Name: Manipolare il murino Ghiandola lacrimale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Impara a dissecare e coltivare ex vivo la ghiandola lacrimale murina per analizzare lo sviluppo embrionale e le vie di segnalazione. Questo metodo consente di studiare l'espressione proteica mediante microscopia a immunofluorescenza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare finanziamenti previsti dal Programma di allocazione delle risorse UCSF.

Tutto il lavoro degli animali sono state eseguite in stretta conformità con le raccomandazioni nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla cura e l&#39;uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) della University of California, San Francisco. 1. embrionali di topo lacrimale Ghiandole (LG): Raccolta e Microdissection <ol><li> A seguito di procedure approvate dalle Animali istituzionali per comitato della ricerca scientifica etica, eutanasia cronometrato in gravidanza CD-1 (o transgenici) femmine con l&#39;aumento della CO 2 inalazione, seguita da una conferma per dislocazione cervicale di embrioni consecutivi nella appropriata giorno embrionale. Designare il giorno della scoperta vaginale spina e0. Nota: ghiandole lacrimali (LGS) può essere raccolto dalla fase singola gemma E14 in poi. Tuttavia, E16 (5-10 gemme) embrioni danno i risultati più coerenti per ex vivo della cultura. </li><li> Sterilizzare il vlato entral del mouse utilizzando etanolo al 70%. Pizzicare la pelle e fare un&#39;incisione sulla linea mediana con le forbici chirurgiche sterili; tagliare attraverso la pelle e del peritoneo per esporre la cavità addominale. Rimuovere le 2 corna uterine tagliando lungo il mesometrio nella parte superiore di ogni corno uterino e posto in PBS freddo (Phosphate Buffered Saline) o DMEM F12 supporto integrato con 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina. </li><li> Utilizzando pinze (# 5), rimuovere gli embrioni dalle cavità amniotiche e mettere in una seconda piastra di Petri sterile contenente PBS freddo. Fare attenzione a non toccare gli occhi o la zona della testa. </li><li> Inserire embrione su un microscopio da dissezione con una base transilluminazione. Se l&#39;embrione è &lt;E17, eseguire i passaggi 1,5-1,7. Se gli embrioni sono&gt; E17, questa procedura può essere utile, ma non sono essenziali, quindi procedere al passaggio 1.8. </li><li> Sever testa dal tronco appena sotto la mandibola inferiore (fase 1, Figura 2) Struga bisturi sterile (# 10 lama). Ruotare testa in modo che la mandibola è ora su piastra dissezione. Utilizzare pinze per stabilizzare la testa e un bisturi per rimuovere circa ¼ del lato dorsale del cervello (fase 2, 1 ° taglio, Figura 2) - questo è particolarmente importante una volta che la cartilagine si irrigidisce intorno e15. </li><li> Orientare la testa in modo che il bisturi può perforare il naso tra gli occhi. Effettuare un taglio attraverso il centro della testa, in modo che gli occhi sono ora a metà separate (step 2, 2 ° taglio, Figura 2). </li><li> Utilizzando due # 5 pinze, prendere una metà della testa e rimuovere il tessuto in eccesso (vedere il punto 3, figura 2). Accertarsi di orientare la testa in modo che il LG (che si trova nell&#39;angolo posteriore inferiore dell&#39;occhio) non si perde in questo processo di rimozione. Rimuovere cerebrale in eccesso, cartilagine e tessuto nasale circostante e sotto l&#39;occhio. Dal momento che la ghiandola è appena visibile, a questo punto, assicurare l&#39;occhio sia correttamente orientata tessuto in eccesso dopo la rimozione to evitare di perdere la posizione del LG. </li><li> Afferrare con cura la pelle dalla parte posteriore, in basso dell&#39;occhio con entrambe le pinze. Togliere la pelle tirando delicatamente aperto con le pinze per esporre la LG. Utilizzare l&#39;illuminazione supplementare sopra e sotto il tessuto per aiutare a visualizzare la LG. Nota: L&#39;LG, distinguibile dal suo aspetto come gemma su un condotto all&#39;interno di una più scura, mesenchima condensato, deve essere visibile in questo punto. </li><li> Cominciare con cura per sezionare la LG e mesenchima associati (vedere lo schema e immagini) dal tessuto circostante usando pinze, facendo attenzione a non afferrare il LG o il suo canale associato. Una volta che la ghiandola è libero dal tessuto circostante, rimuovere delicatamente l&#39;intera ghiandola afferrando la epiteli circonda l&#39;occhio alla base del condotto LG. Fare attenzione a preservare il mesenchima che circonda l&#39;epitelio, che può essere osservata come un mesenchima condensata in cui le invaginates epitelio. NOTA: Alcuni eliminata anche la tissue (eventuali piccoli frammenti di ossa, muscoli e tessuto connettivo) può essere necessario per evitare la segnalazione fattori / crescita dal tessuto adiacente. </li><li> Per la cultura, il raccolto 4 - 5 ghiandole e mesenchima associati per piastra (enti locali sono placcati immediatamente dopo la dissezione); raccogliere un minimo di 14 ghiandole per 100 ml di RNA tampone di lisi per RT-PCR 6. </li></ol> 2. Preparare Piastre per ex vivo Cultura Questa procedura si basa su quello utilizzato per lo sviluppo delle ghiandole salivari 7,8. <ol><li> Aggiungere 200 ml di DMEM F12 (integrato con 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina) terreni di coltura con 50 mg / ml di acido ascorbico e 50 mg / ml di olo-transferrina ad un diametro di 50 millimetri piatto micropozzetti con fondo trasparente 7. Nota: DMEM F12 è stato scelto come abbiamo precedentemente trovato per massimizzare morfogenesi nella ghiandola salivare embrionale. </li><li> Float un Polycarb 13 millimetrifiltro a membrana Onate con 0,1 micron pori sulla parte superiore del supporto. </li><li> Passaggio opzionale: Diluire 3-D laminina 1: 1 con DMEM / F12 per effettuare una concentrazione finale di 3 mg / ml (200 ml utilizzare pipetta per mescolare delicatamente; centrifugare per 1 minuto se compaiono bolle). Aggiungere 15 ml di questo diluiti 3-D laminina per filtrare. Nota: Questa diluizione è risultata ottimale per mantenere LG nel suo stato 3D senza compromettere ramificazione epiteliale. Tuttavia, non è essenziale per la cultura di LG. </li><li> Mettere 4-5 LG sul filtro o in laminina. Cultura LGs ex vivo per 24 - 48 ore (Figura 3) o fissare con PFA 4% per 20 min per ulteriori analisi qPCR o immunocolorazione (Figura 4). Per l&#39;analisi qPCR di tessuto ghiandolare embrionale, si prega di fare riferimento al Rebustini et al., 2011. Per l&#39;analisi di immunofluorescenza di tessuti ghiandolari embrionali si rimanda ai seguenti citazioni: Hoffman et al, (2002) e Steinberg e.t al., (2005). </li></ol> 3. mouse postnatale e adulti ghiandole lacrimale (LG): Dissection <ol><li> Euthanize il mouse postnatale secondo gli standard del caso della commissione etica animale. Per cuccioli postnatale giorno 8 o più giovani, eutanasia tagliando la testa con le forbici sterili. Per giorno postnatale 8 o più anziani, spruzzare pelliccia con il 70% di etanolo. </li><li> Per individuare il LG, giaceva il mouse laterale all&#39;altro sotto un microscopio da dissezione con illuminazione dall&#39;alto. Nota: L&#39;LG post-natale e adulti sono confina con l&#39;arteria carotide, il muscolo massetere e il derma (vedi Figura 5). </li><li> Utilizzando piccole forbici dissezione, fare piccola incisione nell&#39;epidermide lateralmente da cui deve essere posizionato il LG. </li><li> Utilizzando pinze, aprire l&#39;epidermide verso l&#39;orecchio per esporre la LG. </li><li> Utilizzare pinze per allentare delicatamente LG dal tessuto circostante. </li><li> Una volta che la LG è liberato dal tessuto circostante, rimuovere con attenzione l&#39;LG dal condotto,afferrando dove il condotto e la epiteli circonda l&#39;occhio collegano (Figura 1). </li><li> Mettere enti locali in RNA tampone di lisi per RT-PCR, o fissare con 4% PFA per 20 minuti per immunocolorazione. </li></ol>

<ol><li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Current+allergy+and+asthma+reports%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).</li>
<li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).</li>
<li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes%3A+relevance+in+dry+eye+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li>
<li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li>
<li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).</li>
<li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li>
<li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development%3A+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li>
<li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnox%2C+SM+%22Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis%22">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis</a>. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).</li>
<li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+restrain+pancreas+branching%2C+differentiation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).</li>
<li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10%2FFGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11(2005).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La versatilità alla cultura e manipolare la LG ex vivo fornisce vantaggi significativi per lo studio del suo sviluppo. Ciò comprende la velocità alla quale il ricercatore è in grado di testare ipotesi e la moltitudine di perturbazioni che possono essere eseguite per valutare come epiteliale, neuronali, cellule endoteliali e mesencyhmal interagiscono per formare l&#39;organo. Tuttavia, ci sono una serie di avvertimenti quando si utilizza questo modello. In primo luogo, in virtù del suo isolamento ghiandola non è...

La ghiandola lacrimale (LG) è responsabile della secrezione lacrimale acquoso critico per l&#39;acuità visiva e la salute, la manutenzione e la protezione delle cellule della superficie oculare. LG risultati disfunzione in uno dei disturbi oculari più comuni e debilitanti: acquosa carente malattia dell&#39;occhio secco, che è caratterizzata da irritazione oculare, sensibilità alla luce e riduzione della visione 1. Nell&#39;essere umano LG risiede nell&#39;orbita sopra dell&#39;estremità laterale dell&#39;occhio dove che 3 - 5 escrezione lacrime deposito condotti sulla superficie oculare. Il mouse ha tre paia di ghiandole oculari, il più studiato dei quali è la ghiandola lacrimale (LG) anterior trova e ventrale per l&#39;orecchio (exorbital) con le lacrime agli occhi che viaggiano attraverso un unico condotto escretore. Simile ad altri organi ghiandolari, LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione in cui un singolo gemma epiteliale all&#39;interno di un mesenchima condensato sottoposto a vari cicli di gemme e la formazione del condotto di perm una rete interconnessa intricata di acini secretoria e condotti (Figura 1) 2. Durante lo sviluppo l&#39;epitelio viene vascolarizzato e fortemente innervato dai nervi parasimpatici del ganglio pterigopalatino e, in misura minore, da nervi simpatici del ganglio cervicale superiore 3. Interazioni tra ciascuno di questi tipi di cellule cioè cellule neuronali, epiteliali, endoteliali e mesenchimali, sono essenziali per la funzione e la manutenzione del tessuto adulto. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di coordinamento sviluppo LG e la rigenerazione e come tipo di comunicazione inter-cellulare guida questi processi rimane poco chiaro. L&#39;avvento della embrionali ex vivo le tecniche di coltura ha consentito l&#39;individuazione di percorsi di sviluppo e di rigenerazione in più organi di derivazione 4. Coltura ex vivo dà al ricercatore la possibilità di manipolare l&#39;organo (memeccanico, genetica o chimica) in condizioni definite, nonché per caratterizzare le interazioni sviluppo organo e cellula-cellula in tempo reale. La exorbital LG del mouse è altamente suscettibile di questa tecnica e studi recenti hanno definito i sistemi che regolano il suo sviluppo 2,5 segnalazione. Tuttavia, nonostante la necessità di comprendere segnali molecolari alla base dello sviluppo LG e la rigenerazione, attualmente rimane poco studiato, probabilmente a causa delle difficoltà tecniche di isolare l&#39;organo. In questo articolo, si descrive come isolare ed eseguire ex vivo cultura del embrionale murino LG per definire programmi di sviluppo.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 senza HEPES</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>P0781</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di albumina da siero bovino</td><td>A9576</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide 16% Soluzione</td><td>15710</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Diluito al 4% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato 10x</td><td>BP665-1</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato 1x</td><td></td><td></td><td>Preparato da 10x</td></tr><tr><td>stock olo-transferrina bovina T1283</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&nbsp; mg/ml di soluzione madre in acqua. Congelare le aliquote monouso a -20&nbsp; &deg;C. Aggiungere al supporto DMEM/F12 fino a una concentrazione finale di 50&nbsp; &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico (Vitamina C)</td><td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&nbsp; mg/ml di soluzione madre in acqua. Congelare le aliquote monouso a -20&nbsp; &deg;C. Aggiungere al supporto DMEM/F12 fino a una concentrazione finale di 50&nbsp; &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Piastre trattate con coltura tissutale BioLite da 100 mm</td><td>130182</td><td>Thermo Scientific</td> È <td>possibile utilizzare anche piastre trattate con coltura non tissutale.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio con illuminatore a tavolino</td><td>secondario Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi microscopio da dissezione stereo dotato di base a luce trasmessa.</td></tr><tr><td>Base illuminatore sottostadio per stereomicroscopio</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35&nbsp; Piastre trattate con coltura tissutale mm</td><td>353001</td><td>Corning</td><td>È possibile utilizzare anche piastre trattate con coltura non tissutale.</td></tr><tr><td>Piastre con fondo in vetro non rivestito da 50 mm</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza a campo largo</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>Qualsiasi microscopio a fluorescenza (verticale, invertito o stereodissecante a microscopio) può essere utilizzato per monitorare l'espressione della GFP a basso ingrandimento con una fotocamera digitale collegata.</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>La microscopia confocale è necessaria per vedere le strutture cellulari dettagliate. È possibile utilizzare qualsiasi microscopio confocale.</td></tr><tr><td>Pinze SWISS Micro-Fine, #5 (11.2&nbsp; cm)</td><td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>Per rimuovere il mesenchima dall'epitelio sono necessarie punte fini. Possono essere utilizzati anche aghi di tungsteno.</td></tr><tr><td>Pinze a punta standard Dumont, #5 (11&nbsp; cm)</td><td>91150-20</td><td>Strumenti per le scienze fini (USA), Inc.</td><td>Ideale per la raccolta di ghiandole da embrioni.</td></tr><tr><td>Manici di coltelli chirurgici in plastica riutilizzabili, stile n. 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgiche sterili in acciaio inossidabile, n. 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento RNAqueous-Micro Total RNA</td><td>AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg/ml stock diluito 1:1 con DMEM/F12</td></tr><tr><td>Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) topi</td><td></td><td>Charles River Labs</td><td>Gli embrioni vengono raccolti il giorno 14 (con il giorno della scoperta della spina designato come giorno 0).</td></tr><tr><td>Membrane idrofile incise con nucleopori, 0,1&nbsp; &mu; m dimensione dei pori, 13&nbsp; mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Timed-pregnant Pax6-Cre, topi GFP</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Topi opzionali per imparare a localizzare il LG.</td></tr></tbody></table>

manipolare il murino ghiandola lacrimale

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

La ghiandola lacrimale (LG) secerne lacrime acquose necessari a mantenere la struttura e la funzione della cornea, un tessuto trasparente essenziale per la visione. Nell&#39;essere umano un&#39;unica LG risiede nella orbita sopra l&#39;estremità laterale di ciascun occhio fornire lacrime alla superficie oculare attraverso 3 - 5 condotti. Il mouse ha tre paia di ghiandole oculari, il più studiato dei quali è la ghiandola lacrimale exorbital (LG) anterior posizionato e ventrale all&#39;orecchio. Simile ad altri organi ghiandolari, LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione in cui un singolo gemma epiteliale all&#39;interno di un mesenchima condensato sottoposto a vari cicli di gemme e di formazione condotto da formare una rete interconnessa intricata di acini secretori e condotti. Questo processo elaborato è stato ben documentato in molti altri organi epiteliali come il pancreas e ghiandole salivari. Tuttavia, la LG è stata molto meno esplorati e meccanismi che controllano la morfogenesi sono poco sottoc&#39;era. Abbiamo il sospetto che questo sotto-rappresentazione come sistema modello è una conseguenza delle difficoltà connesse con l&#39;individuazione, la dissezione e la coltura della LG. Così, qui descriviamo tecniche di dissezione per la raccolta embrionale e post-natale LG e metodi di coltura ex vivo del tessuto.

La LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione. Immagini in campo chiaro di enti locali embrionali sezionati a E14, E15, E16, E17, e P2 illustrano questo evento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600"> Figura 1. L'LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione. Immagini in campo chiaro di enti locali embr...

La ghiandola lacrimale (LG) è un organo di ramificazione che produce i componenti acquose di lacrime necessarie per il mantenimento della visione e la salute oculare. Qui si descrive murino LG dissezione ed ex vivo le tecniche di coltura di decifrare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di LG.

Manipolare il murino Ghiandola lacrimale

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare lo sviluppo della ghiandola lacrimale utilizzando un approccio ex vivo per la manipolazione e l'analisi degli eventi di segnalazione durante lo sviluppo della ghiandola. Ciò si ottiene sezionando prima le ghiandole lacrimali degli embrioni del 16° giorno. In una seconda fase, le ghiandole vengono poste su filtri, galleggianti in coltura, contenenti inibitori di piccole molecole o fattori di crescita che alterano lo sviluppo delle ghiandole lacrimali.Dopo 24 ore, le ghiandole sono fissate e immunocolorate per le proteine dello sviluppo di interesse. In definitiva, i cambiamenti nell'espressione proteica durante lo sviluppo ex vivo delle ghiandole lacrimali possono essere analizzati mediante microscopia immunofluorescente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo della ghiandola lacrimale.Ad esempio, quali sono i meccanismi di segnalazione che definiscono la ghiandola lacrimale? Morfogenesi La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la ghiandola lacrimale è difficile da riconoscere durante lo sviluppo embrionale precoce senza una guida visiva e una pratica per localizzarla. Per prelevare la ghiandola lacrimale da un topo embrionale, utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare il lato ventrale di un giorno embrionale, da 14 a 16 topi gravidi.Quindi pizzicare la pelle e tagliare la pelle lungo la linea mediana dell'animale per esporre il peritoneo, tagliare il peritoneo per esporre la cavità addominale e il miometrio e rimuovere entrambe le corna del miometrio e metterla in PBS freddo. Successivamente, utilizzare la pinza numero cinque per trasferire gli embrioni dalle sacche amniotiche in una seconda capsula di Petri sterile contenente PBS freddo, facendo attenzione a non toccare gli occhi o la zona della testa. Dopo aver reciso la testa dal busto, appena sotto la mandibola inferiore, ruotare la testa in modo che la mandibola si trovi ora sulla piastra di dissezione.Quindi usa una pinza per stabilizzare la testa e un bisturi per rimuovere circa un quarto del lato dorsale del cervello, orienta la testa in modo che il bisturi possa perforare il naso tra gli occhi, quindi fai un taglio attraverso il centro della testa in modo che gli occhi siano ora su metà separate. Successivamente, utilizzando l'illuminazione sopra e sotto, afferra la pelle dall'angolo inferiore posteriore dell'occhio e tira con cura la pelle con le pinze per esporre la ghiandola lacrimale, che dovrebbe apparire come un germoglio su un condotto all'interno di un mesenchima condensato più scuro. Sezionare con cura la ghiandola lacrimale e il mesenchima associato lontano dal tessuto circostante, facendo attenzione a non afferrare la ghiandola lacrimale o il suo dotto associato.Quindi, una volta che la ghiandola lacrimale è libera dal tessuto circostante, afferrare delicatamente l'epiteliale che circonda l'occhio alla base del dotto della ghiandola lacrimale e rimuovere l'intera ghiandola. Fate attenzione a preservare il Meen chi che circonda l'epitelio, che può essere osservato come un tessuto condensato in cui l'epitelio si invagina. Quindi coltivare da quattro a cinque ghiandole lacrimali per un filtro in una capsula di Petri contenente terreno di coltura e inibitori di piccole molecole o fattori di crescita di interesse per 24 ore per raccogliere la ghiandola lacrimale da un topo postnatale o adulto, spruzzare prima la zona degli occhi con etanolo al 70%.Quindi posizionare l'animale con il lato laterale rivolto verso l'alto sotto un microscopio da dissezione con illuminazione dall'alto. Quindi, usa piccole forbici da dissezione per praticare un'incisione nell'epidermide lateralmente da dove dovrebbe essere posizionata la ghiandola lacrimale. Quindi aprire l'epidermide verso l'orecchio per esporre la ghiandola lacrimale, che nel topo postnatale e adulto è delimitata dall'arteria carotide, dal muscolo maced e dal derma Allentare delicatamente la ghiandola lacrimale dal tessuto circostante con la pinza, e poi una volta che la ghiandola lacrimale viene rilasciata dalla presa del tessuto circostante, dove il dotto e l'epitelio che circonda l'occhio si collegano e rimuovono con cura la ghiandola.Infine, fissare le ghiandole lacrimali con para formaldeide al 4% per 20 minuti prima della colorazione immunologica. Per le proteine dello sviluppo di interesse, la ghiandola lacrimale si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificata. Queste immagini in campo chiaro delle ghiandole lacrimali embrionali, sezionate nei giorni embrionali 14, 15, 16, 17 e nel secondo giorno postnatale, illustrano questo processo.Si noti che all'aumentare delle dimensioni dell'epitelio, la quantità di mesenchima diminuisce come illustrato in queste immagini. Le ghiandole lacrimali si sviluppano in condizioni di coltura in vivo in modo simile a quelle delle colture di ghiandole in vivo, e le ghiandole lacrimali appena sezionate possono essere fissate per l'analisi in immunofluorescenza. Ad esempio, in questa immagine, la colorazione dei nervi dell'epitelio e dei vasi sanguigni.In un embrione, una ghiandola lacrimale 16 da un embrione di MC wild type si può osservare l'espressione di GFP nella ghiandola lacrimale da parte di topi PAC sei CRE postnatali o adulti facilita una rapida identificazione e dissezione della ghiandola lacrimale da questi animali transgenici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo della ghiandola lacrimale, può essere applicato anche ad altri sistemi come la disfunzione della ghiandola lacrimale dovuta a malattie autoimmuni o al trattamento con irradiazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come localizzare e isolare la ghiandola lacrimale murina per l'analisi della coltura ex vivo.

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video descrive la procedura chirurgica per rimuovere le due parti: palpebrale e orbitale della ghiandola lacrimale superiore da un coniglio per creare un modello di malattia dell'occhio secco. Questo modello di coniglio è adatto per studi sull'omeostasi della superficie oculare, sulla fisiopatologia e sulle terapie oculari.

Rimozione della ghiandola lacrimale superiore: una tecnica chirurgica per rimuovere le parti palpebrale e orbitale della ghiandola lacrimale superiore dal modello di coniglio

In questo video, descriviamo una procedura chirurgica per rimuovere la grande ghiandola lacrimale inferiore da un modello di coniglio per studiare l'effetto sulla produzione di lacrime nell'animale.

Rimozione della ghiandola lacrimale inferiore dal modello di coniglio: una procedura chirurgica per rimuovere la ghiandola lacrimale inferiore più grande dall'orbita dell'occhio del coniglio

Questo video descrive la procedura per indurre la malattia dell'occhio secco in un modello di coniglio attraverso un'iniezione di Concanavalina A nel lobo orbitale della ghiandola lacrimale superiore. Il modello sviluppato è utile per studiare l'efficacia di vari farmaci per il trattamento della malattia dell'occhio secco.

Esecuzione dell'iniezione nel lobo orbitale della ghiandola lacrimale superiore: una tecnica per indurre la malattia dell'occhio secco nel modello di coniglio

La ghiandola lacrimale (LG) ha due tipi di cellule che esprimono α-liscio muscolo actina (αSMA): cellule miepiteliali (MECs) e pericytes. I MECs sono di origine ectodermica, trovati in molti tessuti ghiandolari, mentre i periciti sono cellule muscolari lisce vascolari di origine endodermica. Questo protocollo isola i MECs e i periciti di murine LGs.

Isolamento delle cellule Miepiteliali da adulti murina lacrimale e ghiandole sottomandibolari

Questo articolo descrive lo sviluppo di un metodo per indurre la malattia dell'occhio secco acuta o cronica nei conigli iniettando il concavenavalin A a tutte le porzioni del sistema di ghiandola lacrimale orbitale. Questo metodo, superiore a quelli già segnalati, genera un modello riproducibile e stabile di occhio secco adatto allo studio degli agenti farmacologici.

Un modello di coniglio di malattia dell'occhio secco acquosa-decisa indotta da Concanavalin Un'iniezione nelle ghiandole lacrimali: applicazione agli studi sull'efficacia dei farmaci

Viene presentato un nuovo approccio per indurre la malattia cronica dell'occhio secco nei conigli rimuovendo chirurgicamente tutte le ghiandole lacrimali orbitali. Questo metodo, distinto da quelli precedentemente riportati, produce un modello stabile e riproducibile di un occhio secco carente acquoso adatto allo studio della fisiologia lacrimale e della fifisiologia e terapia oculare.

Istituzione di un modello di occhio secco severo utilizzando la dacrigofectomia completa nei conigli

Il metodo di coltura tridimensionale privo di siero per le cellule staminali adulte della ghiandola lacrimale (LG) è ben consolidato per l'induzione della formazione di organoidi LG e la differenziazione in cellule acinari o duttali.

Sistema di coltura tridimensionale privo di siero per cellule staminali della ghiandola lacrimale

Questo protocollo descrive come stabilire, mantenere, modificare geneticamente, differenziare, caratterizzare funzionalmente e trapiantare organoidi della ghiandola lacrimale derivati da topi primari e tessuti umani.

Istituzione, mantenimento, differenziazione, manipolazione genetica e trapianto di organoidi di topo e ghiandola lacrimale umana

Qui, stabiliamo un modello di ratto di disfunzione della ghiandola lacrimale per fornire una base per lo studio dell'occhio secco con deficit acquoso.

Un modello di occhio secco di ratto con disfunzione della ghiandola lacrimale indotta dalla scopolamina

Qui, presentiamo un metodo per stabilire un modello murino di occhio secco con carenza acquosa asportando le ghiandole lacrimali extraorbitali e infraorbitali e valutare i cambiamenti nella superficie oculare nell'occhio secco con deficit acquoso.

Istituzione di un modello murino di carenza acquosa di occhio secco

Impara a dissecare e coltivare ex vivo la ghiandola lacrimale murina per analizzare lo sviluppo embrionale e le vie di segnalazione. Questo metodo consente di studiare l'espressione proteica mediante microscopia a immunofluorescenza.

Manipolare il murino Ghiandola lacrimale

Esplora altri video