Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre, Aedes albopictus

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare i componenti trascrizionali della risposta alla diapausa fotoperiodica. In un pictus a gomito degli anni ottanta di zanzara non modello, ciò si ottiene producendo prima campioni biologicamente replicati di uova in diapausa e non in diapausa attraverso diversi trattamenti fotoperiodici. In una seconda fase, l'RNA viene estratto da ciascuna replicata per il sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento.

Le sequenze di RNA vengono quindi elaborate computazionalmente per assemblarle in cong e per annotarle. In definitiva, le variazioni nell'espressione genica in risposta ai periodi fotografici che inducono la diapausa rispetto a quelli che non inducono la diapausa possono essere dedotte dal MAP di Reeds all'assemblaggio dell'RNA. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi a raggi micro, è che non sono necessarie risorse genetiche preliminari, come la sequenza del genoma o un microarray, per ottenere stime globali dell'espressione genica in risposta a condizioni di diapausa.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genomica ecologica, come ad esempio qual è la base trascrizionale delle DPO o altri adattamenti ecologici chiave negli organismi non modello. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà in quanto può essere difficile ottenere quantità sufficienti di ovuli in diapausa e non DPO e l'analisi bioinformatica a valle può essere impegnativa. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo notato che le tecnologie di sequenziamento del DNA ad alto rendimento stavano diventando più convenienti e offrivano un metodo trattabile per ottenere profili di espressione dell'intero genoma in organismi non modello Prima di iniziare la procedura.

Impostare due armadi fotoperiodici con illuminazione programmabile a 21 gradi Celsius per un'espressione ottimale della diapausa e circa l'80% di umidità relativa Programmare un armadio per un periodo fotografico che non induce diapausa con un ciclo di buio a 16 luci e l'altro per una diapausa che induce un ciclo di buio a otto luci con le luci accese contemporaneamente per entrambi gli armadi per sincronizzare il tempo circadiano tra i periodi fotografici. Quindi, immergere la carta per uova per il numero appropriato di uova in 500 millilitri di acqua deionizzata e aggiungere un millilitro di cibo per cani macinato e liquame di cibo per gamberetti in salamoia. Copri il contenitore con una rete posizionando un elastico attorno alla rete per tenerlo in posizione.

Quindi incubare le uova nell'armadio fotografico 16 otto light dark long day per circa 24 ore. Il giorno successivo, trasferisci circa 30 larve schiuse per gruppo in singole piastre di Petri di 10 per 10 per due centimetri riempite con 90 millilitri di acqua deionizzata. Ogni 48-72 ore, trasferire le larve in un piatto pulito, nutrendole con liquame di cibo fresco ad ogni trasferimento.

Dopo circa sei giorni, rivesti il fondo di tre o quattro gabbie per adulti per ogni trattamento fotoperiodico con carta da filtro bagnata e inumidisci la carta da filtro con abbastanza acqua deionizzata per aumentare l'umidità locale nella gabbia evitando l'acqua stagnante. Annotare il periodo della foto, replicare il numero, la data di inizio della gabbia e altre informazioni rilevanti per l'esperimento con un pennarello indelebile sul lato della gabbia. Quindi, a giorni alterni per 10 giorni, trasferire il puy in piccole tazze di acqua pulita a non più di 50 puy per 25 millilitri di acqua nelle gabbie per adulti appropriate per l'esperimento e posizionare l'uvetta organica sulla rete superiore della gabbia per fornire zucchero agli adulti emersi Per stimolare la posizione degli ovuli quattro o cinque giorni dopo il primo pasto di sangue, Riempi a metà tazze da 50 millilitri di colore scuro foderate con un tovagliolo di carta testurizzato non sbiancato con acqua deionizzata e metti una tazza in ogni gabbia per raccogliere e conservare le uova.

Sostituisci le carte delle uova in ogni gabbia con carta fresca, posizionando le carte rimosse di recente in piastre di Petri e conservandole nell'armadio per il periodo fotografico a 16 giorni corti scuri e leggeri per evitare effetti di confusione sulla conservazione delle uova. Circa 48 ore dopo la raccolta, asciugare le cartine all'aria aperta in modo che risultino flosce e leggermente umide al tatto, ma non così bagnate da far sì che le cartine siano scure a causa dell'acqua o stimolino la schiusa. Per misurare gli incidenti di diapausa, registrare il numero di uova su ogni carta per uova.

Quindi immergere completamente le singole cartine in una capsula di Petri da 90 millilitri con circa 80 millilitri di acqua deionizzata. Per stimolarne la schiusa, aggiungere circa 0,25 millilitri di impasto alimentare e poi, dopo 24 ore, trasferire la capsula di Petri su una superficie nera. Ora posiziona una fonte di luce su un lato del, le larve si allontaneranno dalla luce, consentendo un conteggio chiaro dell'individuo prima nelle larve stellari.

Utilizzare una pipetta per rimuovere ogni larva dopo il conteggio per evitare di contare gli individui. Quindi mettere le cartine all'uovo in una nuova capsula di Petri per farle asciugare in rosso. Dopo aver contato un secondo lotto di piccoli una settimana dopo, posizionare le cartine con le uova rimanenti non schiuse in nuove piastre di Petri da 90 millilitri con circa 80 millilitri di soluzione sbiancante fresca, facendo attenzione che le cartine siano completamente immerse nella soluzione sbiancante.

Lasciare le cartine sotto una cappa aspirante per una notte e poi il giorno successivo utilizzare un microscopio ottico per contare il numero di uova non schiuse. Se un uovo è embrionato, mostrerà un colore bianco sporco con gli occhi che appaiono come due piccoli punti neri uno di fronte all'altro sul lato dorsale. Per iniziare, pulire accuratamente il banco con una soluzione di decontaminazione dell'RNA per rimuovere eventuali nucleasi residue ed evitare la degradazione dell'RNA.

Quindi, usa una spazzola di pelo di cammello per spazzolare almeno 400 uova di zanzara contenenti embrioni in via di sviluppo al momento dello sviluppo. Punto di interesse nelle smerigliatrici per vetro. In una cappa aspirante, aggiungere un millilitro di triolo e macinare le uova fino a quando non sono completamente polverizzate, quindi eseguire l'estrazione dell'RNA in triolo, seguita dalla precipitazione dell'isopropanolo secondo le istruzioni del produttore.

Ora usa fino a un microlitro di D ns per un massimo di 10 microgrammi di RNA in 50 microlitri di reazione per 30 minuti a 37 gradi Celsius secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, incubare la reazione in cinque microlitri di reagente di inattivazione del DNA sospeso per cinque minuti a temperatura ambiente. Agitare delicatamente la sospensione tre volte durante il periodo di incubazione.

Quindi centrifugare gli estratti di RNA per 1,5 minuti a 10.000 volte G ed Eloqua, l'RNA contenente surnatanti, in provette fresche per il sequenziamento. Infine, consulta il testo di accompagnamento per i dettagli su come elaborare i dati di sequenziamento di nuova generazione risultanti dalla lettura, preparazione, assemblaggio e annotazione all'analisi delle espressioni differenziali. In questa prima figura, la fluorimetria di due campioni di RNA rappresentativi mostra due bande a circa 2000 nucleotidi.

L'RNA ribosomiale dell'insetto 28 è costituito da due catene polinucleotidiche tenute insieme da legami idrogeno che vengono facilmente interrotte da un breve riscaldamento o da agenti che rompono i legami idrogeno. I due componenti risultanti hanno approssimativamente le stesse dimensioni di un RNA ribosomiale 18 s nel secondo campione di RNA si possono osservare alti livelli di degradazione in questo esperimento rappresentativo. Il trattamento fotoperiodico di un gruppo rappresentativo di zanzare albopictus ha provocato un'elevata diapausa nelle zanzare allevate a giorno corto e un basso diapausa nelle zanzare allevate a giorno lungo.

Sebbene ci fosse una certa variazione tra le repliche, ad esempio, il gruppo del secondo giorno corto ha mostrato un minor numero di incidenti di diapausa rispetto alle altre repliche. Un assemblaggio Trinity di letture normalizzate digitalmente ha prodotto 76.377 contigs con una lunghezza media di conig di 1020 3.1 e una lunghezza massima di Conti di 20.892. Si noti che la distribuzione delle lunghezze di Conti è fortemente sbilanciata verso contigs più corti.

Questo è tipico dell'assemblaggio del trascrittoma Denovo. In questo grafico finale, le analisi di espressione differenziale di un flusso di lavoro simile di embrioni allevati in condizioni che inducono diapausa a 11 e 21 giorni dopo la posizione degli ovuli rivelano 3.128 geni espressi in modo differenziale tra questi due periodi di tempo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei-otto mesi dalla generazione dei tessuti, dall'analisi dell'informatica divina se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il successo di ogni passaggio deve essere verificato prima di passare al passaggio successivo. Ad esempio, confermare che le condizioni sperimentali abbiano prodotto DPA e ovuli non in diapausa prima di testare l'integrità dell'RNA Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi quantitativa R-T-P-C-R, o l'analisi genomica comparativa possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti l'espressione specifica dei geni di interesse o dello sviluppo e/o i processi di evoluzione molecolare.

Non dimenticare che lavorare con il triolo può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di guanti, camice da laboratorio e cappa aspirante.