Name: Vibratome sezionamento mouse Retina preparare Culture fotorecettori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Impara a isolare lo strato dei fotorecettori dalla retina murina utilizzando il vibratomo per colture cellulari. Questa tecnica consente studi approfonditi sulla biologia retinica e potenziali applicazioni terapeutiche per degenerazioni ereditarie.

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Igal Gery e David Hicks per gli anticorpi anti-SAG. Ram Fridlich per aver letto il manoscritto.

NOTA: La procedura è stata approvata dal comitato etico Darwin presso l&#39;Università Pierre e Marie Curie (CE5 / 2009/048) 1. Preparazione di gelatina Solution, Instruments, Vibratome, Culture Media and Culture Piastra <ol><li> Preparare una soluzione al 20% di gelatina almeno un giorno prima dell&#39;esperimento. <ol><li> Sotto il cofano, aggiungere 500 ml di gentamicina [10 mg / ml] a un flacone da 500 ml contenente CO 2 media indipendenti (CO 2 -i). </li><li> In un becher separato, aggiungere 20 ml di CO2-I (dal punto 1.1.1) e scaldare a 95 ° C su una piastra riscaldante con agitazione costante per 15 min. Osservare un cambiamento di colore giallo, che indica che la soluzione è pronta per un ulteriore uso. </li><li> Pesare 4 g di gelatina e gradualmente poveri alla soluzione preparata sopra (punto 1.1.2) con maggiore agitazione e riscaldamento a 95 ° C per 45 min, per ottenere una soluzione di colore giallo. Lasciare che la soluzione di gelatina raffreddare sottocappa per circa 5 min. </li><li> Versare 4 ml della soluzione di gelatina in 35 mm di diametro piastre di coltura senza introdurre bolle d&#39;aria. Mantenere il piatto a 21 ° C per 30 min. Coprire i piatti con pellicola di plastica, e girare i piatti a testa in giù. Facoltativamente, memorizzare i piatti a 4 ° C per un massimo di 2 mesi prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare una soluzione di gelatina 4%. <ol><li> Sotto il cofano, aggiungere 25 ml di CO 2 media -i in un contenitore di plastica sterili, e scaldare a 42 ° C su una piastra riscaldante. Rimuovere il supporto dal gruppo di riscaldamento e gradualmente aggiungere 1 g di gelatina al mezzo caldo e mescolate. Ritornare rapidamente il contenitore sul blocco di riscaldamento (42 ° C) e mantenere caldo durante il processo. </li></ol></li><li> Impostazione-up dell&#39;apparato vibratome: <ol><li> Rimuovere i piatti contenenti soluzione di gelatina 20% conservato a 4 ° C. Tagliare la gelatina con un bisturi. Capovolgere la fetta gelatina e incollarla sul disco sostegno nera del vibratome utilizzando una goccia di scolla uper. </li><li> Rompere una lama di rasoio in due metà, una metà e inserire nella presa vibratome possesso. Inserire il disco di supporto nero sul dell&#39;apparato vibratome. Ruotare la manopola nera sul lato destro. Fissare la presa tenendo sulla testa del vibratome. Aggiungere sufficiente quantità di CO 2 media -i nel serbatoio vibratome per coprire il blocco di gelatina. </li><li> Accendere il vibratome e tagliare tre 100 micron fette di blocco di gelatina. Mantenere il blocco di gelatina per un ulteriore uso. </li></ol></li><li> Preparare 40 ml di terreno di coltura: <ol><li> Preparare modificata medio Dulbecco Eagle (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FCS) sotto il cofano. Preparare 1 mg / ml poli-D-lisina utilizzando tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4. </li><li> In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 2 mg / cm 2 di Poly-D-lisina per rivestire il fondo dei pozzetti. Incubare la piastra per 45 min a 37 ° C entro 5% CO 2 incubatore. Dopo l&#39;incubazione, rimuovere PBS e sostituirlo con 200 microlitri/ Pozzetto DMEM e posto nuovamente a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 2. dissezione intera Retina <ol><li> Enucleare il mouse: <ol><li> Sacrifica il mouse in base alla direttiva europea 2010/63: per dislocazione cervicale. Tagliare la testa con curve-forbici e collocarlo in un diametro di 100 millimetri Petri piatto dopo aver disinfettato l&#39;occhio con un disinfettante. </li><li> Rimuovere l&#39;occhio dopo aver staccato il nervo ottico sezionando molto attentamente con una presa curva. Poi posto entrambi gli occhi in una capsula di Petri 35 millimetri contenente sterile CO 2 media -i a 21 ° C. </li></ol></li><li> Rimozione della retina: <ol><li> Effettuare un foro a livello dell&#39;occhio arto con l&#39;aiuto di un ago 18 G per poter introdurre le forbici nel globo dell&#39;occhio. Introdurre forbici diritte all&#39;interno del foro e tagliare attentamente la sclera sotto dell&#39;iride su tutto il perimetro del globo oculare per rimuovere corpo ciliare. </li><li&gt; Rimuovere la cornea e la lente e mantenere la camera posteriore dell&#39;occhio con la retina contigua alla sclera. Con due impugnature sottili, rimuovere il vitreo situato all&#39;interno della camera posteriore senza danneggiare la retina. Eseguire quattro tagli radiali (retina / sclera) per consentire appiattimento della retina. </li><li> Ripresa il globo oculare e la buccia come un &quot;orange&quot;. Staccare la retina dalla sclera e retina epitelio pigmentato (RPE). Rimuovere la retina ancora attaccato a livello del nervo ottico molto accuratamente con sottili curve-forbici. </li><li> Rimuovere il vetrosa rimanente dalla periferia verso il centro della retina con due impugnature fini. Assicurarsi che tutto il vitreo è completamente rimosso per permettere l&#39;appiattimento della retina. </li><li> Tagliare l&#39;estremità di una pipetta di plastica e trasferire la retina ad un diametro Petri piatto da 35 mm avente CO 2 medio -i con la pipetta di plastica. </li></ol></li></ol> 3. tenuta di Flat-mounted Retina su gelatina Block <ol><li> Rimuovere 20 - 30 ml di CO 2 medio -i dal serbatoio vibratome (blocco di gelatina è libero) per consentire la saldatura di retina piatto montato. </li><li> Trasferire la retina di un vetrino con una pipetta di plastica e aggiungere una goccia di CO 2 medio -i prima del trasferimento alla porzione di gelatina con il fotorecettore rivolto verso il basso sulla fetta gelatina. </li><li> Fissare la retina al blocco di gelatina iniettando leggermente riscaldato 4% di gelatina su un lato del blocco tra la retina e il blocco di gelatina e contemporaneamente espellere gelatina calda sull&#39;altro lato. </li><li> Aspirare 4% di gelatina con una pipetta Pasteur. Attendere 10 minuti per consentire tenuta totale. Aggiungere CO 2 medio -i immergere il blocco e la lama completamente. </li></ol> 4. sezionamento il Retina NOTA: Questo passaggio è fondamentale per ottenere uno strato di fotorecettori senza le altre cellule retiniche (Figura 1). <ol><li> Partendo dall&#39;alto sul blocco di gelatina, tagliare 100 micron sezioni seriali di raggiungere la retina. Poi tagliare 100 - 120 micron sezioni dello strato interno. A seconda dell&#39;applicazione, questo strato può essere scartata o conservato in azoto liquido. Assicurarsi che la velocità del vibratome è molto lenta (a 1 o 2) durante il sezionamento dello strato o strati interni fotorecettori. </li><li> Eseguire intermedi 15 micron sezioni della retina corrispondente alla interfaccia tra l&#39;interno e l&#39;esterno della retina. Osservare questa sezione al microscopio. L&#39;assenza di vasi sanguigni indica che la retina esterno è stato raggiunto. </li><li> Tagliare 200 micron della retina esterna (strato fotorecettori) con gelatina e trasferirlo ad un piatto diametro 35 mm riempito con 3 ml di CO 2 media -i. Tenerlo in ghiaccio fino ad ottenere tutte le sezioni strato dei fotorecettori di tutte le retine. </li></ol> 5. Le cellule Dissociante fotorecettori <ol><li> Prendete il piatto (es) contenente lo strato fotorecettore (s) e metterlo (loro) in un incubatore a 37 ° C per 10 min. </li><li> Uso pinze separano delicatamente lo strato dei fotorecettori della gelatina e trasferire in un nuovo piatto riempito con 3 ml di soluzione di Ringer. Ripetere questa operazione (5.2) per ogni preparazione strato dei fotorecettori. </li><li> Incubare 2 unità di papaina con 25 ml di soluzione di attivatore (1.1 mM EDTA, 5,5 mM L-cisteina; 60 mM β-mercaptoetanolo) in 5 ml polipropilene provetta sterile ed incubare 30 min a 37 ° C entro 5% CO 2 incubatore . L&#39;attivazione di papaina è ottenuta a 37 ° C. Durante questa incubazione, tagliare il livello dei fotorecettori in 2 mm 2 pezzi (non troppo piccoli) e trasferire questi pezzi in un 5 ml provette. </li><li> Sciacquare la retina due volte con 1,5 ml di soluzione di soluzione di Ringer seguita da sedimentazione per gravità. Rimuovere tutta la soluzione di Ringer residua dal tubo con il campione. </li><li> Aggiungere 475 ml di soluzione di Ringer alla provetta contenente papaina attivato e mix. Aggiungere questa soluzione alla provetta contenente la retina. </li><li> Incubare la provetta con la retina per 20 min a 37 ° C entro 5% CO 2 incubatore. Arrestare la reazione aggiungendo 1 ml di 10% FCS in DMEM. Aggiungere 25 U di deossiribonucleasi I (DNAsi I) al DNA digerito dalle cellule morte. Omogeneizzare accuratamente la sospensione cellulare con un 1 ml-pipetta. Spin a 50 g per 6 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante per rimuovere tracce di siero e aggiungere terreno DMEM con integratori (vedi tabella reagents_equipment specifico) alla cella-pellet e risospendere accuratamente la sospensione cellulare con una pipetta 1 ml. Spin a 50 g per 6 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questa operazione (5.7), una volta di più. </li></ol> 6 Celle Culturing fotorecettori <ol><li> Lo strato fotorecettore di un mouse PN8 contiene circa 1-1.500.000 cellule usando questa tecnica. Seme le cellule visive a 1x 10 5 cellule / cm 2 in una piastra di coltura con terreno di coltura e coltivare le cellule per 5 giorni a 37 ° C a meno di 5% CO 2 incubatore. Il giorno 5, procedere al dell&#39;immunochimica e metodi di studio seguendo blotting occidentali offerti dai fornitori di anticorpi. NOTA: I passaggi per fermare la cultura e le prove preliminari sono descritti in riferimento 21. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La retina è un modello di organo in biologia. Studio della retina ha portato a 6 grandi scoperte nel campo della biologia. È all&#39;origine del primo gene soppressore del tumore RB1. Rivela il legame molecolare tra le tirosin chinasi del recettore e delle MAP chinasi attraverso l&#39;interazione con il figlio di Sevenless. E &#39;stato coinvolto nella scoperta PAX6, il primo gene di controllo principale per organo morfogenesi. E &#39;al centro della associazione genetica del fattore complemento H (CFH) con degenerazione maculare legata all&#39;età (AMD), il primo gene di suscettibilità malattia identificata da schermo genoma a livello di associazione (GWAS). Infine, ha portato alla prima terapia genica efficace per amaurosi congenita di Leber, la prima prova di correzione terapia genica nell&#39;uomo di una malattia ereditaria. La struttura di questo organo è conservato nella maggior parte delle specie di vertebrati. La sua accessibilità per la manipolazione in vivo ha incoraggiato presto genomica funzionale indagini su questa parte integrante del central sistema nervoso. Mostriamo qui come separare lo strato fotorecettore dallo strato interno della retina da vibratome sezionamento. Questo passaggio è fondamentale per ottenere colture pure fotorecettori. Il nostro protocollo dissezione rende la contaminazione da parte di cellule RPE molto improbabile. Uno dei principali problemi è l&#39;appiattimento della retina che è necessario per la sezione correttamente l&#39;interno e l&#39;esterno della retina. Il sezionamento della retina è migliore retina con piccolo diametro come quelli di roditori e questo diametro è una limitazione della tecnica attuale con materiale disponibile. Si consiglia prima di iniziare un esperimento biologicamente significativo, a praticare su un campione della retina. Illustriamo il metodo con risultati rappresentativi ottenuti da cellule visive in coltura, utilizzando il materiale per eseguire studio di espressione di entrambi gli mRNA e proteine. Gli studi di espressione possono essere eseguite anche alternativamente su sections ottenuti microdissezione laser, ma le culture sono più effettuate utilizzando vibratome sezionamento. Abbiamo potuto usare la tecnica del laser microdissezione con una strategia completamente differente. Ma, per raccogliere lo strato fotorecettore agli apparecchi microdissezione cultura, sarebbe necessario evitare fissativo e questo complicherebbe l&#39;attuale metodologia significativamente. Stiamo sviluppando un protocollo volto a studiare la cinetica di espressione genica e proteica in vibratome sezioni durante la degenerazione dei fotorecettori in modelli di retinite pigmentosa. Noi crediamo che la descrizione dettagliata del protocollo sarà utile per i ricercatori nel campo della biologia della retina, e più in particolare per gli studi di proteomica e metabolomica.

La retina è parte integrante del sistema nervoso centrale che ha una architettura conservata tra i vertebrati. I neuroni della retina neurale sono organizzati in strati, con la più lontana per la luce incidente, lo strato dei fotorecettori in stretto contatto con l&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) nella parte posteriore dell&#39;occhio. Rod e cono photorecptors sono cellule sensibili alla luce che si basano su molecole sensibili opsin per la cattura di fotoni. Queste molecole sono racchiusi su membrane disco di una struttura cellulare, che si trova sul segmento esterno del fotorecettore che punta nella direzione del RPE 1. La struttura, che è più spesso colpiti molto presto in casi di degenerazione dei fotorecettori, si rinnova al tasso del 10% ogni giorno. Il cosiddetto strato interno contiene la maggior parte degli altri neuroni che calcolano il segnale ricevuto dai fotorecettori, bipolare, amacrine e cellule orizzontali e le cellule gangliari. Questi ultimi con i loro assoniformare un fascio che è il nervo ottico. Questa stratificazione è così conservato che i biologi hanno usato le cellule amacrine termine spostato quando le cellule sono al di fuori dello strato plessiforme interno 2. Strati di neuroni sono distribuiti all&#39;interno di un indotto di cellule gliali radiali Müller. Cellule bipolari collegano fotorecettori di cellule gangliari. Si trovano tra lo strato plessiforme esterno e lo strato plessiforme interna. Le cellule gangliari formano lo strato plessiforme interna in connessione con le cellule bipolari. Le cellule amacrin sono denominati come cellule associazione situate nello strato plessiforme interno tra le cellule bipolari e le cellule gangliari. Lo strato plexiform esterno contiene cellule orizzontali. Questa disposizione unica di strati neuronali del sistema nervoso centrale permette l&#39;isolamento dello strato di fotorecettori dallo strato cellulare interna mediante tranciatura retina piatto montato utilizzando un vibratome. In origine, questa tecnica è stata utilizzata per isolare fotorecettori per transplantation nell&#39;occhio del mouse RD1, un modello di retinite pigmentosa umana (RP) 3. Il mouse RD1 presenta una mutazione nel gene recessivo Pde6b che codifica per la subunità beta specifica fosfodiesterasi-rod. Mutazioni recessive di questo risultato gene in RP nell&#39;uomo 4. Dopo bastoncelli sono degenerati, il paziente perde la visione notturna, e fotorecettori sorprendentemente cono, che non esprimono il gene mutato, degenerano in una seconda fase. Poiché i coni sono necessari per la visione del colore e l&#39;acutezza visiva, i pazienti diventano progressivamente cieco e un trattamento efficace per la malattia non si è ancora sviluppato. Con l&#39;innesto strato dei fotorecettori da un topo wild-type la degenerazione cono del mouse dell&#39;host è in ritardo di 3,5. Le aste perse nel modello degenerativa dei coni non potrebbero essere sostituiti da un trapianto perché la connessione sinaptica tra aste e cellule bipolari può essere ottenuto solo in una fase specifica di rsviluppo etinal, segnato dalla comparsa di espressione Nrl 6. Lo strato di fotorecettori è introdotto dalla chirurgia nello spazio sub-retinica della retina RD1 asta inferiore, tra l&#39;RPE e la retina esterna corrispondente al solo 3% dei rimanenti fotorecettori, coni. Due settimane dopo l&#39;intervento, il 40% dei coni della animali trapiantati con un normale strato di fotorecettori sopravvissuto rispetto all&#39;animale trapiantato con un normale strato di cellule della retina interna, o per l&#39;animale sham-operati. La topografia della sopravvivenza cono, spread-out su tutta la superficie della retina mutato situato nella posizione del tessuto innestato indica che l&#39;effetto protettivo è dovuto ad una molecola diffusibile 7. Quindi, abbiamo usato un sistema di co-coltura, nonché mezzi di coltura condizionati per convalidare il fatto che l&#39;effetto di protezione si basa sulla secrezione di una proteina da aste 8,9. Noi ipotizziamo che questa proteina sarà Exprnon elaborato continuamente e in particolare da aste e che la loro morte durante la prima fase della malattia attiverà degenerazione cono secondario dalla perdita di un segnale di protezione da barre in maniera autonoma non-cella 10. Data l&#39;importanza di cono mediata visione centrale in primati questa proteina putativa sarà uno strumento terapeutico molto rilevanti per RP. Preservare i coni in RP sarebbe teoricamente prevenire un totale di 1,5 milioni di pazienti in tutto il mondo a diventare ciechi 11. Abbiamo usato un approccio di screening ad alto contenuto e un modello di cultura cono arricchita per identificare un cDNA codificante Rod-derivato Cone Viability Factor (RdCVF) da una libreria di cDNA retina 12. RdCVF è il prodotto impiombato del gene NXNL1 che, interessante è omologo al gene che codifica per le proteine ​​coinvolte nella tioredossina redox omeostasi 13. Il secondo prodotto impiombato del gene, RdCVFL è un enzima che protegge il suo bersaglio, la proteina TAU contro ossidativo dAmage 14. La somministrazione di RdCVF impedisce la degenerazione secondaria di coni e la perdita della loro funzione visiva in un recessivo, e il modello dominante della RP 12,15. Questo dimostra due aspetti importanti di questa innovativa strategia terapeutica 16. In primo luogo, può essere applicato nella maggior parte dei casi RP in maniera gene-indipendente. In secondo luogo, contrariamente al fattore concorrente CNTF, RdCVF sopravvivenza è associata con il mantenimento della funzione visiva 17. L&#39;assenza di effetto funzionale può spiegare il motivo dell&#39;assenza di beneficio clinico della somministrazione di CNTF a pazienti RP 18. RdCVF è molto probabilmente uno del segnale di sopravvivenza importante tra i coni ei bastoncelli dal soccorso cono in vitro è inibita da RdCVF immunodeplezione 12. Inoltre, l&#39;interruzione del gene redditività cono asta derivato comporta fotorecettori erettile e suscettibilità allo stress ossidativo 19. L&#39;uso distrato fotorecettore è all&#39;origine di identificazione di RdCVF e di un segnale redox romanzo coinvolti nelle patologie neurodegenerative 20. Questo manoscritto descrive il protocollo utilizzato per isolare e le cellule di coltura dallo strato fotorecettore per caratterizzare l&#39;attività di RdCVF. I fotorecettori possono essere mantenute in coltura per 5 a 7 giorni 21. Questa tecnica può anche essere usato per studiare l&#39;espressione di geni specifici fotorecettori.

<table><tbody><tr><td>Citidina 5&prime;-difosfocolina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0256</td><td>4.7 &micro; M Citidina 5&prime;-difosfocolina</td></tr><tr><td>Citidina 5&prime;-difosfoetanolammina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0456</td><td>2.7 &micro; M Citidina 5&prime;-difosfoetanolammina</td></tr><tr><td>Linole&iuml; acido c/ albumina sierica bovina (BSA)*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8384</td><td>100 &micro; g/ml linole&iuml; acido c/ albumina sierica bovina (BSA)</td></tr><tr><td>Triiodo-L-tironina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>0,03 &micro; M Triiodo-L-tironina</td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti</td><td>Greiner bio-one</td><td>655-095</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binoculare</td><td>Leica</td><td>MZ-75</td><td></td></tr><tr><td>CO2 indipendente (CO2-i)</td><td>Life Technologies</td><td>18045054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Pinze n&deg; 5 Dumont</td><td>Bionic</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina da pelle di porcino di tipo A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>U74v2</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gentamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortison*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>0,55 &; M idrocortisone</td></tr><tr><td>Insulina* (I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0,86 &micro; M insulina (I)</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington-biochimica</td><td>WOLS03124</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556&nbsp;</td><td>2.0 &micro; M progesterone</td></tr><tr><td>prostaglandina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5172</td><td>0,28 &micro; M prostaglandina</td></tr><tr><td>Putrescina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>182 &micro; M putrescine</td></tr><tr><td>Bisturi Albion</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Forbice</td><td>Moria</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM piruvato di sodio</td></tr><tr><td>Selenito di sodio* (S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.29 &micro; M Na2SeO3&nbsp; &nbsp; (S)</td></tr><tr><td>Taurina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td>3 mM taurina</td></tr><tr><td>Transferrina* (T)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.07 &micro; M transferrina (T)</td></tr><tr><td>Apparecchio per vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1000-S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Supplementi</td></tr></tbody></table>

vibratome sezionamento mouse retina preparare culture fotorecettori

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

La retina è una parte del sistema nervoso centrale che ha organizzato architettura, con i neuroni in strati dai fotorecettori, sia canne e coni a contatto con l&#39;epitelio pigmentato retinico nella parte più lontana sulla retina considerando la direzione della luce, e la cellule gangliari nella distanza più prossimale. Questa architettura permette l&#39;isolamento dello strato di fotorecettori da vibratome sezionamento. La retina neurale sezionato di un mouse età compresa tra 8 giorni è di piatto incorporato in 4% di gelatina sopra di una fetta del 20% di gelatina strato fotorecettori rivolto verso il basso. Utilizzando un vibratome e una lametta a doppio taglio, la fitta retina interna 100 micron viene sezionato. Questa sezione contiene le cellule gangliari e lo strato interno con particolare le cellule bipolari. Una sezione intermedia di 15 micron viene scartato prima 200 micron della retina esterna contenente i fotorecettori viene recuperato. La gelatina è rimosso mediante riscaldamento a 37 ° C. Pezzi di strato esterno sono incubazioneted in 500 ml di soluzione di Ringer con 2 unità di papaina attivato per 20 minuti a 37 ° C. La reazione viene bloccata per aggiunta di siero bovino fetale al 10% 500 microlitri (FCS) in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), poi 25 unità di DNAsi I è aggiunto prima centrifugazione a RT, lavato più volte per rimuovere siero e le cellule sono risospese in 500 ml di DMEM e seminato a 1 x 10 5 cellule / cm 2. Le cellule sono coltivate a 5 giorni in vitro e la loro vitalità valutato con test dal vivo / morto. La purezza della coltura viene determinata mediante osservazione microscopica durante l&#39;esperimento. La purezza viene poi convalidata da semina e fissare le cellule su un vetrino istologico e l&#39;analisi con un policlonale di coniglio anti-SAG, un marcatore fotorecettore e mouse monoclonale anti-RHO, un marcatore specifico asta fotorecettori. In alternativa, lo strato di fotorecettori (97% barre) può essere utilizzato per l&#39;analisi di espressione genica o proteica e per il trapianto.

A parte il trapianto, gli strati fotorecettori sono stati utilizzati anche per studiare la segnalazione cellulare mediante la semina di cellule per fare culture visive 12,22. Inoltre, essi sono utilizzati per studiare l'espressione genica e circadiano 23,24 ritmo. Abbiamo usato lo strato fotorecettore cellula da un topo wild-type al giorno postnatale 8 per preparare culture fotorecettori in assenza di FCS e mantenuto le cellule per 5 giorni a 37 ° C in un incubatore con 5% di CO 2 (Figura 1E ). Le cellule sono state poi fissate con 4% paraformadehyde e poi proceduto per l'analisi immunocitochimica utilizzando metodi offerti dai fornitori di anticorpi sia con il mouse monoclonale anti-RHO (1: 250, Millipore Mab5316) o policlonale di coniglio anti-SAG (1: 200, una generosa dono di Igal Gery e David Hicks). Abbiamo usato anti-RHO e anti-SAG (anche se anti-SAG coni label, bacchette) a causa del fatto che l'anti-SAG è un marcatore precedente, di anti-RHO. La proporzione di cells positivi per l'anticorpo anti-RHO è inferiore rispetto a quelli positivi per gli anticorpi anti-SAG (Figura 2). Ciò può essere spiegato dal fatto che SAG, l'arrestina asta è espressa anche da coni che rendono 3% dei fotorecettori nello strato isolate, oppure dal fatto che durante la maturazione postnatale della retina, l'espressione di SAG precede quella di RHO 25,26. Lo strato dei fotorecettori è stato anche utilizzato per monitorare la specifica espressione di geni dal fotorecettori del wild-type retina e il cervello di animali di età 35 giorni RNA è stato predisposto utilizzando CsCl ultracentrifugazione 27 e ibridato per il mouse DNA chip Array. I messaggeri di rodopsina (Rho), S-arrestina (Sag) e il cono-transducina (Gnat2) sono espressi in particolare nella retina rispetto al cervello (Figura 3A). L'espressione è prominente nello strato fotorecettori (PR) rispetto all'intera retina che comprendelo strato interno della retina che mostra che questi geni sono espressi in effetti dai fotorecettori. Per Gnat2, l'espressione relativa rispetto a Rho e Sag mostra che è espressa da coni contenute all'interno dello strato fotorecettore isolato. L'espressione di recoverin (Rcvrn) nello strato fotorecettore rispetto all'intera retina è aumentata (Figura 3B). Lo strato dei fotorecettori è stato anche utilizzato per monitorare l'espressione di RHO e GNAT2 utilizzando western blotting seguente modalità previste dai fornitori di anticorpi e di confrontare il livello della retina interna (Figura 4). Si noti l'assenza di RHO e GNAT2 28, i marcatori di coni e bastoncelli, rispettivamente, in tutto retina e nella retina di topo rd1 al giorno post-natale 35. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig1highres.jpg"> Fifigura 1. Vista schematica del sezionamento vibratome di topo retina. (A) Installazione della retina piatto montato con il fotorecettore rivolto verso il basso sulla fetta gelatina. (B) La sezione della retina interna con la lama vibratome. (C) La sezione della retina esterna aggiunta di gelatina. (D) Controllo la presenza di fotorecettori sul bordo del frammento di retina dopo l'isolamento dello strato di fotorecettori. Bar Scala utilizzata per fluorescenza verde è utilizzato un microscopio a luce bianca. I fotorecettori sono situati nel bordo dell'immagine. (E) fotorecettori coltivata (post-cinque giorni). (F) di ingrandimento superiore di pannello E. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" width="550"> Figura 2. espressione differenziale di RHO e SAG nella cultura del mouse fotorecettori. (A) colorazione dei nuclei (blu), (B) colorazione SAG (verde), (C) RHO colorazione (rosso). (D) uniti immagine. A causa colorazione dei SAG si esprime prima di RHO colorazione, solo due cellule sono doppie etichettati SAG e RHO (vedi *). Scala bar:. 23 micron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig3highres.jpg"> Figura 3. Confronto tra l'espressione di tre geni nel cervello e tutta la retina e fotorecettori degli animali wild-type di età compresa tra 35 giorni. (A) Rhodopsin (Rho), S-arrestina (Sag) e il cono-transducina (Gnat2). (B) calbindin (Calb1) e Recoverin (Rcvrn). I dati vengono visualizzati come espressione relativa. L'espressione relativa è un valore espressioneottenute da dati di microarray dopo normaliszation con il software robusto Multi-array media (RMA) disponibili nel database della conoscenza KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" width="400"> Figura 4. L'espressione di RHO e GNAT2 in retina esterna da una wild-type retina post-natale giorno 35. Assenza di loro espressione nella retina interna e nella retina del topo RD1 al post-natale giorno 35. ACTB, beta actina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Retina neurale del mouse età compresa tra 8 giorni è di sopra di un blocco di gelatina 4%. Dopo l&#39;isolamento dello strato di fotorecettori (200 micron) di vibratome, i fotorecettori sono seminate dopo dissociazione enzimatica meccanica e per la cultura. Lo strato dei fotorecettori può essere utilizzata per analisi biochimiche, molecolari o il trapianto.

Vibratome sezionamento mouse Retina preparare Culture fotorecettori

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare lo strato di fotorecettori del topo. Per la coltura, il primo passo è ottenere una retina piatta completa e sigillarla su un blocco di gelatina. Successivamente, gli strati retinici vengono tagliati con successo per isolare lo strato dei fotorecettori.Il passaggio finale consiste nel seminare cellule fotorecettrici purificate in coltura. Infine, la purezza dello strato di fotorecettori viene confermata dalla microscopia e dall'immunofluorescenza, seguite dal test del fattore di vitalità del cono derivato dai bastoncelli. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la micro dissezione laser, è quello di isolare con sicurezza lo strato di fotorecettori.Le implicazioni di questa tecnologia si estendono alla terapia della degenerazione retinica ereditaria. Poiché è molto conveniente studiare la biologia dei fotorecettori, avevamo originariamente sviluppato questo metodo per studiare l'interazione cellulare tra i fotorecettori dei bastoncelli e quelli freddi. Il trapianto del fotorecettore di strato nell'occhio del primo mar. ha portato all'identificazione di tutti i fattori di vitalità derivati.La dimostrazione visiva di questi metodi è fondamentale in quanto l'opportunità della retina di montagna piatta è difficile da eseguire perché è complicata. Prima di isolare la retina, preparare il vibrato. Inizia con piatti di soluzione di gelatina al 20% tolti dalla conservazione a quattro gradi Celsius.Tagliate la gelatina con un bisturi, poi capovolgete la fetta di gelatina e incollatela sul disco nero di supporto del vibratore usando una goccia di super colla. Quindi, rompi una lama di rasoio in due metà e inserisci una metà nel vibratore. Quindi inserire il disco di supporto nero sull'apparecchio vibratore e ruotare la manopola nera verso destra.Ora, fissare il recipiente di supporto alla testa del vibrato e coprire il blocco di gelatina con un mezzo indipendente dalla CO2. Accendi il vibrato per testare la configurazione. Tagliare tre fette da 100 micron fino a quando l'affettatura è liscia e si producono fette piatte.Dopo aver raccolto gli occhi da un topo e altri preparati, isolare la retina. Per prima cosa, usa un ago calibro 18 per fare un foro a livello dell'arto dell'occhio. Quindi, per rimuovere il corpo ciliare, inserire le forbici diritte attraverso il foro e nel globo oculare e tagliare con cura la sclera sotto l'iride, e poi lungo il perimetro del globo oculare.Successivamente, mantieni la parte posteriore dell'occhio con la retina contigua alla sclera e rimuovi la cornea e il cristallino. Con due impugnature sottili, rimuovere il vitreo, che è attaccato alla retina senza danneggiare la retina in modo che la retina possa essere appoggiata in piano. Fai quattro tagli radiali.Ora capovolgete il globo oculare e sbucciatelo come un'arancia. Quindi, con molta attenzione con le forbici dritte fini. Staccare la retina dalla sclera e dall'epitelio pigmentato retinico.Dovrebbe rimanere attaccato a livello del nervo ottico usando prese sottili, staccare il vitreo rimanente partendo dalla periferia e spostandosi verso il centro della retina. Con tutto il vitreo completamente rimosso, la retina si appiattirà. Ora trasferisci la retina in una capsula di Petri di 35 millimetri di diametro.Il processo di sigillatura della retina piatta nel blocco di gelatina è delicato e fondamentalmente l'aspetto più impegnativo del sezionamento del tessuto. Per prima cosa, rimuovere da 20 a 30 millilitri di terreno dal serbatoio vibram. In secondo luogo, trasferire la retina su un vetrino utilizzando una pipetta di plastica a foro largo e applicare una goccia di mezzo indipendente dalla CO2 sul vetrino.In terzo luogo, trasferisci la retina in una fetta di gelatina con un fotorecettore rivolto verso il basso. In quarto luogo, attacca la retina al blocco di gelatina. Iniettare delicatamente il 4% di gelatina calda su un lato del blocco tra la retina e il blocco di gelatina ed espellere la gelatina sull'altro lato.Infine, aspirare la gelatina con una pipetta di vetro e attendere da sette a 10 minuti mentre la retina è sigillata nel blocco. Ora aggiungi il mezzo indipendente dalla CO2 al serbatoio e immergi il blocco e la lama per il sezionamento partendo dalla parte superiore del blocco di gelatina. Tagliare sezioni seriali da 100 micron fino a quando la lama raggiunge la retina.Quindi, utilizzando una velocità molto bassa, come uno o due tagli da 100 a 120 micron di sezioni dello strato interno della retina. A seconda dell'applicazione, questo strato può essere scartato o immagazzinato in azoto liquido, mantenendo la velocità lenta all'interfaccia tra lo strato interno ed esterno. Prendi sezioni da 15 micron.Esamina queste sezioni al microscopio per la presenza di vasi sanguigni. Quando non ce ne sono, la retina esterna è stata raggiunta attraverso lo strato esterno. Tagliare lentamente sezioni da 200 micron.Trasferisci queste fette in un piatto da 35 millimetri con tre millilitri di terreno freddo, indipendente dalle emissioni di CO2, tenuto in ghiaccio. Procedere con la raccolta di tutte le sezioni dello strato di fotorecettori da tutte le retine da sezionare in questo piatto. Inizia trasferendo i fotorecettori affettati in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Quindi, utilizzando una pinza, separare delicatamente ogni strato di fotorecettore dalla gelatina e trasferirli in un nuovo piatto riempito con tre millilitri di soluzione di ringer a temperatura ambiente. Una volta isolati tutti i fotorecettori dalla gelatina, unire due unità di papaina con 25 microlitri di soluzione attivatrice in una provetta sterile di polipropilene da cinque millilitri e incubare per 30 minuti. Per attivare la papaina durante questa incubazione, tagliare le fette dello strato di fotorecettore in pezzi quadrati di due millimetri e non molto più piccoli.Trasferire questi pezzi in una provetta da cinque millilitri con 1,5 millilitri di soluzione di ringer. Quindi aspirare le suonerie e sostituirle per un secondo lavaggio. Attendere che tutte le fette si depositino per gravità, sedimentazione, quindi rimuovere tutta la soluzione di suoneria rimanente dal tubo.Successivamente, aggiungere 475 microlitri di soluzione di ringer al tubo contenente la papaina attivata e mescolare. Trasferite questo composto nella provetta contenente le fette e incubatele per 20 minuti. Dopo 20 minuti, fermare la digestione della papaina aggiungendo un millilitro di FCS al 10% in DMEM.Quindi aggiungere 25 unità di D Ns.One per digerire il DNA dalle cellule fotorecettrici che sono morte, omogeneizzare accuratamente la sospensione con pipettaggio per palate delle cellule fotorecettrici. Centrifugare la provetta a 115 Gs per sei minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante e risospendere le cellule in DMEM integrato utilizzando una pipetta da un millilitro. Ripetere l'operazione, centrifugare e resus sospensione. Una volta.Ora, dall'occhio raccolto, da una a 1,5 milioni di cellule dovrebbero essere pronte per la semina. Seminarli a 100.000 cellule per centimetro quadrato e coltivarli per cinque giorni prima delle applicazioni a valle Utilizzando i metodi descritti, le colture di cellule fotorecettrici sono state realizzate da topi wild type all'ottavo giorno postnatale. Senza FCS, le cellule sono state fissate e colorate per l'anti fila o un marcatore precedente anti cedimento.Un minor numero di cellule era positivo per l'anti fila poiché SAG precede l'espressione di ROE. I fotorecettori sono stati preparati anche da topi di 35 giorni per esaminare l'espressione dell'mRNA, del sag RO e del cono che trasduce GA due. Questi geni si esprimono in modo più prominente nei fotorecettori rispetto all'intero cervello.G NAT due è espresso specificamente dai coni. L'espressione proteica di RO e g. NAT two nei fotorecettori è stata esaminata confrontando le cellule dello strato dei fotorecettori con le cellule dello strato retinico interno.Questo è stato fatto con topi wild type e con topi mutanti RD. I topi mutanti non hanno mostrato alcuna espressione di nessuna delle due proteine al giorno 35. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere un adeguato strato di fotorecettori purificato.Questa tecnica può essere eseguita in circa cinque o sei ore per quattro-otto retine se viene eseguita correttamente dopo questa procedura. Inoltre, metodi come il sangue occidentale possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come l'espressione proteica durante la degenerazione dei fotorecettori dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia retinica per studiare il trascritto, il proteoma e il metabolismo di modelli animali rilevanti.

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Qui si descrive una soluzione economica per la cultura tecnica organotipica di retina suini adulti per sette giorni. In breve, una carta sterile filtro è stato usato per sollevare la retina neurale fuori dal RPE e fotorecettori lato posto su un inserto sollevata da una misura stand.

Cultura organotipica di tutto spessore Retina suina adulti

Questo protocollo descrive un modo semplice ed economico per quantificare l'attività del cis-elementi normativi (ad esempio, enhancer / promoter), nel vivere retine del mouse tramite elettroporazione espianto. Preparazione di analisi del DNA, la dissezione della retina, elettroporazione, cultura espianto della retina, e post-fissazione e la quantificazione sono descritti.

Quantificare le attività di Cis-Regolamentazione Elementi nella retina di topo Elettroporazione Espianto

Il protocollo qui descritto è per la valutazione strutturale di una preparazione retinica a montaggio intero. Ciò include le descrizioni della dissezione tissutale, il montaggio su un inserto di membrana in politetrafluoroetilene idrofilizzato (PTFE), il caricamento del bolo con marcatori fluorescenti e un confronto della fissazione con carbodiimmide e paraformaldeide per l'analisi immunoistochimica dei componenti cellulari e sinaptici.

Protocollo ottimizzato per la preparazione dell'intero montaggio retinico per l'imaging e l'immunoistochimica

Dimostreremo come preparare fette di retina dall'occhio del topo e registrare le risposte alla luce nei neuroni retinici. L'intera procedura viene eseguita in condizioni adattate al buio.

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

Descriviamo un protocollo per il monitoraggio Ca 2+ dinamiche nei terminali degli assoni dei fotorecettori cono con un ex-vivo la preparazione fetta della retina del mouse. Questo protocollo permette studi completi di cono Ca 2 + Segnalazione di un importante sistema modello mammiferi, il mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di mammifero adulto con il piano di sezionamento parallelo alla superficie della retina. campi dendritiche di neuroni della retina nonradially orientate non sono stati troncati, consentendo lo studio di elaborazione dei segnali con tecniche di patch-clamp e di imaging.

Preparazione di orizzontali Fette di topo adulto Retina per elettrofisiologiche Studi

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Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine

Questo lavoro presenta una preparazione alternativa della retina flatmount in cui la rimozione dei corpi cellulari dei fotorecettori consente una diffusione più rapida degli anticorpi e un migliore accesso con pipette patch ai neuroni retinici interni per esperimenti di immunoistochimica, ibridazione in situ ed elettrofisiologia.

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Criosezione e immunocolorazione della retina del topo

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En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Impara a isolare lo strato dei fotorecettori dalla retina murina utilizzando il vibratomo per colture cellulari. Questa tecnica consente studi approfonditi sulla biologia retinica e potenziali applicazioni terapeutiche per degenerazioni ereditarie.

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