Analisi della migrazione delle cellule all'interno di una tridimensionale di collagene Matrix
5 ottobre 2014
Migrazione delle cellule è un fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di fisiologica, come la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie, e dei processi fisiopatologici, come il cancro. Il test di migrazione matrice 3D-collagene è uno strumento versatile per analizzare le proprietà migratorie dei diversi tipi di cellule all'interno di in un ambiente fisiologico simile a 3D.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di analizzare il comportamento migratorio delle cellule all'interno dell'ambiente tridimensionale. Innanzitutto, incorporare le cellule di interesse in un reticolo di collagene tridimensionale. Quindi registrare il movimento delle cellule mediante microscopia video time lapse, delineare i parametri di migrazione mediante il tracciamento cellulare assistito da computer e analizzare i dati di tracciamento cellulare utilizzando un'applicazione software per fogli di calcolo.
In definitiva, questo metodo può essere utilizzato per studiare quali fattori e vie di trasduzione del segnale regolano la migrazione delle cellule tumorali o delle cellule normali come leucociti, linfociti e cellule staminali nel contesto del cancro. Pertanto, la conoscenza della migrazione cellulare, dei fattori modulanti e delle vie di trassezione del segnale associate potrebbe essere utile per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per compromettere la migrazione delle cellule tumorali e la diffusione metastatica. Per le camere di migrazione spazzolare rapidamente due strati di cera di paraffina fusa, vaselina mescolare al centro di un vetrino, aggiungere un coperchio, scivolare e sigillare con due strati di cera di paraffina, vaselina miscela.
Quindi posizionare le camere di migrazione in posizione verticale in una rastrelliera per provette di reazione da 1,5 millilitri. Aggiungere 20 microlitri di sospensione cellulare per la sospensione di collagene. Combinare accuratamente 50 microlitri di 10 XMEM e 27 microlitri di soluzione di bicarbonato di sodio al 7,5%.
Quindi aggiungere 375 microlitri di sospensione di collagene liquido e mescolare accuratamente per ottenere un colore viola chiaro che indica un pH di 7,5. Ora aggiungi 100 microlitri della sospensione finale di collagene a 50 microlitri della sospensione cellulare e mescola accuratamente notando l'inizio della fibra di collagene. Polimerizzazione. A pH 7,5, trasferire la miscela nelle camere di migrazione.
Picchiettare delicatamente la camera di migrazione per distribuire uniformemente la miscela di cellule in sospensione di collagene sul fondo della camera della catena di migrazione. Posizionare le camere di migrazione in posizione verticale nel rack e incubare per 30 minuti. Quando il reticolo di collagene polimerizzato è leggermente torbido, ma ancora di colore viola chiaro, riempire le camere di migrazione con il mezzo appropriato e sigillare la camera di migrazione con cera di paraffina.
Miscela di vaselina. Regolare il riscaldatore del tavolino del microscopio a 37 gradi Celsius utilizzando un ingrandimento di 10x sulla camera di migrazione. Mettere a fuoco circa 50 o più celle nel campo visivo.
Registra la migrazione delle celle in modalità time lapse utilizzando un'applicazione software di videosorveglianza multi-camera. Salva i filmati di migrazione delle celle in un formato di file appropriato. Collegare i file del filmato sulla migrazione cellulare a un database contenente informazioni di supporto come il tipo di cellula e le condizioni sperimentali.
Successivamente, analizza i filmati di migrazione cellulare utilizzando un'applicazione software di tracciamento cellulare appropriata per un'analisi imparziale. Selezionare casualmente le cellule per l'analisi senza sapere se le cellule sono attive in modo migratorio, determinare circa 60 coordinate XY per cella in un tipico esperimento di migrazione cellulare. In caso di divisione cellulare, scegli casualmente una cellula figlia da seguire nel tracciamento.
Analizza i dati di tracciamento delle celle utilizzando un'applicazione software appropriata come un foglio di calcolo per calcolare la distanza totale percorsa da una cella. Moltiplica la somma dei valori numerici dei pixel per un fattore di correzione per la conversione in micron. Definite le celle che sono migrate a una lunghezza inferiore alla soglia di 25 micron come celle non in movimento e sostituite i valori numerici con una virgola.
Successivamente, calcola l'attività locomotoria come percentuale di cellule della popolazione cellulare tracciata che si sono spostate tra due punti temporali. Inoltre, calcola il tempo di movimento attivo come percentuale del tempo totale di migrazione di una cellula in relazione all'intervallo di tempo del periodo di osservazione. Quindi calcola la significatività statistica utilizzando il test U di Man Whitney e visualizza i dati sulla migrazione cellulare.
Un tipico file di dati di rilevamento delle celle è simile a una tabella in cui ogni colonna rappresenta una cella tracciata. Le righe contengono le informazioni sulla posizione sul movimento delle celle. Nel tempo, il comportamento locomotore delle cellule può essere caratterizzato dall'attività locomotoria media della popolazione cellulare analizzata e anche dal tempo di movimento attivo.
Questo esempio mostra le attività migratorie di 120 cellule provenienti da quattro esperimenti indipendenti. Ogni rombo indica che una cella si è spostata tra almeno due punti temporali. Le linee grigie differenziano le celle in movimento e quelle non in movimento.
Il parametro dell'attività della locomotiva può essere visualizzato come diagramma XY o come box plot. Per visualizzare la dinamica della popolazione cellulare analizzata, un istogramma mostra efficacemente il tempo di attività di quelle stesse cellule. Questa analisi del comportamento migratorio delle linee cellulari di carcinoma mammario MDA HER2 e M-D-A-N-E-O indica che entrambe le linee cellulari hanno mostrato un'attività locomotoria spontanea simile.
Il parametro tempo attivo ha rivelato un numero leggermente superiore di cellule M-D-A-H-E-R in movimento spontaneo rispetto alle cellule di carcinoma mammario MDA-NO. La stimolazione con 100 nanogrammi per millilitro di EGF ha determinato un aumento significativo dell'attività migratoria di MDA HER2, misurata dal numero di cellule in movimento e dal tempo di movimento attivo. È interessante notare che le cellule M-D-A-N-E-O sono migrate in risposta alla stimolazione dell'EGF e hanno mostrato un pattern attivo nel tempo spostato Il trattamento con l'inibitore della fosfolipasi c gamma one uc 3 1 22 ha ridotto sia la migrazione spontanea che quella indotta dall'EGF sia di M-D-E-E-R due che di MDAN.
Cellule EEO. L'analisi del parametro tempo attivo ha rivelato che il trattamento delle cellule MDAN EEO con due micromolari di U 7 3 1 2 2 ha determinato una marcata diminuzione dell'attività locomotoria, principalmente attribuita a un aumento della quantità di cellule non in movimento. Una volta padroneggiata la migrazione di linfociti e leucociti in un collagene tridimensionale, le lettere e la mente possono essere registrate in circa due ore, mentre le cellule tumorali vengono registrate durante la notte.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
In questo articolo viene discussa l'analisi della migrazione cellulare all'interno di una matrice tridimensionale di collagene, un aspetto fondamentale di diversi processi fisiologici e patologici. Il metodo consente di indagare i fattori che influenzano il movimento cellulare, in particolare nella ricerca sul cancro.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Ricerca sul cancro
Sfondo
- La migrazione cellulare è essenziale per la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie.
- Svolge un ruolo significativo nella metastasi tumorale.
- Comprendere i meccanismi della migrazione può contribuire allo sviluppo di strategie terapeutiche.
- La matrice tridimensionale di collagene fornisce un ambiente più fisiologico per lo studio del comportamento cellulare.
Scopo dello studio
- Analizzare il comportamento migratorio di diversi tipi cellulari in un ambiente 3D.
- Identificare i fattori e le vie che regolano la migrazione cellulare.
- Ampliare le conoscenze per lo sviluppo di terapie contro la diffusione tumorale.
Metodi Utilizzati
- Incorporazione delle cellule in un reticolo tridimensionale di collagene.
- Registrazione del movimento cellulare mediante microscopia video a intervalli di tempo.
- Definizione dei parametri di migrazione tramite tracciamento assistito da computer.
- Analisi dei dati con software per fogli di calcolo.
Risultati principali
- Monitoraggio riuscito della migrazione cellulare in una matrice 3D.
- Identificazione dei fattori chiave che influenzano il movimento cellulare.
- Informazioni sui percorsi di trasduzione del segnale correlati alla migrazione.
- Ripercussioni potenziali per le strategie di trattamento del cancro.
Conclusioni
- La matrice di collagene 3D è efficace per lo studio della migrazione cellulare.
- Comprendere la migrazione può portare a nuovi approcci terapeutici.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare meccanismi regolatori specifici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi della migrazione cellulare in una matrice tridimensionale di collagene fisiologicamente rilevante fornisce un'elevata affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, rivelando in che modo fattori pro-migratori e inibitori modulano il comportamento locomotorio. Questo approccio supporta la riduzione dei rischi meccanicistici nei percorsi di oncologia e immunologia quantificando parametri migratori correlati al potenziale metastatico e al traffico delle cellule immunitarie. Il metodo consente decisioni basate sui dati di tipo go/no-go fin dalle fasi iniziali della scoperta, collegando perturbazioni molecolari a risposte funzionali migratorie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando come la stimolazione da EGF o l'inibizione di PLCγ1 alterino la migrazione cellulare in una matrice 3D.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli mediante il tracciamento quantitativo di parametri di migrazione come distanza totale e attività locomotoria.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafoglio identificando composti che riducono in modo significativo l'attività migratoria nei modelli cellulari di cancro.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce dati standardizzati e riproducibili sulla migrazione di cellule inglobate in una matrice fisiologica di collagene.
- Risultati quantitativi: Genera parametri misurabili, tra cui distanza totale di migrazione, percentuale di attività locomotoria e durata del movimento attivo.
- Scalabilità per lo screening: Consente test con molteplici condizioni (ad esempio stimolazione con EGF, trattamento con inibitori) mediante microscopia a intervalli e analisi basata su fogli elettronici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella la diffusione metastatica analizzando l'emigrazione delle cellule tumorali da sferoidi nella matrice di collagene.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati sulla migrazione della fase di scoperta alla validazione preclinica di terapie anti-migratorie.
- Avanzamento basato sul rischio: Guida le decisioni di progressione dimostrando effetti dose-dipendenti di composti come U73122 sull'attività locomotoria.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio di migrazione in collagene 3D si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo letture funzionali che collegano i saggi biochimici allo screening fenotipico.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici collegando modulatori della trasduzione del segnale (ad esempio, EGF, inibitori di PLCγ1) a modifiche nel comportamento migratorio.
- Screening: Fornisce metriche quantitative di migrazione pronte per saggi, che consentono una valutazione affidabile di composti su diversi tipi cellulari.
- Analisi: Genera coordinate XY tracciabili e parametri calcolabili (distanza totale, attività locomotoria) per confronti statistici mediante strumenti come il test U di Mann-Whitney.
- Ricerca traslazionale: Si allinea alla continuità preclinica modellando l'emigrazione cellulare da aggregati, un processo rilevante per metastasi e infiltrazione immunitaria.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per testare le risposte migratorie in linfociti, leucociti, cellule staminali e cellule tumorali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile sulla modulazione del bersaglio riducendo l'ambiguità meccanicistica nella regolazione della migrazione.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso parametri definiti (ad esempio, soglia di 25 micron per le cellule non mobili) e il tracciamento con acquisizioni a intervalli di tempo.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce dei candidati anti-migratori prima di costosi studi in vivo.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione corretta per il rischio quantificando gli effetti dei composti sulla migrazione in modelli tridimensionali rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nella preparazione della matrice di collagene e nell'allestimento della microscopia a tempo-lapse.
- È dipendente da strumentazione per il controllo ambientale (riscaldatore del palchetto a 37°C) e software per la sorveglianza video multicanale.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi nei protocolli di tracciamento cellulare (ad esempio, selezione cieca delle cellule, 60 coordinate XY per cellula).
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi cellulari (ad esempio, migrazione dei linfociti registrata in circa 2 ore rispetto a quella delle cellule tumorali durante la notte).
- È limitato dalla necessità di delimitare manualmente le camere di migrazione e sigillarle con una miscela di cera paraffinica e vaselina.
