Vibratome sezionamento mouse Retina preparare Culture fotorecettori

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare lo strato di fotorecettori del topo. Per la coltura, il primo passo è ottenere una retina piatta completa e sigillarla su un blocco di gelatina. Successivamente, gli strati retinici vengono tagliati con successo per isolare lo strato dei fotorecettori.

Il passaggio finale consiste nel seminare cellule fotorecettrici purificate in coltura. Infine, la purezza dello strato di fotorecettori viene confermata dalla microscopia e dall'immunofluorescenza, seguite dal test del fattore di vitalità del cono derivato dai bastoncelli. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la micro dissezione laser, è quello di isolare con sicurezza lo strato di fotorecettori.

Le implicazioni di questa tecnologia si estendono alla terapia della degenerazione retinica ereditaria. Poiché è molto conveniente studiare la biologia dei fotorecettori, avevamo originariamente sviluppato questo metodo per studiare l'interazione cellulare tra i fotorecettori dei bastoncelli e quelli freddi. Il trapianto del fotorecettore di strato nell'occhio del primo mar. ha portato all'identificazione di tutti i fattori di vitalità derivati.

La dimostrazione visiva di questi metodi è fondamentale in quanto l'opportunità della retina di montagna piatta è difficile da eseguire perché è complicata. Prima di isolare la retina, preparare il vibrato. Inizia con piatti di soluzione di gelatina al 20% tolti dalla conservazione a quattro gradi Celsius.

Tagliate la gelatina con un bisturi, poi capovolgete la fetta di gelatina e incollatela sul disco nero di supporto del vibratore usando una goccia di super colla. Quindi, rompi una lama di rasoio in due metà e inserisci una metà nel vibratore. Quindi inserire il disco di supporto nero sull'apparecchio vibratore e ruotare la manopola nera verso destra.

Ora, fissare il recipiente di supporto alla testa del vibrato e coprire il blocco di gelatina con un mezzo indipendente dalla CO2. Accendi il vibrato per testare la configurazione. Tagliare tre fette da 100 micron fino a quando l'affettatura è liscia e si producono fette piatte.

Dopo aver raccolto gli occhi da un topo e altri preparati, isolare la retina. Per prima cosa, usa un ago calibro 18 per fare un foro a livello dell'arto dell'occhio. Quindi, per rimuovere il corpo ciliare, inserire le forbici diritte attraverso il foro e nel globo oculare e tagliare con cura la sclera sotto l'iride, e poi lungo il perimetro del globo oculare.

Successivamente, mantieni la parte posteriore dell'occhio con la retina contigua alla sclera e rimuovi la cornea e il cristallino. Con due impugnature sottili, rimuovere il vitreo, che è attaccato alla retina senza danneggiare la retina in modo che la retina possa essere appoggiata in piano. Fai quattro tagli radiali.

Ora capovolgete il globo oculare e sbucciatelo come un'arancia. Quindi, con molta attenzione con le forbici dritte fini. Staccare la retina dalla sclera e dall'epitelio pigmentato retinico.

Dovrebbe rimanere attaccato a livello del nervo ottico usando prese sottili, staccare il vitreo rimanente partendo dalla periferia e spostandosi verso il centro della retina. Con tutto il vitreo completamente rimosso, la retina si appiattirà. Ora trasferisci la retina in una capsula di Petri di 35 millimetri di diametro.

Il processo di sigillatura della retina piatta nel blocco di gelatina è delicato e fondamentalmente l'aspetto più impegnativo del sezionamento del tessuto. Per prima cosa, rimuovere da 20 a 30 millilitri di terreno dal serbatoio vibram. In secondo luogo, trasferire la retina su un vetrino utilizzando una pipetta di plastica a foro largo e applicare una goccia di mezzo indipendente dalla CO2 sul vetrino.

In terzo luogo, trasferisci la retina in una fetta di gelatina con un fotorecettore rivolto verso il basso. In quarto luogo, attacca la retina al blocco di gelatina. Iniettare delicatamente il 4% di gelatina calda su un lato del blocco tra la retina e il blocco di gelatina ed espellere la gelatina sull'altro lato.

Infine, aspirare la gelatina con una pipetta di vetro e attendere da sette a 10 minuti mentre la retina è sigillata nel blocco. Ora aggiungi il mezzo indipendente dalla CO2 al serbatoio e immergi il blocco e la lama per il sezionamento partendo dalla parte superiore del blocco di gelatina. Tagliare sezioni seriali da 100 micron fino a quando la lama raggiunge la retina.

Quindi, utilizzando una velocità molto bassa, come uno o due tagli da 100 a 120 micron di sezioni dello strato interno della retina. A seconda dell'applicazione, questo strato può essere scartato o immagazzinato in azoto liquido, mantenendo la velocità lenta all'interfaccia tra lo strato interno ed esterno. Prendi sezioni da 15 micron.

Esamina queste sezioni al microscopio per la presenza di vasi sanguigni. Quando non ce ne sono, la retina esterna è stata raggiunta attraverso lo strato esterno. Tagliare lentamente sezioni da 200 micron.

Trasferisci queste fette in un piatto da 35 millimetri con tre millilitri di terreno freddo, indipendente dalle emissioni di CO2, tenuto in ghiaccio. Procedere con la raccolta di tutte le sezioni dello strato di fotorecettori da tutte le retine da sezionare in questo piatto. Inizia trasferendo i fotorecettori affettati in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi, utilizzando una pinza, separare delicatamente ogni strato di fotorecettore dalla gelatina e trasferirli in un nuovo piatto riempito con tre millilitri di soluzione di ringer a temperatura ambiente. Una volta isolati tutti i fotorecettori dalla gelatina, unire due unità di papaina con 25 microlitri di soluzione attivatrice in una provetta sterile di polipropilene da cinque millilitri e incubare per 30 minuti. Per attivare la papaina durante questa incubazione, tagliare le fette dello strato di fotorecettore in pezzi quadrati di due millimetri e non molto più piccoli.

Trasferire questi pezzi in una provetta da cinque millilitri con 1,5 millilitri di soluzione di ringer. Quindi aspirare le suonerie e sostituirle per un secondo lavaggio. Attendere che tutte le fette si depositino per gravità, sedimentazione, quindi rimuovere tutta la soluzione di suoneria rimanente dal tubo.

Successivamente, aggiungere 475 microlitri di soluzione di ringer al tubo contenente la papaina attivata e mescolare. Trasferite questo composto nella provetta contenente le fette e incubatele per 20 minuti. Dopo 20 minuti, fermare la digestione della papaina aggiungendo un millilitro di FCS al 10% in DMEM.

Quindi aggiungere 25 unità di D Ns.One per digerire il DNA dalle cellule fotorecettrici che sono morte, omogeneizzare accuratamente la sospensione con pipettaggio per palate delle cellule fotorecettrici. Centrifugare la provetta a 115 Gs per sei minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante e risospendere le cellule in DMEM integrato utilizzando una pipetta da un millilitro. Ripetere l'operazione, centrifugare e resus sospensione. Una volta.

Ora, dall'occhio raccolto, da una a 1,5 milioni di cellule dovrebbero essere pronte per la semina. Seminarli a 100.000 cellule per centimetro quadrato e coltivarli per cinque giorni prima delle applicazioni a valle Utilizzando i metodi descritti, le colture di cellule fotorecettrici sono state realizzate da topi wild type all'ottavo giorno postnatale. Senza FCS, le cellule sono state fissate e colorate per l'anti fila o un marcatore precedente anti cedimento.

Un minor numero di cellule era positivo per l'anti fila poiché SAG precede l'espressione di ROE. I fotorecettori sono stati preparati anche da topi di 35 giorni per esaminare l'espressione dell'mRNA, del sag RO e del cono che trasduce GA due. Questi geni si esprimono in modo più prominente nei fotorecettori rispetto all'intero cervello.

G NAT due è espresso specificamente dai coni. L'espressione proteica di RO e g. NAT two nei fotorecettori è stata esaminata confrontando le cellule dello strato dei fotorecettori con le cellule dello strato retinico interno.

Questo è stato fatto con topi wild type e con topi mutanti RD. I topi mutanti non hanno mostrato alcuna espressione di nessuna delle due proteine al giorno 35. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere un adeguato strato di fotorecettori purificato.

Questa tecnica può essere eseguita in circa cinque o sei ore per quattro-otto retine se viene eseguita correttamente dopo questa procedura. Inoltre, metodi come il sangue occidentale possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come l'espressione proteica durante la degenerazione dei fotorecettori dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia retinica per studiare il trascritto, il proteoma e il metabolismo di modelli animali rilevanti.