Name: Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Impara a registrare coppie di neuroni sinapticamente connessi in fette organotipiche di ippocampo. Questa tecnica di patch clamp permette di isolare l'attività sinaptica in circuiti minimi per studiare le proprietà fondamentali della connettività neuronale.

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Vorremmo ringraziare i membri dei laboratori di Montgomery e Madison per l'utile discussione. Riconosciamo i finanziamenti ricevuti dalle seguenti fonti in questa ricerca: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC e NIH.

Etica Animale Dichiarazione: I protocolli descritti in questo manoscritto seguono le linee guida per la cura degli animali, istituito dall&#39;Università di Auckland e la Stanford University. P7 ratti sono stati sacrificati da una rapida decapitazione. Dissezione ippocampale viene quindi eseguita immediatamente come descritto di seguito. 1 Organotipica ippocampale Fetta Cultura <ol><li> Preparazione <ol><li> Preparare dissezione Media (utilizzato solo per sezionare il cervello). Unire 200 ml Minimum Essential Medium, 2 ml di soluzione di penicillina-streptomicina (10.000 unità di ciascuno, nel 0,85% NaCl), 5 ml di soluzione tampone HEPES, 2 ml di soluzione 1 M Tris (pH 7,2), e filtro sterilizzare con 0,22 micron filtro . Effettuare dissezione ippocampale in media dissezione ghiacciata. </li><li> Raffreddare il medium dissezione. Posizionare il supporto di dissezione nel congelatore circa 1 ora prima di iniziare la dissezione fino a quando il liquido è molto freddo. Non permettere grandi cr ghiaccioystals per formare. Conservare in ghiaccio fino al momento. </li><li> Preparare terreno di coltura (usato per tutto tranne la dissezione di ippocampi). Unire 100 ml Minimum Essential Medium, (concentrazione 1x, liquido) w / sali di Hank, w / L-glutammina, 2 ml di soluzione di penicillina-streptomicina (liquido, 10.000 unità di ciascuno, nel 0,85% NaCl), 2,5 ml di HEPES 1 M tampone soluzione, 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hank, 50 ml di siero di cavallo (definito, calore inattivato), e filtro sterilizzare con 0,22 micron filtro. </li><li> Preparare i piatti della cultura. Mettere 1 ml di coltura per 35 millimetri piatto di cultura, e aggiungere un inserto di membrana per ogni piatto. Mettere fino a sette di questi piatti in uno a 150 mm piastra di Petri (di seguito indicato come un &#39;piatto&#39;). Porre la piastra in un incubatore CO 2 per almeno un&#39;ora prima della dissezione inizia in modo che il terreno di coltura nei piatti raggiunge la giusta temperatura e pH. </li></ol></li><li> Dissezione del Hippocampi da Rat cuccioli a postnatale giorno 7 (P7) <ol><li> Pre-sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione sotto la luce UV prima della procedura. </li><li> Dopo una rapida decapitazione, rimuovere il cervello e il luogo in media refrigerate in un piatto, e poi rimuoverlo per un pezzo di carta da filtro inumidita per la dissezione. Tease la corteccia dal mesencefalo utilizzando smussate spatole in plastica rivestita lisce in miniatura, esponendo l&#39;ippocampo. Tagliare il fornice, e poi lavorare delicatamente la spatola sotto l&#39;ippocampo per capovolgere fuori (Figura 1A). NOTA: Riuscito culture fetta possono essere preparati utilizzando animali fino a P10. </li><li> Tagliare il ippocampo isolato dal resto del cervello. Trasferire il dell&#39;ippocampo in un nuovo piatto contenente i media dissezione refrigerata utilizzando un pennello morbido inumidito (ad esempio, bianco sable # 4). </li><li> Pulire la parte inferiore (cioè il lato piatto) dell&#39;ippocampo del plesso coroideo durante la dissezione, in quanto tali, tessuti meninge-come spugnosi rendono difficile separare ippocampaleFette una dall&#39;altra in seguito. NOTA: Lasciare questi tessuti in atto se non possono essere presi in giro dolcemente. </li><li> Eseguire l&#39;intero dissezione più rapidamente possibile senza danneggiare l&#39;ippocampo. NOTA: Un attento dissezione è più importante di un veloce, a patto che le condizioni sperimentali sono refrigerati. Affettare il ippocampi da tre ratti contemporaneamente. La salute fetta non è influenzata purché il tempo totale dall&#39;inizio a quando le fette placcati vanno in incubatore è sotto 30 min. </li></ol></li><li> Affettare <ol><li> Affettare le dell&#39;ippocampo trasversalmente in 400 micron sezioni utilizzando un&#39;affettatrice manuale dei tessuti. Il metodo con cui il taglio è condotta non è importante, purché non sia troppo dannoso per il tessuto e produce fette di spessore costante con l&#39;architettura laminare facilmente visibile (cioè corno di Ammon è facilmente visibile da conservare nel tessuto). </li><li> Lie il dell&#39;ippocampo sul palco del tessutochopper in cima a un triplo spessore di # 2 carta da filtro. Il ippocampi sono interamente a fette senza rimuovere alcun fette singolarmente (cioè l&#39;intero ippocampo è lasciato sulla scena del chopper fino a quando sono stati fatti tutti i tagli, ma piuttosto come pagnotte di pane a fette, a questo punto, Figura 1B). </li><li> Trasferire il ippocampi in mezzo dissezione con un pennello morbido di cui uno accanto ippocampo (bianco sable # 2). Spingere delicatamente ogni ippocampo di lato per rompere l&#39;adesione tra l&#39;ippocampo e la carta da filtro sottostante. Arrotolare la spazzola sotto ogni ippocampo a raccoglierla dal palco. Mettere tutti gli ippocampi nella stessa piastra da 35 mm di Petri di media dissezione refrigerata. Separare la ippocampi in singole sezioni agitando manualmente il piatto alternando movimenti in senso orario e antiorario. </li><li> Ispezionare le fette sotto un microscopio da dissezione e scartare qualsiasi che vengono danneggiati, piccola, o che non possiedono cellule chiaramente visibilestrati del corpo. NOTA: Sarà spesso il caso che non tutte le sezioni sono separate con successo dai loro fratelli in questo modo. In questo caso, essi possono essere separati da trasformandoli sul bordo e li incitamento con le punte di una pinza sottile. &quot;Good&quot; fette vengono poi trasferiti in un altro piatto di Petri pulita contenente medio dissezione refrigerata utilizzando un cut-off e il fuoco-lucidato pipetta Pasteur (Figure 1C-E). </li></ol></li><li> Conservazione <ol><li> Mettere le singole sezioni sugli inserti del filtro a membrana. Usando una pipetta Pasteur tagliato e fuoco lucido per dare un foro più grande, trasferire singolarmente fette agli inserti di cultura. NOTA: La dimensione del foro creato durante il taglio e il fuoco lucidare la pipetta è importante. Troppo piccolo e le fette non sarà facile lasciare la pipetta per la membrana. Fluido troppo grande e l&#39;eccesso è posto sulla superficie della membrana assieme alla fetta. Il miglior diametro del foro è di solito circa la metà del diametrotro del barile della pipetta. Durante il taglio, questo diametro può essere scelto tagliando al posto giusto sul cono della pipetta. </li><li> Fetta di trasferimento <ol><li> Riempire la pipetta con il mezzo prima, e poi aspirare una sola fetta con piccole forze di aspirazione. Ciò mantiene la fetta vicino all&#39;apertura della pipetta e impedisce troppa medio espulsione nell&#39;inserto per posizionare la fetta. </li><li> Applicare una leggera pressione sul bulbo per formare un piccolo pensile goccia, consentono la fetta di stabilirsi in quella goccia, e poi toccare quella goccia alla membrana e lasciare la fetta &quot;caduta&quot; sulla membrana. Generalmente tre fette sono posizionati su ogni inserto di membrana. NOTA: Se la gocciolina liquido è troppo grande, le goccioline delle tre fette tendono a fondersi sulla superficie della membrana, e le fette saranno quindi tutto raccogliere al centro della membrana, il che rende più difficile separarli per la registrazione elettrofisiologica tardi. </li></ol></li><li> Remov Fluidal <ol><li> Aspirare ogni eccesso di terreno dalla parte superiore dell&#39;inserto piastra di coltura per tutte le sezioni di quel piatto (3 fette per inserto = 21 fette per piastra), in modo che le fette non sono immersi in o circondati da un pool di media dissezione. </li><li> Eseguire questo è con un non tagliato, ma il fuoco lucidato pipetta Pasteur. Lasciare che la fetta di stabilirsi e di aderire alla membrana per un minuto prima di pipettaggio. Fare attenzione a non risucchiare la fetta alto nella pipetta. Eseguire la rimozione del liquido per gli inserti che sono placcati in primo luogo, per dare il tempo sufficiente per le fette di stabilirsi. </li></ol></li><li> Fetta di archiviazione <ol><li> Culture fetta Conservare in CO 2 incubatore 5,0% a 37 ° C. Osservare la disposizione finale delle culture in Figura 1E. Le singole sezioni poggiano su un inserto piastra di coltura che ha una membrana porosa per una parte inferiore, e questo inserto si inserisce all&#39;interno di una capsula di Petri riempita con una piccola quantità di mezzo; in questo modo, le fette non sono immersi nel medium, ma ha accesso ad esso solo attraverso la membrana nella parte inferiore dell&#39;inserto piastra di coltura. </li><li> Facoltativamente, rimuovere le fette possono per motivi di studio o rimuovendo l&#39;inserto piastra di coltura o tagliando fuori una sezione di membrana inserto contenente una fetta. </li></ol></li></ol></li><li> Manutenzione <ol><li> Sostituire il mezzo in piastre di Petri il giorno dopo aver fatto le culture. Trasferire l&#39;inserto piastra di coltura di una nuova capsula di Petri contenente 1 ml di terreno di coltura fresco che viene equilibrato in incubatrice per almeno un&#39;ora prima del trasferimento. </li><li> Cambiare il mezzo nuovamente nello stesso modo il terzo giorno dopo aver culture. Il terzo giorno, il trasferimento delle culture di un incubatore a 34 ° C. Modificare il medio due volte alla settimana (ogni 3-4 giorni). </li><li> Identificare le colture sane. Selezionare colture sane per le registrazioni di cellule intere appaiati. NOTA: colture sane hanno un bordo ben definito e uno strato di cellule piramidali chiaramente definito. Culture with scuro (probabilmente necrotico) aree presenti o un aspetto vacuolato con bordi appiattiti vengono rifiutati. Utilizzando questi criteri, di solito due terzi delle culture fetta sono sufficientemente sani per la registrazione. </li><li> Utilizzare queste culture all&#39;interno di una relativamente piccola finestra di tempo. Non tessuti utilizzati che sono coltivate per più di due settimane da quando i neuroni cominciano a mostrare un comportamento leggermente epilettiforme che peggiora lentamente nel tempo. Il limite superiore esatto della sopravvivenza neuronale non è noto, ma è possibile registrare dal funzionamento delle cellule piramidali più tardi di 16 settimane di cultura. </li></ol></li></ol> 2. accoppiati Registrazioni a cellula intera <ol><li> ACSF e intracellulari Solutions <ol><li> Preparare la soluzione elettrodo presinaptica mescolando (in mm) 120 gluconato di potassio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 con KOH; osmolarità: 290 mOsm). Mentre la stessa soluzione elettrodo è utilizzato per i neuroni postsinaptici, gluconato di cesio (120 mM) È tipicamente utilizzato come il principale sale nella elettrodo postsinaptica, più 5 QX314 mM. NOTA: Questo consente di bloccaggio tensione stabile a potenziali positivi per registrare NMDAR-mediata correnti postsinaptiche 8-10,13. Inoltre impedisce l&#39;ipereccitabilità potassio indotta del neurone presinaptico dalla soluzione interna che scorre dall&#39;elettrodo registrazione postsinaptica prima di un sigillo giga ohm è fatta. </li><li> Preparare la soluzione elettrodo postsinaptico comporre (in mm) 120 gluconato di cesio, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7.2 con CsOH; osmolarità: 290 mOsm). Tirare microelettrodi di vetro 5-10 resistenza MW e riempire con soluzione interna filtrata. </li><li> Preparare liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) composizione (in mm) 119 NaCl, KCl 2.4, 1.3 MgSO 4, 2.4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26.2 NaHCO 3, 11 glucosio, pH 7.4, saturato con il 95% O 2, 5 % di CO 2. NOTA: Se r Ampar-mediataesponses devono essere bloccate per l&#39;esame di NMDAR EPSCs, includono 10 mM CNQX o NBQX nel ACSF. </li></ol></li><li> Ottenere accoppiati interi Recordings Cellulari <ol><li> Per esaminare la trasmissione sinaptica tra due neuroni individuali, designare un neurone in neurone presinaptico e tenere in pinza per indurre potenziali d&#39;azione e di avviare la trasmissione sinaptica. </li><li> Designare il secondo neurone, il neurone postsinaptico, e tenerlo in clamp corrente o tensione in relazione alla informazioni richieste dal ricercatore. Ottenere un esame dettagliato delle correnti glutamatergiche, con EPSCs Ampar-mediate esaminati a -65 mV e EPSCs NMDAR mediata esaminati a +30 mV 6-16 tenendo il neurone postsinaptico in morsetto di tensione </li><li> Stabilire una registrazione accoppiato. Per stabilire una registrazione accoppiato, la registrazione intera cellula presinaptica è sempre ottenuta prima, consentendo molteplici neuroni postsinaptici sequenziali da ottenere fino a quello che è sinapticamente Connected è ottenuta. Se l&#39;esecuzione di esperimenti di plasticità sinaptica, è particolarmente critico per ottenere il neurone presinaptico prima come l&#39;induzione di LTP nel neurone postsinaptico deve essere avviata entro 10 min di ottenere l&#39;intera registrazioni cellulari per evitare dilavamento dei fattori citoplasmatici necessari per la LTP 8,19. </li><li> Evitare la perdita di cellule movimento-indotta. Una sfida importante quando si eseguono registrazioni di cellule intere appaiati è di evitare vibrazioni e disagi indotti dal movimento della prima registrazione cellula intera, mentre ottenere la seconda registrazione. <ol><li> Ottenere la prima registrazione cellula intera e quindi spostare il microscopio lente 10-200 micron in asse x in modo che la registrazione stabilita si trova ai margini della zona visibile sul monitor (Figura 2A). </li><li> Sollevare la lente del microscopio ~ 5-10 mm, garantendo nel contempo che il ACSF mantiene ancora il contatto con la lente. Montare il secondo elettrodo e guidare nel menisco liquido (Figura 2B </sTrong&gt;). </li><li> Spostare l&#39;elettrodo nel piano xy fino a quando non è direttamente sotto il percorso della luce attraverso l&#39;obiettivo, ma ancora significativamente sopra l&#39;elettrodo di registrazione stabilita. Una volta che l&#39;elettrodo è visibile al microscopio, garantire la punta è al limite estremo del monitor lontano dal primo elettrodo. </li><li> Spostare il secondo elettrodo nella sequenza con la messa a fuoco del microscopio fino a che entrambi gli elettrodi sono sullo stesso piano focale. E &#39;importante che il livello di pressione positiva è abbastanza forte per evitare punta blocco ma non troppo forte in modo da interrompere la prima registrazione cellula intera. Questo si traduce in pressione positiva inducendo movimento tra 2-3 neuroni dall&#39;elettrodo quando entra per la prima fetta. </li><li> Individuare un partner postsinaptico in un piano focale simile alla prima registrazione presinaptico (Figura 2C). La registrazione è generalmente associato ottenere registrazioni tra i neuroni piramidali CA3 seconda cella tutto da un neurone 0-200 mm della prima recording (Figure 2C, D). NOTA: La trasmissione sinaptica tra coppie neuronali sono stabili su periodi di tempo fino a 3-4 ore quando si utilizzano queste tecniche intere standard di registrazione delle cellule. </li></ol></li></ol></li><li> Plasticità sinaptica: Once Upon ottenere un paio di cellule piramidali sinapticamente-collegato di successo (3A figure, B), esaminare le caratteristiche di trasmissione e plasticità sinaptica. <ol><li> Induzione di LTP. <ol><li> Indurre LTP accoppiando potenziali d&#39;azione presinaptico (1 Hz) con depolarizzazione postsinaptica a -10 a 0 mV per 1 min (Figura 3C) 7-9,12-14. Avviare l&#39;associazione entro 10 minuti di break-in al neurone postsinaptico. NOTA: LTP può anche essere indotta con entrambi i neuroni tenutasi a pinza con l&#39;associazione potenziali d&#39;azione presinaptici e postsinaptici a 1 Hz per 1 min, con potenziali d&#39;azione postsinaptici suscitato 10 msec dopo l&#39;iniezione di corrente nel neurone presinaptico 8 </sup&gt;. </li></ol></li><li> Ulteriori indurre LTD dalla bassa frequenza di stimolazione (LFS) a 1 Hz combinata con una leggera depolarizzazione del neurone postsinaptico a -55 mV per 5-10 min (Figura 3C) 9. </li></ol></li></ol>

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<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole+cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).</li>
<li>DeBello, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-mediated+protein-protein+interactions+essential+for+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release.</a> Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).</li>
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<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons%3A+quantal+levels%2C+oscillations%2C+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li>
<li>Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li>
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<li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li>
<li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Qui abbiamo descritto i requisiti per la creazione di successo registrazioni di cellule intere associati nel organotipica culture fetta dell&#39;ippocampo. Registrazioni accoppiati possono essere eseguite in diverse preparazioni, tra cui fettine acute e sistemi di colture dissociate 26,27. Mentre il fuoco qui è stato sul induzione di forme di plasticità sinaptica (LTP e LTD cioè) più lunghi, è importante sottolineare che le coppie di registrazioni di cellule intere in organotipica, fetta acuta e dissociato pr...

Recettori del glutammato mediano la maggior parte della trasmissione sinaptica eccitatoria a livello delle sinapsi del sistema nervoso centrale. I due principali sottotipi di recettori ionotropici del glutammato localizzate alla testa dorso della membrana postsinaptica sono N-metil-D-aspartato (NMDA) e α-ammino-3-idrossi-5-methylisoxazole-4-proprionic acido (AMPA) recettori. A riposo potenziali di membrana, i recettori AMPA portano la maggior parte della corrente post-sinaptica durante la trasmissione sinaptica. Nel ippocampo, il recettore NMDA svolge un ruolo chiave nello scatenare variazioni nel numero di recettori AMPA nella membrana postsinaptica: agendo come un &quot;rivelatore coincidenza&quot; 1 per avviare cambiamenti nella forza sinaptica 1, il recettore NMDA partecipa ai meccanismi sinaptici che si pensa di sostenere l&#39;apprendimento e la memoria a livello subcellulare. In risposta alla depolarizzazione del neurone postsinaptico in parallelo con rilascio di neurotrasmettitore presinaptico, calcio entra attraverso l&#39;NMDArecettore per avviare l&#39;inserimento dei recettori AMPA o la rimozione 2. Queste dinamiche recettori sono alla base della plasticità sinaptica: un aumento della forza sinaptica è a lungo termine 2,3 potenziamento (LTP), mentre una diminuzione della forza sinaptica è la depressione a lungo termine 4 (LTD). Quindi il movimento del recettore AMPA è pensato per essere responsabile di espressione plasticità sinaptica, mentre i recettori NMDA sono pensati per controllare la sua induzione. Determinare i precisi meccanismi alla base della trasmissione sinaptica e la plasticità è necessario studiare piccole popolazioni di sinapsi, idealmente singole sinapsi. Mentre alcune sinapsi sono molto adatti per lo studio a questo livello, ad esempio, il calice di Held 5, per le popolazioni più sinaptici questo è estremamente difficile a causa della natura piccola e diffusa delle connessioni sinaptiche. Due principali tecniche di elettrofisiologia sono state sviluppate per esaminare le connessioni sinaptiche singoli: il primo è la stimolazione minima, DOVe una fibra presinaptica si presume stimolata extracellulare. La seconda tecnica è accoppiato registrazioni, in cui si svolge due registrazioni di cellule intere simultanee da neuroni sinapticamente collegati. Un vantaggio importante di stimolazione minima è che è rapido e relativamente semplice da eseguire, coinvolgendo il posizionamento di un elettrodo di stimolazione extracellulare nel tratto assonale e contemporaneamente registrare da un neurone postsinaptico. La preoccupazione principale quando si utilizza questa tecnica è che la stimolazione affidabile di una singola cellula può raramente essere garantita prova dopo prova. Negli ultimi quindici anni abbiamo abitualmente utilizzati accoppiato registrazioni whole-cell da due neuroni piramidali sinapticamente collegati 6-17. Il principale vantaggio di questa tecnica è che solo neurone presinaptico è coerente e affidabile stimolato. Inoltre permette non solo la caratterizzazione elettrofisiologica, ma anche la manipolazione farmacologica del neurone presinaptico 6,18 &lt;/ Sup&gt;. Tuttavia, la probabilità di connettività sinaptica tra neuroni è basso, accoppiando collegati difficile ottenere 19. L&#39;utilizzo di culture fetta cerebrale organotipica aggira questo ostacolo come connettività sinaptica può ristabilire in vitro ed inoltre la natura della connettività risultante è simile a quello nel tessuto cerebrale nativo 20. Inoltre, culture organotipiche esprimono LTP, LTD 7-10,12-15,21 e ulteriori forme di plasticità sinaptica a breve termine, tra cui la facilitazione paired-pulse (PPF) e depressione (PPD) 6,22,23, consentendo meccanismi di plasticità a essere studiato in coppie di neuroni. Qui si descrive la metodologia dettagliata coinvolti nel raggiungimento di successo registrazioni appaiati in questo sistema in vitro. Questa informazione può essere facilmente adattato ad altri sistemi sperimentali, tra cui fettine acute e altre regioni del cervello.

<table><tbody><tr><td>Minimo Essenziale Medio</td><td></td><td></td><td>Stabile Micromanipolatori motorizzati</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Bagno di tessuti poco profondi</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> tampone HEPES <td>Telecamera DIC</td></tr><tr><td>1 M Soluzione</td><td></td><td></td> stock Tris <td>Amplificatore</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina</td><td></td><td></td> bilanciata Siero di cavallo <td>per computer</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tavolo di isolamento dalle vibrazioni</td></tr><tr><td>Spatole</td><td></td><td></td> miniaturizzate rivestite in plastica <td>Microscopio verticale</td></tr><tr><td>Pennello</td><td></td><td></td> morbido <td>Software di acquisizione e analisi dei</td></tr><tr><td>dati Tritatutto manuale Estrattore</td><td></td><td></td> di <td>elettrodi</td></tr><tr><td>#2 Carta</td><td></td><td></td> da filtro <td>Gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>#5 Pinze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserti</td><td></td><td></td><td></td>a membrana</tr><tr><td>CO2 Cappa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>di<td>dissezione</td></tr><tr><td>Cappa</td><td></td><td></td><td></td> di classe II</tr></tbody></table>

associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Le registrazioni di coppia coinvolgono registrazioni simultanee di patch clamp di intere cellule da due neuroni sinapticamente connessi, consentendo non solo la caratterizzazione elettrofisiologica diretta delle connessioni sinaptiche tra i singoli neuroni, ma anche la manipolazione farmacologica del neurone presinaptico o postsinaptico. Quando viene effettuato in colture organotipiche di fette ippocampali, la probabilità che due neuroni siano collegati sinapticamente è significativamente aumentata. Questa preparazione consente prontamente l'identificazione dei tipi di cellule e i neuroni mantengono la loro morfologia e le proprietà della funzione sinaptica simili a quelle del tessuto cerebrale nativo. Uno dei principali vantaggi delle registrazioni accoppiate di cellule intere è l'informazione altamente precisa che può fornire sulle proprietà della trasmissione sinaptica e della plasticità che non sono possibili con altre tecniche più grezze che utilizzano la stimolazione assonale extracellulare. Le registrazioni accoppiate di intere cellule sono spesso percepite come troppo difficili da eseguire. Sebbene questa tecnica presenti aspetti impegnativi, le registrazioni accoppiate possono essere eseguite da chiunque sia addestrato al blocco di patch di cellule intere, a condizione che vengano seguiti criteri hardware e metodologici specifici. La probabilità di ottenere registrazioni accoppiate sinapticamente connesse aumenta significativamente con fette organotipiche sane e micromanipolazione stabile che consente il raggiungimento indipendente di registrazioni di intere cellule pre- e postsinaptiche. Mentre le coppie di cellule piramidali CA3-CA3 sono più ampiamente utilizzate nella preparazione organotipica dell'ippocampo a fette, questa tecnica ha avuto successo anche nelle coppie CA3-CA1 e può essere adattata a qualsiasi neurone che è sinapticamente connesso nella stessa preparazione a fette. In questo manoscritto forniamo la metodologia dettagliata e i requisiti per stabilire questa tecnica in qualsiasi laboratorio attrezzato per l'elettrofisiologia.

Connettività Synaptic è evidente stimolando il neurone presinaptico a fuoco un potenziale d'azione passando un impulso di corrente depolarizzante (tipicamente 20-50 pA per 20 msec) tramite l'elettrodo di registrazione. La traccia corrente postsinaptica viene poi esaminato per la presenza di una EPSC monosinaptico evocata a breve (&lt;5 msec) e latenze coerenti dopo il picco del potenziale d'azione presinaptico (Figura 3A). Nella maggior parte degli esperimenti più neuroni postsinaptici sono testati prim...

Le registrazioni di coppia sono registrazioni simultanee di patch clamp di intere cellule da due neuroni collegati sinapticamente, che consentono una precisa caratterizzazione elettrofisiologica e farmacologica delle sinapsi tra i singoli neuroni. Qui descriviamo la metodologia dettagliata e i requisiti per stabilire questa tecnica in colture organotipiche di fette di ippocampo in qualsiasi laboratorio attrezzato per l'elettrofisiologia.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di essere in grado di registrare elettrofisiologicamente dal circuito sinaptico minimo nel cervello. Ciò si ottiene nelle registrazioni effettuate da colture di fette organotipiche di ippocampo di ratto coltivate in inserti di coltura in plastica. Queste fette creano connessioni sinaptiche elaborate ma appropriate che possono essere facilmente registrate dopo un periodo di crescita della cultura.Effettuare registrazioni in queste fette consente l'isolamento dell'attività sinaptica del circuito sinaptico minimo che si formava tra due soli neuroni, e quindi consente lo studio delle proprietà più elementari dei circuiti neuronali. Questo metodo può essere utilizzato per sondare la funzione dei microcircuiti sinaptici nell'ippocampo, ma può essere utilizzato per qualsiasi area del cervello in cui i neuroni vicini sono collegati sinapticamente. La dimostrazione visiva di entrambi i metodi di registrazione e dissezione è fondamentale poiché molti dei passaggi dipendono dall'identificazione accurata dei punti di riferimento del cervello e dei neuroni, sia prima di fare le fette preparare tutte le soluzioni e le piastre di coltura.Ogni piastra più grande per la raccolta delle fette contiene sette piastre più piccole, ciascuna con un terreno e un inserto di coltura durante il loro assemblaggio. Posizionare gli inserti nel supporto in modo da evitare di intrappolare l'aria. Conservare queste piastre nell'incubatrice, rimuovere con cura l'ippocampo da ciascuna metà del cervello di un roditore P sette senza danni navigando nel cervello utilizzando punti di riferimento strutturali.Per prima cosa, dividi un cervello lungo la linea mediana. Quindi, usando spatole sottili, separa la corteccia dal mesencefalo. Sbucciare il cervello per rivelare l'ippocampo.Successivamente, tagliare il fornice con la punta della spatola e lavorare la spatola sotto il FIA e l'ippocampo. Ora fai rotolare l'ippocampo fuori dal cervello e taglialo via dal tessuto attaccato. Raccogli delicatamente l'ippocampo e mettilo in un mezzo di dissezione ghiacciato.Procedi con la raccolta del secondo ippocampo. Procedete con l'affettatura dei due campi ippopotami. Adagiarli sul palco del blocco tritatutto foderato con due spessori di inumiditi.Numero due, la carta da filtro. Quindi fare fette trasversali consecutive da 400 micron senza sollevare alcuna fetta. Il risultato è come una pagnotta a fette.Lo spessore costante e la manipolazione delicata sono fondamentali. Ora usando un morbido zibellino bianco, il pennello da artista numero quattro, fai rotolare delicatamente il pennello sotto ogni ippocampo affettato e sollevalo dal palco. Una volta trasferiti entrambi i campi di ippopotami, coprite il piatto e fatelo roteare energicamente.Cambia direzione frequentemente. L'obiettivo è separare le fette. Ora sotto un microscopio da dissezione, ispezionare le fette, scartare quelle danneggiate o più piccole di quelle desiderate.Inoltre, scartare tutte le fette che non hanno strati di cellule chiaramente visibili in quanto anche questo è un'indicazione di danno. Tutte le fette che non si sono separate possono essere rivoltate sul bordo e pungolate con una pinza dumont per separarle. Per prima cosa, riempire la pipetta con il terreno.Aspirare quindi delicatamente la fetta, tenendola vicino all'apertura. Esercitando una leggera pressione. Formare una gocciolina sulla punta e attendere che la fetta si depositi nella gocciolina.Quindi toccare la gocciolina sulla superficie della coltura tissutale. Inserire. Una volta che la fetta è chiaramente sull'inserto, estrarre la pipetta. Se le goccioline non sono troppo grandi, tre fette si adatteranno a una membrana. Inserire.Una volta trasferite tutte le fette, utilizzare una pipetta da pascolo per aspirare delicatamente il terreno attorno a ciascuna fetta. Eseguire la rimozione del fluido per gli inserti che sono stati placcati. Prima di tutto per lasciare il tempo sufficiente affinché le fette si depositino.Ora copri ogni piatto piccolo, poi il piatto grande e incuba l'assemblaggio. Nutrite le fette il giorno dopo averle tagliate. Quindi nutrili di nuovo il terzo giorno dopo il taglio.Spostateli in un'incubatrice a 34 gradi Celsius, 5% di CO2 dopo la seconda poppata e successivamente alimentate le colture due volte a settimana. Le fette organotipiche sono pronte per la registrazione tra una e due settimane dopo il taglio. Al rig di registrazione, rimuovere una singola fetta tagliando completamente la parte inferiore dell'inserto di coltura e intorno alla fetta con il bisturi.Rimuovere il cerchio di plastica tagliato con una pinza dumont e posizionarlo nella camera di registrazione dell'impianto di elettrofisiologia. Usa una pinza per spostare la fetta nella camera di registrazione. Ora, pur mantenendo il tavolino, è possibile mettere a fuoco e scansionare la superficie della fetta con un ingrandimento inferiore a 10 x e poi a 40 x per individuare lo strato del corpo a tre cellule CA.Una volta identificate le cellule bersaglio, sollevare l'obiettivo il più possibile senza rompere il menisco fluido tra l'obiettivo e il liquido cerebrospinale A nella camera di registrazione. Quindi posiziona un elettrodo di registrazione di cellule intere sotto l'obiettivo e concentrati verso il basso per trovare la punta dell'elettrodo fino a quando l'elettrodo non entra in contatto con un neurone bersaglio. Assicurarsi di mantenere una pressione positiva sulla soluzione interna dell'elettrodo per mantenere l'elettrodo libero da detriti.Ora abbassate l'elettrodo e l'obiettivo di concerto fino a quando l'elettrodo non si trova vicino alla superficie della fetta. Quindi abbassare ulteriormente l'elettrodo nel tessuto e spingerlo delicatamente nel lato del neurone bersaglio. Ora, rimuovi la pressione positiva e applica un'aspirazione delicata alla soluzione interna per creare un sigillo giga ohm sulla membrana del neurone.Una volta effettuata la sigillatura, interrompere la membrana sotto l'elettrodo con impulsi di aspirazione o sovracompensando la capacità dell'amplificatore con una registrazione di un'intera cella. Sollevare nuovamente l'obiettivo e posizionare il secondo elettrodo per ridurre al minimo i movimenti che interromperebbero la prima registrazione. Mantenere bassa la quantità di pressione positiva sul secondo elettrodo.Un flusso ragionevolmente basso indurrà movimenti a una distanza di due o tre neuroni. Una volta stabilita la seconda registrazione di cellule intere, la trasmissione sinaptica dovrebbe essere stabile per un periodo compreso tra una e quattro ore. La connettività sinaptica è evidente stimolando il neurone pre-sinaptico a sparare nel potenziale d'azione, e quindi vedendo le EPC sinaptiche monos nel neurone postsinaptico entro cinque millisecondi.Circa un terzo delle celle ca tre testate erano mono accoppiate sinapticamente a un'altra cella CA tre da una connessione attiva. L'ampiezza delle correnti mediate dal recettore AMPA variava tra le prove all'interno di una registrazione accoppiata ed era diversa nelle diverse connessioni attive. Gli EPC possono essere inferiori a 10 picoamp o superiori a 800 picoamp.I tassi di guasto variavano ampiamente utilizzando i metodi di induzione standard. Sia LTP che LTD potrebbero essere indotti in modo affidabile a circa tre o tre sinapsi, ed entrambe le forme di plasticità verrebbero mantenute per oltre due ore. L'intera durata della registrazione degli eventi inibitori polisinaptici è stata frequentemente osservata tra le tre coppie di neuroni parametallici CA.Tuttavia, non sono stati bloccati farmacologicamente, in quanto non interferivano in modo significativo con le correnti neurosinaptiche a causa delle lunghe latenze tra questi eventi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare fette ippocampali organotipiche e di come usarle per effettuare registrazioni doppie di cellule intere da coppie di neuroni sinapticamente connesse.

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Usiamo il patch-clamp per misurare GABA-activated monocanale correnti (GABAA canali, recettori GABA) e le correnti sinaptiche e tonico che generano nei neuroni. L'attivazione dei canali diminuisce l'eccitabilità neuronale nella salute e nella...

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Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

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Fotostimolazione e registrazioni di patch clamp a cellule intere di neuroni in fette di ippocampo di topo

Questo video mostra la procedura per impostare una fetta di cervello in una camera di immersione per registrare l'attività sinaptica. Il processo prevede il fissaggio della fetta su carta per lenti, il mantenimento di un flusso continuo di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) per garantire la vitalità neuronale e il posizionamento accurato degli elettrodi di stimolazione e registrazione rispetto a una specifica regione cerebrale di interesse. Questa configurazione consente un monitoraggio...

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Registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio Retinal Fetta Preparazione

Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l'identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

Questo protocollo descrive passaggi procedurali di base per l'esecuzione di cellule intere registrazioni patch-clamp. Questa tecnica consente di studiare il comportamento elettrico dei neuroni, e quando eseguito in sezioni di cervello, permette di valutare diverse funzioni neuronali da neuroni che sono ancora integrati in circuiti cerebrali relativamente ben conservati.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Presentiamo un protocollo per preparare fette acute dall'ippocampo dorsale-intermedio dei topi. Confrontiamo questa preparazione trasversale con l'affezione coronale in termini di qualità delle registrazioni e conservazione delle caratteristiche morfologiche dei neuroni registrati.

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

Impara a registrare coppie di neuroni sinapticamente connessi in fette organotipiche di ippocampo. Questa tecnica di patch clamp permette di isolare l'attività sinaptica in circuiti minimi per studiare le proprietà fondamentali della connettività neuronale.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

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