante da sbianca e incubare le cellule a 4 ° CO / N. </li><li> Rimuovere la RCP dopo 12 ore di incubazione e sostituirlo con 250 ml di 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (250 mg / ml) diluito in 1x PBS contenente 5% di BSA, a macchiare i nuclei delle cellule . </li><li> Incubare le cellule contenenti DAPI a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare le cellule tre volte con PBS 1x come precedentemente descritto al punto 7.5. </li><li> Rimuovere delicatamente i coprioggetti dai pozzetti e montare per vetrini da microscopio utilizzando un mezzo di montaggio con un reagente anti-sbiadimento. </li><li> Lasciare i vetrini si asciughino in scatole a tenuta di luce fino visti al microscopio confocale. Vedi Vetrini Preparati al più presto come coloranti possono svanire rapidamente. </li><li> Immagine macchiato cellule utilizzando un sistema confocale equipaggiato con un microscopio contenente una lente 63X (olio) piano-apochromate. <ol><li> Impostare le lunghezze d&#39;onda laser a 543 ± 10 nm di eccitazione e 575 ± 10 nm di emissione per Rhoadmine falloidina rosso-conjucated, E 369 ± 10 nm di eccitazione e 450 ± 30 nm di emissione per DAPI. </li><li> Utilizzare guadagno identici e impostazioni partì-per il rilevatore di ottenere tutte le immagini. </li><li> Immagini di processo utilizzando il software appropriato per l&#39;elaborazione delle immagini e di smistamento e immagini di importazione desiderato in un software di gestione delle immagini. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;aumento preoccupazioni per quanto riguarda l&#39;afflusso di specie invasive agricole hanno portato ad un aumento della domanda di nuove metodologie per la difesa contro i parassiti e patogeni emergenti. Un focus di prevenzione e gestione della malattia comporta la gestione di vettori patogeni ed era l&#39;obiettivo primario di questo studio. Economia svolgono un ruolo fondamentale nella decisione di produrre questo tipo di biopesticida per gestire vettori di patogeni in agricoltura perché l&#39;applicazione prati...

Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis Germar 1821) è stata identificata come il vettore predominante di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l&#39;agente causale della malattia di Pierce della vite (PD) in Nord America 1. Insetto gestione della popolazione è rapidamente diventato il centro della ricerca per combattere questo problema devastante per il settore della viticoltura in California e in tutto il sud degli Stati Uniti. Un positivo-senso, virus a RNA a singolo filamento appartenente alla famiglia Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) è stata identificata in H. selvatici popolazioni vitripennis e dimostrato di aumentare la mortalità in quelle popolazioni 2-4, riducendo al contempo la resistenza degli insetti agli insetticidi. Sviluppo di metodi per efficacemente posteriore infetto H. vitripennis all&#39;età adulta in un ambiente di laboratorio sono stati difficili perché <em&gt; H. vitripennis hanno diverse esigenze nutrizionali specifiche fasi che richiedono una grande varietà di piante ospiti 5-8. Strutture specifiche sono richieste per posteriore H. vivo vitripennis negli Stati Uniti; Pertanto, coltura cellulare è più economico e una possibile alternativa, così come sempre più vitale per HoCV-01 rilevazione e replicazione 2,9. Mentre i metodi di base per stabilire colture cellulari di H. vitripennis sono descritti, questi metodi non sono ancora stati utilizzati per la produzione commerciale di agenti di controllo biologico, come ad esempio i virus 2. L&#39;obiettivo generale delle seguenti procedure è quello di produrre una elevata concentrazione di HoCV-01 adatto per l&#39;utilizzo come agente di controllo biologico. Replicazione virale richiede una cellula vivente, che è il motivo per cui coltiva con successo e l&#39;ottimizzazione H. vitripennis culture è fondamentale per il progresso di produrre livelli redditizi di virus.

<table><tbody><tr><td>Fiasche per colture cellulari Corning</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Superficie 25 cm2, collo inclinato, tappo (tappo di tenuta)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Microscopio invertito e fotocamera</td></tr><tr><td>Soluzione tripsina-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0,25%, filtrato sterile, BioReagente, adatto per colture cellulari, 2,5 g di tripsina suina e 0,2 g di EDTA & toro; 4Na per litro di Hanks&prime; Soluzione salina bilanciata con rosso fenolo</td></tr><tr><td>Piastre di coltura multipozzetto Greiner CELLSTAR</td><td>Sigma</td><td>Aldrich M8937</td><td>48 pozzetti (TC trattato con coperchio)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Sodio dietilditiocarbammato triidrato</td></tr><tr><td>Sistema di filtraggio sottovuoto per flaconi Corning</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>Membrana in acetato di cellulosa, dimensione dei pori 0,45 &mu; m, area della membrana 54,5 cm2, capacità del filtro 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Polietilenglicole esadecil etere</td></tr><tr><td>Soluzione tampone fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Ricevuto come 100 mM diluito a 10 mM con acqua sterile</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>Per elettroforesi</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent, per biologia molecolare, polvere</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagente grado, cristallino</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Fosfato soluzione salina tamponata</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina coniugata con rosso rodamina</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>La falloidina della rodamina è una sonda F-actina ad alta affinità coniugata al colorante fluorescente rosso-arancio, la tetrametilrodamina</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Reagente Antifade</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Sistema metaconfocale</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Insetto medio (integrato, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ cicalina medio componente</td></tr><tr><td>L-istidina monoidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ cicalina medio componente</td></tr><tr><td>Medio 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ cicalina medio componente</td></tr><tr><td>Medio 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ cicalina medio componente</td></tr><tr><td>Hank' s Sali bilanciati (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ cicalina componente media</td></tr><tr><td>L-Glutammina (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ cicalina componente media</td></tr><tr><td>MEM, miscela di aminoacidi (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ cicalina componente media</td></tr><tr><td>1 M soluzione MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ cicalina componente media</td></tr><tr><td>Pen-Strep (con / glutammina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G+ cicalina componente media</td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G+ cicalina componente media</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G+ cicalina componente media</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G+ cicalina componente media</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G+ cicalina componente media</td></tr></tbody></table>

propagazione di<em&gt; virus-01 homalodisca coagulata</em&gt; via<em&gt; homalodisca vitripennis</em&gt; cell culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis) è un insetto estremamente polifago vagili e presente in tutto il sud-ovest degli Stati Uniti. Questi insetti sono i vettori predominanti di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), un batterio xilema limitata che è l&#39;agente causale della malattia di Pierce (PD) della vite. Malattia di Pierce è economicamente dannoso; così, H. vitripennis sono diventati un bersaglio per le strategie di gestione del patogeno. Un dicistrovirus identificato come virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) è stata associata a un aumento della mortalità in H. popolazioni vitripennis. Perché una cellula ospite è necessaria per la replica HoCV-01, coltura cellulare fornisce un ambiente uniforme per la replica mirato che è logisticamente ed economicamente importante per la produzione di bio-pesticida. In questo studio, un sistema per la propagazione su larga scala da H. vitripennis cellule tramite coltura tissutale è stato sviluppato, providing un meccanismo di replicazione virale. HoCV-01 è stato estratto da insetti di tutto il corpo e utilizzato per inoculare H. colta vitripennis cellule a diversi livelli. Il terreno di coltura è stato rimosso ogni 24 ore per 168 ore, RNA estratto e analizzato con qRT-PCR. Le cellule sono state colorate con blu trypan e contati per quantificare la capacità di sopravvivenza delle cellule mediante microscopia ottica. Particelle virali intere sono stati estratti fino a 96 ore dopo l&#39;infezione, che è stato il punto di tempo determinato per essere prima totale coltura cellulare crollo si è verificato. Le cellule sono state inoltre sottoposte a colorazione fluorescente e visualizzati mediante microscopia confocale per indagare l&#39;attività virale su attaccamento e nuclei integrità F-actina. La conclusione di questo studio è che H. vitripennis cellule sono in grado di essere colta e utilizzata per la produzione di massa di HoCV-01 a un livello adeguato a consentire la produzione di un biopesticida.

Attaccamento delle cellule e la crescita è stato visto in 48 ore di passaggio in piccole e grandi fiasche di coltura, da colture primarie e continui passaggi. Crescita dei fibroblasti e sviluppo è stata osservata anche in questo lasso di tempo. Quando fiaschi appena seminati sono stati disturbati prima di 48 ore, c&#39;è stato un calo visibile in adesione cellulare, portando a culture crescita più lenti ea volte senza attaccamento o di crescita a tutti. Le cellule sono state circa il 80% confluenti entro una settimana d...

Qui vi presentiamo un protocollo per propagare le cellule Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Media è stato rimosso dalla HoCV-1 colture positive e RNA estratto ogni 24 ore per 168 ore. Sopravvivenza cellulare è stata quantificata trypan colorazione blu. Particelle virali intere sono stati estratti dopo l&#39;infezione. RNA estratto è stato quantificato da qRT-PCR.

Propagazione di<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare se il virus Homalodisca coagulata uno, o HOCV-uno, possa essere replicato utilizzando colture cellulari di Homalodisca vitripennis ed estratto per successivi utilizzi a valle. Questo viene ottenuto coltivando con successo H. vitripennis per introdurre HOCV-uno purificato e consentirne la replicazione. Come secondo passaggio, il mezzo e le cellule contenenti il virus vengono rimossi dalla coltura e successivamente sottoposti a estrazione del virus e dell'RNA.In seguito, l'RNA estratto dalle colture infette viene sottoposto a PCR per determinare se l'RNA virale è presente nelle cellule. I risultati mostrano che HOCV uno può replicarsi in vivo sulla base del conteggio delle cellule vitali prima e dopo l'infezione e dell'analisi di qRT-PCR.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'allevamento di insetti infettivi vivi, è che essa è più economica e facilmente gestibile con strutture e attrezzature minime. L'utilizzo di questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del controllo biologico. Ad esempio, è possibile utilizzare un virus degli insetti, o un virus specifico per una specie di insetto, per controllare un parassita su larga scala?Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla gestione di questo insetto specifico, può essere applicato anche ad altri sistemi, come nel caso della gestione delle formiche rosse importate utilizzando un virus della stessa famiglia di HOCV. Prima di iniziare questa procedura, coltivare e mantenere le colture in fiaschi da 25 centimetri quadrati per colture cellulari utilizzando il mezzo H2G più mezzo per cicaline, un mezzo per api mellifere modificato WH-due. Omogeneizzare i corpi interi di H. vitripennis positivi al virus nel tampone fosfato con il 0,02% di DETCA mediante vortex a intervalli di circa dieci secondi fino a quando non siano più presenti grumi di tessuto di grandi dimensioni. Estrarre il virus mediante centrifugazione ad alta velocità a 22.000 ×g per 16 ore a quattro gradi Celsius.Dopo aver eliminato il soprannatante, raccogliere il pellet e scioglierlo in cinque millilitri di tampone fosfato 10 millimolare contenente 0,4% di acido desossicolico sodico e 4% di etere esa-desal di polietilene glicole. Per mescolare bene il pellet, rimuoverlo dalla parete del tubo e frantumarlo se necessario. Dopo centrifugazione a 300 ×g per 15 minuti, rimuovere il soprannatante, quindi far passare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 micrometri e raccogliere il filtrato in un tubo di raccolta grande.Trasferire il filtrato in una membrana da dialisi con cutoff di peso molecolare di 3,5 chilodalton utilizzando piccole quantità di tampone fosfato 10 millimolare privo di DETCA, se necessario. Immergere la membrana da dialisi in un grande becher riempito con acqua doppio-distillata a quattro gradi Celsius. Cambiare l'acqua ogni ora per cinque-sei ore fino a quando si forma un precipitato bianco all'interno della membrana. A questo punto, seminare le cellule in piastre da coltura a 48 pozzetti.Una volta che la crescita cellulare raggiunge l'80% di confluenza, inoculare ogni fila di cellule con il virus diluito in serie. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di acqua doppio-distillata in ogni pozzetto come controllo del volume. Al fine di stabilire una concentrazione cellulare iniziale di base per il confronto con i conteggi cellulari sperimentali, dissociare il primo pozzetto di ogni fila prima dell'inoculazione iniziale di qualsiasi pozzetto nelle colture con il virus. Quindi, contare le cellule.Successivamente, rimuovere tutto il mezzo dalla colonna che è stata analizzata a ogni punto temporale di 24 ore e conservarlo a meno 20 gradi Celsius per l'estrazione dell'RNA e la quantificazione virale. Dopo aver estratto il virus dalle cellule in coltura seguendo il protocollo descritto in precedenza, estrarre l'RNA dai campioni di mezzo raccolti durante ogni prova virale settimanale utilizzando un'estrazione con tiocianato di guanidinio, fenolo e cloroformio progettata per campioni liquidi, secondo le istruzioni del produttore. Per la RT-PCR, stabilire standard virali eseguendo una PCR tradizionale utilizzando la coppia di primer HOCV RT-PCR primer-uno con l'isolato virale ottenuto dall'intero organismo di H. vitripennis.In seguito, eseguire una serie di diluizioni seriali di ordine dieci del campione purificato, con concentrazioni comprese tra 57 nanogrammi per microlitro e 57 attogrammi per microlitro. Determinare i limiti di rilevabilità della serie di diluizioni mediante qRT-PCR, utilizzando un kit di qRT-PCR in grado di quantificare in modo affidabile trascritti a bassa abbondanza.Dopo aver estratto l'RNA dai campioni sperimentali come descritto in precedenza, quantificare mediante spettrofotometria. Successivamente eseguire la qRT-PCR su tutti i campioni in duplicato come reazioni da 25 microlitri utilizzando un kit di qRT-PCR in un unico passaggio, in grado di rilevare basse copie, come segue. Preparare il mix maestro in modo che ogni miscela di reazione contenga 12,5 microlitri di mix maestro 1x, 1,0 microlitro di primer diretto 0,3 micromolare, 1,0 microlitro di primer inverso 0,3 micromolare, 0,25 microlitri di trascrittasi inversa e quantità variabili di stampo in base ai valori di standardizzazione. Portare quindi il volume totale della reazione a 25 microlitri con acqua priva di RNA. Includere cinque concentrazioni standard in ogni corsa di PCR: 5 × 10⁻¹, 5 × 10⁻⁸, 5 × 10⁻⁶, 5 × 10⁻⁴ e 5 × 10⁻² copie. Impostare la soglia per ogni corsa appena al di sotto di una fluorescenza di 10 × 10⁻²,⁵ per ridurre il rumore durante l'acquisizione iniziale all'inizio di ogni corsa. Una volta che le cellule di Homalodisca vitripennis sono state coltivate in una piastra a 12 pozzetti contenente coprioggetti di vetro, inoculare una colonna ogni 24 ore per quattro giorni, una volta ottenuto un monostrato con il virus estratto. Al termine, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% fredda a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di PBS 1X alle cellule e lavarle per 10 minuti a temperatura ambiente su un agitatore a bassa velocità. Dopo aver lavato le cellule tre volte, aggiungere 500 microlitri di TritonX-100 allo 0,1% per permeabilizzare le cellule per 10 minuti.Dopo aver lavato le cellule con PBS 1X, aggiungere 500 microlitri di una soluzione al 5% di albumina sierica bovina per bloccare le cellule a temperatura ambiente. Dopo due ore, rimuovere la soluzione dalle cellule. Quindi aggiungere 250 microlitri di una soluzione diluita di Phalloidina coniugata con rodamina rossa in ogni pozzetto per la colorazione dell'f-actina. Coprire la piastra con carta d'alluminio per evitare lo sbiancamento del colorante e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di rodamina e sostituirla con 250 microlitri di DAPI diluito in PBS 1X contenente il 5% di BSA per la colorazione dei nuclei cellulari. Dopo aver incubato le cellule a temperatura ambiente per un'ora, lavarle tre volte con PBS 1X come descritto in precedenza.Infine, rimuovere delicatamente i coverslip dalle pozzette e montarli su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio contenente un reagente antifade.L'adesione cellulare e lo sviluppo dei fibroblasti sono stati osservati entro 48 ore dal passaggio in fiasche di coltura piccole e grandi. Quando le fiasche appena seminate venivano perturbate, si verificava un calo dell'adesione cellulare, che portava a colture con crescita più lenta e, talvolta, a mancata adesione o crescita.Le cellule hanno raggiunto circa l'80% di confluenza entro una settimana e hanno formato un monostrato in 10-14 giorni. Le colture infette hanno mostrato segni di ridotta integrità della forma cellulare e la presenza di quelle che sembravano grandi perforazioni sulle superfici cellulari a 48 ore dall'infezione. Le cellule si sono ridotte di dimensioni e staccate dalla superficie della coltura circa 72-96 ore dopo l'infezione con HOCV-one non diluito. I conteggi medi di cellule vive sono stati riportati in grafico per evidenziare le differenze nell'abbondanza di cellule vive tra i diversi carichi virali nel tempo. I gruppi trattati con carica virale più elevata mostrano un declino molto più marcato nella salute della coltura, con un forte calo nel numero di cellule vive tra 48 e 72 ore. I gruppi con carica virale più bassa, invece, hanno mostrato un declino lento fino a un crollo intorno alle 144 ore. La probabilità di sopravvivenza delle cellule inoculate con cariche virali più elevate è risultata inferiore, come dimostrato dalle curve di Kaplan-Meier, in correlazione con le analisi del conteggio medio di cellule vive. Sebbene non significativo, i dati suggeriscono che le cellule esposte al virus abbiano un 88% in più di probabilità di mostrare tassi di sopravvivenza più bassi nel tempo. Il declino nel numero di nuclei presenti, insieme all'aspetto alterato dell'f-actina nelle cellule esposte a HOCV-one, indica un impatto significativo sulla coltura.Le cellule sane esposte al carico virale più elevato, pari a 10, hanno mostrato un maggiore stato di sofferenza. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di completare ogni passaggio del protocollo in modo tempestivo, poiché alcuni passaggi sono sensibili al tempo e alla temperatura. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come l'ELISA possono essere utilizzati per rispondere a domande fondamentali, ad esempio: quanta quantità di virus è presente in una coltura cellulare dopo l'inoculazione di diverse quantità di virus? Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare una linea cellulare di insetto per replicare un virus a RNA, estrarre tale virus e quindi quantificarlo mediante qRT-PCR.

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