Name: Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre, Aedes albopictus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Scopri un protocollo bioinformatico per analizzare l'espressione genica durante la diapausa fotoperiodica in Aedes albopictus. Questo metodo combina RNA-Seq e analisi computazionale per studiare adattamenti ecologici negli organismi non modello.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione 5R21AI081041-02 del National Institutes of Health e dalla Georgetown University.

1. larvale allevamento di due A. albopictus gruppi di età adulta <ol><li> Impostare due armadi fotoperiodo con illuminazione programmabile a 21 ° C per l&#39;espressione ottimale diapausa 16 e circa l&#39;80% di umidità relativa. <ol><li> Programma un armadio per un 16L: luce 8D: ciclo scuro (un non-diapausa indurre LD fotoperiodo). Impostare il secondo armadio per 8L: 16D luce: ciclo scuro (diapausa indurre) 13. </li><li> &#39;Luci&#39; del programma contemporaneamente in entrambe le armadi per sincronizzare l&#39;ora circadiano tra fotoperiodi. </li></ol></li><li> Calcolare la quantità di uova necessarie per eseguire l&#39;esperimento. Obiettivo per 300-500 uova per gabbia. Almeno tre replicare gabbie diapausa e tre replicano gabbie non diapausa sono necessari per la produzione di RNA. Questo ammonta a circa il 1,800-3,000 uova per esperimento. <ol><li> Hatch le uova immergendo carte uovo in circa 500 ml di H 2 O. deionizzata </li><li> Aggiungi &lt;em&gt; ca. 1 ml sospensione degli alimenti costituiti da cibo per cani a terra e il gambero di salamoia come descritto in precedenza 24. Coprire il contenitore con rete, e mantenere la maglia in posizione con un elastico. </li><li> Mettere nell&#39;armadio LD fotoperiodo per circa 24 ore. </li></ol></li><li> Trasferimento larve schiuse a 10 x 10 x 2 cm Petri piatti pieni di ca. 90 ml di acqua deionizzata H 2 O. <ol><li> Mantenere ca. 30 larve per piatto. Trasferimento larve per pulire piatti ogni 48-72 ore, ad esempio ogni Lunedi, Mercoledì e Venerdì (MWF) 24. </li><li> Alimentazione circa 1 ml sospensione degli alimenti costituiti da cibo per cani a terra e artemie in acqua deionizzata ogni MWF come descritto in precedenza 24. </li></ol></li><li> Impostare 3-4 gabbie per adulti per ogni trattamento fotoperiodo, dove ogni gabbia comprende una replica biologica. <ol><li> Da bande opposte 9.5 L secchi, tagliare una 10-by-14 centimetri foro, e un altro foro di diametro 15 cm. Conel corso dei primi con rete. Tagliare circa un lunghezza di piede di una calza ortopedica, e incollate un&#39;estremità intorno l&#39;interno del foro. </li><li> Tagliare l&#39;estremità di piede della calza off e nodo arresto - aperto solo quando è necessario accedere all&#39;interno della gabbia. Per il coperchio della gabbia, tagliare fuori tutto l&#39;interno, lasciando solo il bordo, e sostituire la plastica interno con rete 24. </li><li> Notare il fotoperiodo, replicare numero, data di inizio della gabbia, e altre informazioni pertinenti per l&#39;esperimento con pennarello indelebile sul lato della gabbia. </li></ol></li><li> Foderare il fondo delle gabbie adulti con carta da filtro umida. Inumidire la carta da filtro con abbastanza deionizzata H 2 O per aumentare l&#39;umidità locale nella gabbia, ma evitare acqua stagnante, che può stimolare ovideposizione sulla carta da filtro 24. Controllare la carta da filtro giornaliera per essiccamento, ri-bagnato quando necessario. </li><li> Per produrre uova sufficienti per una libreria di RNA, comprende almeno 100 donne / 9.5 L cage, con non più di 500 zanzare per gabbia. </li><li> Raccogliere pupe MWF e posto in una tazzina di H 2 O pulita con una densità di non oltre il 50 pupe per 25 ml di H 2 O. Trasferire la coppa pupe di una gabbia adulto. Posizionare gabbie nel rispettivo cabinet fotoperiodo - A. albopictus pupe sono fotosensibile 15. </li><li> Assicurarsi quotidiana che H 2 O in tazze è pulito e chiaro, e rimuovere pupe morti, perché l&#39;accumulo di pupe morta può causare la mortalità di massa. Rimuovere H 2 O tazze dopo tutti pupe emergono. </li><li> Mettere uvetta organici sulla maglia superiore della gabbia di fornire zucchero per adulti emerse. Monitorare uvetta, e cambiarle ogni 3-5 giorni per evitare l&#39;accumulo di muffe. </li></ol> 2. Manutenzione di adulti per consentire l&#39;accoppiamento e Egg Production <ol><li> Mantenere gabbie a umidità elevata (circa. 80%) allineando il fondo della gabbia con una carta da filtro umida e fornire accesso a uva non-muffa, come descritto sopra (Sezioons 1.5 e 1.9). </li></ol> 3. si nutrono di sangue <ol><li> Preparatevi a femmine di sangue-alimentazione tra 2-6 giorni dopo eclosion per garantire che le femmine sono stati esposti ad almeno otto giorni prima della deposizione delle uova brevi inequivocabili inizia per quasi 100 uova% diapausa 14. </li><li> Preparare il sistema di alimentazione Hemotek membrana. Collegare le unità di alimentazione alla presa di corrente. Regolare la temperatura di ciascuna unità di 37 ° C con la vite di regolazione. Utilizzare un termometro elettronico e sonda per misurare la temperatura del gruppo di alimentazione durante la calibrazione. </li><li> Preparare il serbatoio pasto. Allungare un quadrato di membrana di collagene alimentazione sopra l&#39;apertura del serbatoio pasto e fissarlo con un O-ring. Tirare con attenzione gli angoli per rimuovere le rughe; tagliare la membrana in eccesso con le forbici. NOTA: membrana collagene non può funzionare bene per tutte le specie di zanzara, e può essere necessario provare diversi tipi di trovare membrana ottimale se si lavora con unspecie diverse da A. albopictus. Parafilm funziona bene con Culex pipiens. <ol><li> Se il sangue è conservato congelato, scongelare a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima di utilizzare. </li><li> Tenere il serbatoio in modo che la membrana è rivolta verso il basso, e le porte di riempimento non supportati sono rivolti verso l&#39;alto. Utilizzare una pipetta di trasferimento o una siringa per riempire il serbatoio con circa 3 ml di sangue intero da polli che ha citrato di sodio come anticoagulante. Sigillare porte di riempimento con tappi di plastica. </li></ol></li><li> Fissare il serbatoio preparata all&#39;alimentatore avvitandolo sul perno sulla piastra di trasferimento di calore sul fondo dell&#39;alimentatore. Invertire l&#39;alimentatore e posizionarlo sulla parte superiore della gabbia, lato membrana verso il basso, in modo che le zanzare possono alimentare attraverso le maglie della gabbia. Tenere l&#39;alimentatore sulla gabbia per circa 45 min per massimizzare alimentazione. </li></ol> 4. Stimolare Deposizione delle uova <ol><li> Quattro o cinque giorni dopo pasto di sangue, dotare ogni gabbia con un colore scuro 50 ml cup foderata con carta greggi germinazione dei semi (carta d&#39;uovo) o il tovagliolo strutturato non sbiancata carta e riempire a metà con acqua deionizzata 9. Se più di 250 zanzare sono in una gabbia, utilizzare due tazze. NOTA: Per le piccole gabbie o fiale singolo femminile, &quot;infuso fieno&quot; in contenitori di deposizione delle uova può aumentare deposizione causa l&#39;odore della flora microbica 25. </li></ol> 5. Raccogliere e deposito Uova <ol><li> Iniziare la raccolta delle uova entro 4-5 giorni di alimentazione sangue, perché la produzione di uova picchi tipicamente di circa cinque giorni dopo l&#39;alimentazione di sangue, e poi scompare nel corso della settimana prossima. </li><li> Variare frequenza di raccolta delle uova sulla necessità dell&#39;esperimento. Per scopi generali, raccogliere documenti di uova su una pianificazione MWF. Rimuovere carte uovo da ogni gabbia e sostituirla con carta nuova. Posizionare i documenti rimossi di recente in piastre di Petri e conservare in cabinet fotoperiodo SD per evitare effetti confondenti di stoccaggio delle uova. </li><li> Lasciare carte uovo di ri<html> principale bagnato per 2 giorni dopo la deposizione delle uova per permettere la formazione sierosa cuticola, che aumenta la resistenza uovo essiccazione 26. </li><li> Raccolta postale circa 48 ore, uova asciugare all&#39;aria aperta. Essiccare la carta in modo che sia molle e leggermente umido al tatto, ma non così bagnato che la carta è scuro da H 2 O o stimola la schiusa delle uova. NOTA: A &quot;x 4&quot; carta 6.5 potrebbe richiedere circa 3,5 ore ad asciugare. Fare attenzione a non troppo secca carte d&#39;uovo, in quanto questo si tradurrà in uovo essiccazione 27. </li><li> Riserva uova aggiuntivi sia da LD e SD fotoperiodi per valutare l&#39;incidenza diapausa e interpretano l&#39;effetto photoperiodic (vedi Misurazione diapausa, sezione 6). </li><li> Per la conservazione a lungo termine, tenere le carte d&#39;uovo a 21 ° C e circa l&#39;80% di umidità in piastre di Petri. Tenere piastre di Petri in un contenitore Tupperware con un pallone di acqua per mantenere l&#39;umidità locale come lo sviluppo embrionale richiede 4-5 giorni a 21 ° C. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Misura diapausa Incidenza <ol><li> Utilizzare ulteriori embrioni riservati (cfr Stimolare Deposizione delle uova, sezione 4) che sono 7-20 giorni per quantificare la risposta diapausa. </li><li> Registrare il numero di uova presenti su ogni carta uovo. </li><li> Stimolare le uova per schiudersi immergendo completamente carte uovo individuali in un piatto di 90 ml di Petri con circa 80 ml ​​di H 2 O. deionizzata Aggiungere circa 0,25 ml cibo liquami. </li><li> Dopo 24 ore coincidere il numero di tratteggiata prima larve instar. Porre la capsula Petri su una superficie nera per visualizzare larve e posizionare una sorgente di luce su un lato del piatto. Le larve si allontanerà dalla fonte di luce, consentendo una chiara conteggio delle larve individuale. Rimuovere larve individuo con una pipetta, mentre il conteggio per evitare raccontare larve individuale. </li><li> Carte Luogo d&#39;uovo in una nuova piastra di Petri e ri-asciutto. Re-hatch uova dopo ~ 1 settimana e ancora coincidono uova schiuse utilizzando il metodo di cui sopra. </li><li> Documenti Posizionare uovo con lo u rimanenti<html> uova n-covato in nuovi 90 ml capsule di Petri con una soluzione sbiancante circa 80 ml ​​28. Assicurarsi che le carte di uova sono completamente immersi in soluzione sbiancante e lasciare sotto una cappa durante la notte per evitare l&#39;odore di candeggina. NOTA: Bleaching soluzione può essere conservata per ~ 1 settimana a 4 ° C, ma dovrebbe tuttavia essere fatta fresca. </li><li> Controllare le uova con un microscopio ottico come sbiancamento cancellerà il corion e permettere la visualizzazione di embrionate, uova non-covato. Se l&#39;uovo è embrionate, l&#39;uovo avrà un colore bianco sporco, con gli occhi che appaiono come due piccoli punti neri di fronte all&#39;altro sul lato dorsale. Coincidere il numero di non-nati, uova embrionate 13. </li><li> Determinare l&#39;incidenza diapausa con la seguente formula:% diapausa = no. uova embrionate un-nati / (n. di uova schiuse + n. embrionate di uova non-covato) x 100 13. </li></ol> 7. RNA Estrazione da uova / pharate Larve ONTENUTO &quot;&gt; NOTA: Uso Trizol in una cappa a flusso laminare. <ol><li> Uova di zanzara Brush contenenti embrioni in via di sviluppo o larve pharate in distinti momenti di sviluppo dalle carte a base di uova a macine di vetro con un pennello di peli di cammello. Macinare le uova in Trizol (1 ml per 50-100 mg di tessuto) fino a completo polverizzato. Utilizzare almeno 400 uova per biblioteca per produrre RNA sufficiente. <ol><li> In alternativa, far scattare le uova congelare in azoto liquido e conservati a -80 ° C in provette da microcentrifuga fino a un mese prima della macinazione, in Trizol. </li></ol></li><li> Eseguire l&#39;estrazione di RNA in Trizol seguita da isopropanolo precipitazione secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Trattare panchina con soluzione RNase decontaminazione o altri agenti per rimuovere eventuali residui nucleasi per evitare la degradazione dell&#39;RNA. <ol><li> Trattare l&#39;RNA estratto con DNasi. Secondo le indicazioni del produttore, incubare i campioni di RNA con DNasi per 30 minuti a 37 ° C. Utilizzare 1 &amp; #181; l DNasi fino a 10 mg di RNA in una reazione di 50 microlitri. Aumentare la quantità di DNasi se vi sono più di 10 mg di RNA in una reazione. </li><li> Inattivare DNase aggiungendo 5 ml DNasi sospeso inattivazione reagente. Incubare 5 min a temperatura ambiente, mescolando tre volte durante il periodo di incubazione (vortex). </li><li> Centrifugare a 10.000 g per 1.5 min. Trasferire il surnatante contenente i campioni di RNA trattati ai tubi freschi per fasi successive. </li></ol></li><li> Valutare la qualità dei campioni di RNA totale da fluorometria. Inviare i campioni ad un impianto di specialità con strumento adeguato per questo compito. L&#39;impianto eseguirà elettroforesi su gel-chip per determinare le dimensioni delle specie di RNA nel campione, visualizzati da colorante fluorescente instillato nel chip. I risultati saranno restituiti come elettroferogramma. <ol><li> Determinare l&#39;integrità dei campioni di RNA totale dalla presenza o l&#39;assenza di prodotti di degradazione, come dimostra la presenza opicchi F tra le 18S e 5S ribosomiale picchi RNA sul dell&#39;elettroferogramma risultante (Figura 1B). </li></ol></li></ol> 8. RNA Sequencing <ol><li> Invia campioni di RNA totale con qualità sufficientemente elevata (Figura 1A) e quantità (generalmente&gt; 3 mg per libreria) a un centro commerciale sequenziamento per la costruzione di librerie arricchiti accoppiato fascia mRNA mRNA e sequenziamento, seguendo protocolli standard. </li><li> Se più di una corsia viene utilizzato per il sequenziamento di un singolo esperimento, dividere singole biblioteche in due corsie per il sequenziamento in funzione delle variazioni tecniche tra vicoli durante la sequenza. </li></ol> 9. lllumina Leggi Cleaning NOTA: La Figura 2 riassume la parte bioinformatica di questo protocollo. Per un elenco completo di tutti i programmi e le risorse utilizzate nella sezione bioinformatica di questo protocollo, fare riferimento alla Tabella 1. InInoltre, File supplementare 1 contiene esempi riga di comando per ciascuna delle seguenti fasi di protocollo di bioinformatica. <ol><li> Utilizzare ssaha2 29 (Tabella 1) per identificare le partite di 95% di identità o superiore al database NCBI UniVec core (Tabella 1), A. albopictus sequenza rRNA (GenBank # L22060.1), e gli adattatori di sequenziamento (esempi dettagliata della riga di comando fornite in file supplementare 1). Rimuovere le coppie a capire con le partite utilizzando Perl o uno strumento di scripting simile, ad esempio adattando lo script Perl in dotazione (File supplementare 2). </li><li> Pulire rimanendo legge con il pacchetto SolexaQA 30 (Tabella 1; Supplemental File 1): tagliare le regioni con un punteggio Phred equivalente di meno di 20 utilizzando le impostazioni predefinite di DynamicTrim.pl. <ol><li> Rimuovere legge più breve di 25 bp con LengthSort.pl sia in avanti e retromarcia legge simultaneamente. Valutare la qualità dei file puliti FASTQ con FastQC (Tabella 1 </strong&gt;) - in particolare, verificare che la qualità per-base di sequenza e il punteggio di qualità per-sequenza sono al di sopra di 20. </li></ol></li></ol> 10. Digital Normalizzazione <ol><li> Effettuare un giro di normalizzazione digitale sul pulito legge utilizzando lo strumento khmer 31 (Tabella 1; Supplemental File 1), in particolare normalize-by-median.py (con dimensioni della k-mer 20, una copertura cut-off di 20, e x = 1e10). </li><li> In alternativa, se una macchina ad alta RAM è disponibile (centinaia di GB), utilizzare lo script normalize_by_kmer_coverage.pl di Trinity (Tabella 1). </li></ol> 11. De Novo trascrittoma Assembly <ol><li> Ottenere accesso a un computer o un computer cluster con fino a 256 Gb di RAM e 24 CPU, a seconda delle dimensioni del gruppo. </li><li> Utilizzare Trinity 32 (Tabella 1; File supplementare 1) per assemblare la lettura digitale normalizzato impostare in contigs. Per ridurrel&#39;utilizzo della memoria, uso --min_kmer_cov 2. </li></ol> 12. Assemblea valutazione <ol><li> Eseguire assemblathon_stats.pl dal progetto Assemblathon2 33 sull&#39;uscita contig Trinità. Questo script esegue i calcoli di base per affrontare la valutazione della qualità di assemblaggio, come il numero di ponteggi, N50, la composizione di assemblaggio, e più (Tabella 1; File supplementare 1). </li></ol> 13. Annotazione del trascrittoma Assemblato <ol><li> Eseguire BLASTX (Tabella 1) l&#39;insieme contro una serie proteina di riferimento; per le zanzare, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, e Aedes aegypti sono riferimenti adeguati. In particolare, formattare il file FASTA proteina di riferimento per esplosione, seguita da BLASTX (File supplementare 1). </li></ol> 14. Map Legge all&#39;Assemblea Utilizzo RSEM 34 (Tabella 1) <ol><li> Creare un file &#39;trascrizione-to-gene-map&#39;, in cui laprima colonna contiene gli ID del gene di riferimento, e la seconda colonna della IDS contig. In un editor di fogli di calcolo, scambiare la prima e la seconda colonna della uscita BLASTX, e scrivere queste colonne in un file .txt. Utilizzare il programma per convertire linebreak interruzioni di riga nel file .txt risultante in formato Unix. </li><li> Creare un set di dati di riferimento dal file FASTA trascrittoma utilizzando lo script rsem-preparare-riferimento, fornito nella confezione RSEM (File supplementare 1). </li><li> Calcolare i valori di espressione separatamente per ciascuna libreria utilizzando il comando rsem-calcolo-espressione, fornito nella confezione RSEM (File supplementare 1). Come si legge, utilizzare i file abbinati FASTQ risultanti dal passo-lettura pulizia (punto 9.2). <ol><li> Se RNA da una replica biologico è stato diviso in due corsie per il sequenziamento, includere entrambi i file FASTQ nel calcolo dell&#39;espressione per generare un unico file. </li></ol></li><li> Convertire i risultati di espressione di ogni libreria a una matrice facilmente trattati da altri programs utilizzando lo script rsem-generate-data-matrix forniti, forniti nella confezione RSEM (File supplementare 1). </li></ol> 15. Espressione Differential Analysis <ol><li> Installare R e levigabordi (Tabella 1). </li><li> Utilizzare read.delim per caricare i risultati RSEM dal punto 14.3 (File supplementare 1). Se necessario, completano i conteggi al numero intero più vicino. NOTA: La guida Edger raccomanda di limitare il dataset di geni con abbastanza espressione elevata per rilevare significato. </li><li> Per formattare i dati per edger, generare un oggetto DGEList dal file di dati caricati (File supplementare 1). Poi, normalizzare i dati utilizzando TMM normalizzazione (File supplementare 1). Stimare le dispersioni comuni e tagwise dei dati (File supplementare 1). </li><li> Identificare geni differenzialmente espressi con un Benjamini-Hochberg corretto p-value &lt;0.05 (File supplementare 1). Tracciare la distribuzione di log-fold-change vs. abbondanza (File supplementare 1). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo presenta i metodi per scoprire i geni differenzialmente espressi a causa photoperiodically diapausa indotta in A. albopictus. Il protocollo è significativo in quanto combina in modo unico allevamento di zanzare e di bioinformatica tecniche per rendere tutti gli aspetti sperimentali di un programma di fisiologia molecolare accessibile agli utenti alle prime armi - in particolare quelli incentrati sulla risposta diapausa photoperiodic. Metodi esistenti, a nostra conoscenza, non forniscono più de...

I rapidi progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) stanno fornendo interessanti opportunità per sondare le basi molecolari di un'ampia gamma di adattamenti ecologici geneticamente complessi in un'ampia varietà di organismi non modello 1-3. Questo approccio è estremamente potente perché stabilisce una base per studi di genomica funzionale e di popolazione di organismi con una storia ecologica o evolutiva particolarmente interessante e/o ben descritta, nonché di organismi di interesse pratico, come parassiti agricoli e vettori di malattie. Pertanto, le tecnologie NGS stanno portando a rapidi progressi nel campo dell'ecologia e hanno il potenziale per affrontare problemi come la comprensione delle basi meccanicistiche delle risposte biologiche ai rapidi cambiamenti climatici contemporanei4, la diffusione di specie invasive5 e le interazioni ospite-patogeno6,7.
Lo straordinario potenziale delle tecnologie NGS per affrontare questioni di base e applicate in ecologia e biologia evolutiva è in parte dovuto al fatto che questi approcci possono essere applicati a qualsiasi organismo a un costo moderato che è fattibile per la maggior parte dei laboratori di ricerca. Inoltre, questi approcci forniscono informazioni sull'intero genoma senza la necessità di risorse genetiche a priori come un chip di microarray o una sequenza genomica completa. Tuttavia, per massimizzare la produttività degli esperimenti NGS è necessario considerare attentamente il disegno sperimentale, comprese questioni come i tempi di sviluppo e la specificità tissutale del campionamento dell'RNA. Inoltre, le competenze tecniche necessarie per analizzare le enormi quantità di dati prodotti da questi esperimenti, spesso fino a diverse centinaia di milioni di sequenze di DNA, hanno rappresentato una sfida particolare e hanno limitato l'implementazione diffusa degli approcci NGS.
Recenti studi RNA-Seq sulle basi trascrizionali della diapausa nella zanzara invasiva e importante dal punto di vista medico Aedes albopictus forniscono un utile esempio di alcuni dei protocolli sperimentali che possono essere impiegati per applicare con successo la tecnologia NGS allo studio delle basi molecolari di un complesso adattamento ecologico in un organismo non modello 8-10. A. albopictus è una specie altamente invasiva originaria dell'Asia, ma che ha recentemente invaso il Nord America, il Sud America, l'Europa e l'Africa11,12. Come molti insetti temperati, le popolazioni temperate di A. albopictus sopravvivono durante l'inverno entrando in un tipo di dormienza denominata diapausa fotoperiodica. In A. albopictus, l'esposizione di femmine pupali e adulte a giornate brevi (autunnali) porta alla produzione di uova in diapausa in cui lo sviluppo embriologico è completato, ma la larva di farato all'interno del corion dell'uovo entra in un arresto dello sviluppo che rende l'uovo refrattario allo stimolo di schiusa15-17. Le uova in diapausa sono più resistenti all'essiccazione5,18 e contengono più lipidi totali19 rispetto alle uova non in diapausa. La diapausa fotoperiodica in A. albopictus è quindi una plasticità fenotipica adattativa controllata dalla madre, essenziale per sopravvivere alle dure condizioni invernali in ambienti temperati. Nonostante il significato ecologico ben compreso della diapausa fotoperiodica in un'ampia gamma di insetti20,21, le basi molecolari di questo adattamento cruciale non sono ben caratterizzate in nessun insetto22. In organismi come A. albopictus che subiscono una diapausa embrionale allo stadio larvale del farato, rimane una sfida particolarmente convincente capire come il segnale fotoperiodico ricevuto dalla madre venga trasmesso alla prole e persista nel corso dello sviluppo embrionale per causare l'arresto allo stadio larvale del farato.
Questo protocollo descrive l'allevamento delle zanzare, il disegno sperimentale e le analisi bioinformatiche per esperimenti NGS (sequenziamento del trascrittoma) eseguiti per chiarire i componenti trascrizionali della diapausa fotoperiodica in A. albopictus. Questo protocollo può essere utilizzato per ulteriori studi sulla diapausa in A. albopictus, può essere adattato per studiare la diapausa in altre specie strettamente correlate come altre zanzare aedine che subiscono diapausa delle uova23, ed è anche più in generale rilevante per l'impiego di approcci NGS per studiare le basi trascrizionali di qualsiasi adattamento complesso in qualsiasi insetto.

<table><tbody><tr><td>Incubatrice - Modello 818</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3751</td><td>120 V</td></tr><tr><td>Sala in ambiente controllato</td><td>Thermax Scientific</td><td>N/A</td><td>Camera in ambiente controllato walk-in costruita su specifiche personalizzate da Thermax Scientific Products. Un'alternativa più ampia a un'incubatrice. http://thermmax.com/</td></tr> <tr><td>Lampadina fluorescente</td><td>fredda Philips</td><td>392183</td><td>4 W</td></tr><tr><td>Piastra di Petri 100 mm x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro 20,5 cm</td><td>Fisher</td><td>09-803-6J</td><td></td></tr><tr><td>9,5 L Secchio</td><td>Plastican</td><td>Bway Prodotti</td><td>http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117</td></tr><tr><td>Utilità Tessuto-Zanzariera Bianco</td><td>Joann</td><td>10173292</td><td>http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html</td></tr><tr><td>Calze ortopediche</td><td>Albahealth</td><td>23650-040</td><td>prodotto n. 081420</td></tr><tr><td>Uvetta biologica</td><td>Newman's Own</td><td>UPC: 884284040255</td><td></td></tr><tr><td>Tazze per ovideposizione (marrone)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-52</td><td>Il prodotto è in realtà un flacone ambrato da 125 ml di cui abbiamo visto la parte superiore.</td></tr><tr><td>Asciugamani di carta riciclata</td><td>Settima generazione</td><td>30BPT120</td><td></td></tr><tr><td>Set modulare di tupperware quadrati Mates</td><td>Tupperware</td><td></td><td>http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items</td></tr><tr><td>Grinder in vetro</td><td>Corning Incorporated</td><td>7727-2</td><td>Questi macinatori di tessuti Tenbroeck rompono le uova e rilasciano RNA nel reagente TRI.</td></tr><tr><td>Reagente TRI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td>Applicare 1 ml di reagente TRI per 50-100 mg di tessuto. Attenzione &#8212; Questo reagente è tossico.</td></tr><tr><td>TURBO Senza DNA</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>Questo kit genera una resa maggiore rispetto al tradizionale trattamento con DNasi seguito dalla purificazione con fenolo/cloroformio ed è più semplice da usare.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM9782</td><td>Applicare generosamente sulle superfici del banco e su qualsiasi apparecchiatura che potrebbe essere a contatto con i campioni di RNA. La soluzione è leggermente alcalina/corrosiva, può causare irritazione ed è dannosa se ingerita.</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Posiziona fino a 12 campioni di RNA su un chip.</td></tr><tr><td>Alimentatore a membrana Hemotek</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>5W1</td><td>Questo sistema prevede 5 stazioni di alimentazione che possono essere utilizzate contemporaneamente. Include l'unità di alimentazione PS5 e il cavo di alimentazione; 5 alimentatori FUI + serbatoi pasto e O-ring; Tappi in plastica, membrana di alimentazione in collagene Hemotek; Strumento di impostazione della temperatura; e Strumento di estrazione della spina. L'indirizzo postale dell'azienda è: Hemotek Ltd; Unità 5 Corte dell'Unione; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, Regno Unito; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.</td></tr><tr><td>Termometro digitale e sonda</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>Termometro MT3KFU</td><td>MicroT3 e sonda KFU. Viene utilizzato per impostare la temperatura di ciascuna unità di alimentazione FUI.</td></tr><tr><td>Sangue intero di pollo, non sterile con citrato di sodio</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>33130-1</td><td>I 500 ml di sangue sono stati congelati e conservati in aliquote da 20 ml a -80 &#176; C per un massimo di 1 anno. Scongelare il sangue a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell'uso.</td></tr></tbody></table>

un sperimentale e bioinformatica protocollo per analisi di rna-seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre, aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

La diapausa fotoperiodica è un adattamento importante che consente agli individui di sfuggire agli ambienti stagionali difficili attraverso una serie di cambiamenti fisiologici, in particolare l'arresto dello sviluppo e la riduzione del metabolismo. La profilazione globale dell'espressione genica tramite RNA-Seq può fornire importanti informazioni sui meccanismi trascrizionali della diapausa fotoperiodica. La zanzara tigre asiatica, Aedes albopictus, è un organismo eccezionale per lo studio delle basi trascrizionali della diapausa grazie alla sua facilità di allevamento, alla diapausa facilmente indotta e alle risorse genomiche disponibili. Questo manoscritto presenta un flusso di lavoro sperimentale generale per identificare le differenze trascrizionali indotte dalla diapausa in A. albopictus. Sono documentate le tecniche di allevamento, le condizioni necessarie per indurre lo sviluppo della diapausa e della non diapausa, i metodi per stimare la percentuale di diapausa in una popolazione e l'estrazione dell'RNA e la valutazione dell'integrità delle zanzare. Un flusso di lavoro per elaborare i dati RNA-Seq dai sequenziatori Illumina culmina in un elenco di geni espressi in modo differenziale. I risultati rappresentativi dimostrano che questo protocollo può essere utilizzato per identificare efficacemente i geni regolati in modo differenziale a livello trascrizionale in A. albopictus a causa di differenze fotoperiodiche. Con modesti aggiustamenti, questo flusso di lavoro può essere facilmente adattato per studiare le basi trascrizionali della diapausa o altri importanti tratti della storia della vita in altre zanzare.

Fluorometria di due campioni di RNA rappresentativi mostrato due bande a circa 2.000 nt (Figura 1A, B). Il 28S insetti RNA ribosomiale è costituito da due catene polinucleotidiche tenuti insieme da legami di idrogeno, che sono facilmente interrotti da brevi riscaldamento o agenti che sconvolgono legami idrogeno 35. Le risultanti due componenti sono approssimativamente le stesse dimensioni del 18S RNA ribosomiale. Il secondo campione RNA mostrato elevati livelli di degrado (Figura 1B)....

Le analisi dell'RNA-Seq stanno diventando sempre più importanti per identificare le basi molecolari dei tratti adattativi negli organismi non modello. Qui, viene descritto un protocollo per identificare i geni differenzialmente espressi tra zanzare Aedes albopictus in diapausa e non in diapausa, dall'allevamento delle zanzare, al sequenziamento dell'RNA e alle analisi bioinformatiche dei dati RNA-Seq.

Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare i componenti trascrizionali della risposta alla diapausa fotoperiodica. In un pictus a gomito degli anni ottanta di zanzara non modello, ciò si ottiene producendo prima campioni biologicamente replicati di uova in diapausa e non in diapausa attraverso diversi trattamenti fotoperiodici. In una seconda fase, l'RNA viene estratto da ciascuna replicata per il sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento.Le sequenze di RNA vengono quindi elaborate computazionalmente per assemblarle in cong e per annotarle. In definitiva, le variazioni nell'espressione genica in risposta ai periodi fotografici che inducono la diapausa rispetto a quelli che non inducono la diapausa possono essere dedotte dal MAP di Reeds all'assemblaggio dell'RNA. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi a raggi micro, è che non sono necessarie risorse genetiche preliminari, come la sequenza del genoma o un microarray, per ottenere stime globali dell'espressione genica in risposta a condizioni di diapausa.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genomica ecologica, come ad esempio qual è la base trascrizionale delle DPO o altri adattamenti ecologici chiave negli organismi non modello. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà in quanto può essere difficile ottenere quantità sufficienti di ovuli in diapausa e non DPO e l'analisi bioinformatica a valle può essere impegnativa. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo notato che le tecnologie di sequenziamento del DNA ad alto rendimento stavano diventando più convenienti e offrivano un metodo trattabile per ottenere profili di espressione dell'intero genoma in organismi non modello Prima di iniziare la procedura.Impostare due armadi fotoperiodici con illuminazione programmabile a 21 gradi Celsius per un'espressione ottimale della diapausa e circa l'80% di umidità relativa Programmare un armadio per un periodo fotografico che non induce diapausa con un ciclo di buio a 16 luci e l'altro per una diapausa che induce un ciclo di buio a otto luci con le luci accese contemporaneamente per entrambi gli armadi per sincronizzare il tempo circadiano tra i periodi fotografici. Quindi, immergere la carta per uova per il numero appropriato di uova in 500 millilitri di acqua deionizzata e aggiungere un millilitro di cibo per cani macinato e liquame di cibo per gamberetti in salamoia. Copri il contenitore con una rete posizionando un elastico attorno alla rete per tenerlo in posizione.Quindi incubare le uova nell'armadio fotografico 16 otto light dark long day per circa 24 ore. Il giorno successivo, trasferisci circa 30 larve schiuse per gruppo in singole piastre di Petri di 10 per 10 per due centimetri riempite con 90 millilitri di acqua deionizzata. Ogni 48-72 ore, trasferire le larve in un piatto pulito, nutrendole con liquame di cibo fresco ad ogni trasferimento.Dopo circa sei giorni, rivesti il fondo di tre o quattro gabbie per adulti per ogni trattamento fotoperiodico con carta da filtro bagnata e inumidisci la carta da filtro con abbastanza acqua deionizzata per aumentare l'umidità locale nella gabbia evitando l'acqua stagnante. Annotare il periodo della foto, replicare il numero, la data di inizio della gabbia e altre informazioni rilevanti per l'esperimento con un pennarello indelebile sul lato della gabbia. Quindi, a giorni alterni per 10 giorni, trasferire il puy in piccole tazze di acqua pulita a non più di 50 puy per 25 millilitri di acqua nelle gabbie per adulti appropriate per l'esperimento e posizionare l'uvetta organica sulla rete superiore della gabbia per fornire zucchero agli adulti emersi Per stimolare la posizione degli ovuli quattro o cinque giorni dopo il primo pasto di sangue, Riempi a metà tazze da 50 millilitri di colore scuro foderate con un tovagliolo di carta testurizzato non sbiancato con acqua deionizzata e metti una tazza in ogni gabbia per raccogliere e conservare le uova.Sostituisci le carte delle uova in ogni gabbia con carta fresca, posizionando le carte rimosse di recente in piastre di Petri e conservandole nell'armadio per il periodo fotografico a 16 giorni corti scuri e leggeri per evitare effetti di confusione sulla conservazione delle uova. Circa 48 ore dopo la raccolta, asciugare le cartine all'aria aperta in modo che risultino flosce e leggermente umide al tatto, ma non così bagnate da far sì che le cartine siano scure a causa dell'acqua o stimolino la schiusa. Per misurare gli incidenti di diapausa, registrare il numero di uova su ogni carta per uova.Quindi immergere completamente le singole cartine in una capsula di Petri da 90 millilitri con circa 80 millilitri di acqua deionizzata. Per stimolarne la schiusa, aggiungere circa 0,25 millilitri di impasto alimentare e poi, dopo 24 ore, trasferire la capsula di Petri su una superficie nera. Ora posiziona una fonte di luce su un lato del, le larve si allontaneranno dalla luce, consentendo un conteggio chiaro dell'individuo prima nelle larve stellari.Utilizzare una pipetta per rimuovere ogni larva dopo il conteggio per evitare di contare gli individui. Quindi mettere le cartine all'uovo in una nuova capsula di Petri per farle asciugare in rosso. Dopo aver contato un secondo lotto di piccoli una settimana dopo, posizionare le cartine con le uova rimanenti non schiuse in nuove piastre di Petri da 90 millilitri con circa 80 millilitri di soluzione sbiancante fresca, facendo attenzione che le cartine siano completamente immerse nella soluzione sbiancante.Lasciare le cartine sotto una cappa aspirante per una notte e poi il giorno successivo utilizzare un microscopio ottico per contare il numero di uova non schiuse. Se un uovo è embrionato, mostrerà un colore bianco sporco con gli occhi che appaiono come due piccoli punti neri uno di fronte all'altro sul lato dorsale. Per iniziare, pulire accuratamente il banco con una soluzione di decontaminazione dell'RNA per rimuovere eventuali nucleasi residue ed evitare la degradazione dell'RNA.Quindi, usa una spazzola di pelo di cammello per spazzolare almeno 400 uova di zanzara contenenti embrioni in via di sviluppo al momento dello sviluppo. Punto di interesse nelle smerigliatrici per vetro. In una cappa aspirante, aggiungere un millilitro di triolo e macinare le uova fino a quando non sono completamente polverizzate, quindi eseguire l'estrazione dell'RNA in triolo, seguita dalla precipitazione dell'isopropanolo secondo le istruzioni del produttore.Ora usa fino a un microlitro di D ns per un massimo di 10 microgrammi di RNA in 50 microlitri di reazione per 30 minuti a 37 gradi Celsius secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, incubare la reazione in cinque microlitri di reagente di inattivazione del DNA sospeso per cinque minuti a temperatura ambiente. Agitare delicatamente la sospensione tre volte durante il periodo di incubazione.Quindi centrifugare gli estratti di RNA per 1,5 minuti a 10.000 volte G ed Eloqua, l'RNA contenente surnatanti, in provette fresche per il sequenziamento. Infine, consulta il testo di accompagnamento per i dettagli su come elaborare i dati di sequenziamento di nuova generazione risultanti dalla lettura, preparazione, assemblaggio e annotazione all'analisi delle espressioni differenziali. In questa prima figura, la fluorimetria di due campioni di RNA rappresentativi mostra due bande a circa 2000 nucleotidi.L'RNA ribosomiale dell'insetto 28 è costituito da due catene polinucleotidiche tenute insieme da legami idrogeno che vengono facilmente interrotte da un breve riscaldamento o da agenti che rompono i legami idrogeno. I due componenti risultanti hanno approssimativamente le stesse dimensioni di un RNA ribosomiale 18 s nel secondo campione di RNA si possono osservare alti livelli di degradazione in questo esperimento rappresentativo. Il trattamento fotoperiodico di un gruppo rappresentativo di zanzare albopictus ha provocato un'elevata diapausa nelle zanzare allevate a giorno corto e un basso diapausa nelle zanzare allevate a giorno lungo.Sebbene ci fosse una certa variazione tra le repliche, ad esempio, il gruppo del secondo giorno corto ha mostrato un minor numero di incidenti di diapausa rispetto alle altre repliche. Un assemblaggio Trinity di letture normalizzate digitalmente ha prodotto 76.377 contigs con una lunghezza media di conig di 1020 3.1 e una lunghezza massima di Conti di 20.892. Si noti che la distribuzione delle lunghezze di Conti è fortemente sbilanciata verso contigs più corti.Questo è tipico dell'assemblaggio del trascrittoma Denovo. In questo grafico finale, le analisi di espressione differenziale di un flusso di lavoro simile di embrioni allevati in condizioni che inducono diapausa a 11 e 21 giorni dopo la posizione degli ovuli rivelano 3.128 geni espressi in modo differenziale tra questi due periodi di tempo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei-otto mesi dalla generazione dei tessuti, dall'analisi dell'informatica divina se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il successo di ogni passaggio deve essere verificato prima di passare al passaggio successivo. Ad esempio, confermare che le condizioni sperimentali abbiano prodotto DPA e ovuli non in diapausa prima di testare l'integrità dell'RNA Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'analisi quantitativa R-T-P-C-R, o l'analisi genomica comparativa possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti l'espressione specifica dei geni di interesse o dello sviluppo e/o i processi di evoluzione molecolare.Non dimenticare che lavorare con il triolo può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di guanti, camice da laboratorio e cappa aspirante.

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