Name: Preparazione di un Sangue cultura pellet per il Rapid batterica identificazione e test di sensibilità agli antibiotici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Impara a preparare un pellet batterico da emocolture positive per l'identificazione rapida con MALDI-TOF e i test di sensibilità agli antibiotici. Questo metodo riduce i tempi diagnostici migliorando la gestione clinica delle infezioni del sangue.

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Ringraziamo i tecnici del laboratorio di batteriologia del Centro Ospedaliero Universitario di Losanna per il loro aiuto per attuare le tecniche in laboratorio.

Questo protocollo è stato sviluppato e validato seguendo i processi di ricerca e sviluppo e le regole etiche della nostra istituzione, prima di essere implementato come strumento di routine. 1 Preparazione di una cultura Sangue batterica pellet da Ammonio Cloruro Procedura eritrociti-lisi <ol><li> Preparazione di una coltura ematica positiva per la successiva centrifugazione. <ol><li> Sterilizzare il tappo cultura del sangue. Aggiungere etanolo al 70% sul tappo della bottiglia e bruciarlo. NOTA: Non eseguire questo passaggio sotto una cappa a flusso laminare. </li><li> Spostare la bottiglia di una cappa a flusso laminare. Raccogliere 5 ml della coltura di sangue con una siringa da 20 G. </li><li> Aggiungere i 5 ml di coltura di sangue in un tubo da centrifuga da 50 ml contenente 45 ml di acqua sterile (H 2 O) e miscelare il campione. </li></ol></li><li> Preparazione di una coltura sangue pellet batterico per lisi centrifugazione. <ol><li> Centrifugare il campione a 1000 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Remove il surnatante (contenente principalmente H 2 O e cellule del sangue) con una pompa a vuoto laboratorio. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di fatto in casa di cloruro di ammonio Soluzione di Lisi (0,15 M NH 4 Cl, 1 KHCO mm 3). Abbattere il pellet mediante raschiatura e vortex la provetta e centrifugare il campione a 140 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante contenente principalmente detriti globuli rossi. <ol><li> Se il pellet rimasto emorragica, risospendere il pellet in 2 ml di acqua distillata sterile e H 2 0 per lisare i globuli rossi ulteriori residui e lavare il pellet. Centrifugare il campione a 140 xg per 10 min a RT e scartare il surnatante. </li></ol></li><li> Risospendere il pellet in 200 ml di H 2 O </li></ol></li><li> Subculture della cultura sangue su vari supporti agar selettivo e non selettivo. <ol><li> Raccogliere 1 ml della cultura di sangue con una siringa da 20 G. </li><li> Inoculare 1 goccia di sangue cultura into quattro quadranti su agar sangue, agar cioccolato, McConkey agar e agar Schaedler. </li><li> Incubare a 37 ° C l&#39;agar sangue e piastre di agar cioccolato in una atmosfera di CO 2 5%, l&#39;agar McConkey in ambiente normale, e la piastra di agar Schaedler in condizioni anaerobiche. </li><li> Seguire la crescita batterica sui diversi media. </li><li> Verificare la purezza batterica. </li></ol></li></ol> 2 Identificazione mediante MALDI-TOF MS <ol><li> Identificazione diretta dal pellet sangue. <ol><li> Trasferire 1 ml di pellet di sangue su una piastra segnale MALDI e lasciarlo asciugare su una piattaforma di riscaldamento 42 ° C. </li><li> Sovrapporre il campione con 1 ml del 70% di acido formico e lasciarlo asciugare su una piattaforma di riscaldamento 42 ° C. </li><li> Sovrapporre il campione con 1 ml di matrice MALDI (soluzione satura di α-ciano-4-idrossicinnamico acido nel 50% acetonitrile-2.5% di acido trifluoroacetico) e lasciarlo asciugare su una piattaforma C di riscaldamento 42 °. </li><li> Procedere alla MALDI-TOF MS analisi di un sistema MALDI-TOF MS, come descritto dai produttori. </li><li> Se il punteggio di identificazione non è valida a livello di specie (ad esempio con un punteggio &lt;2), eseguire una estrazione di proteine ​​del campione di pellet di sangue. </li></ol></li><li> Identificazione dopo l&#39;estrazione di proteine ​​dal sangue pellet cultura. <ol><li> Mescolare 20 ml di pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 13.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante e aggiungere 25 ml di 70% di acido formico e 25 ml di acetonitrile 100% al pellet. Vortex vigorosamente per risospendere il pellet. Risospendere pellet difficili da rompere giù con puntali delle pipette prima di vortex. </li><li> Centrifugare a 13.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Trasferire 1 ml di surnatante (che contengono proteine ​​estratte) su una piastra segnale MALDI e lasciarlo asciugare su una piattaforma di riscaldamento 42 ° C. Procedere come descritto in 2.1.2. </li></ol></li></ol> 3. batterica Identificazione e antibiotici test di suscettibilità con un sistema automatizzato microbica <ol><li> Preparazione di una sospensione batterica di identificazione batterica e AST con un sistema automatizzato microbica. <ol><li> Preparare una provetta di plastica contenente 3 ml di soluzione sterile 0,45% NaCl compatibile con il sistema automatizzato microbica. </li><li> Aggiungere un volume sufficiente di pellet cultura sangue nella soluzione di NaCl 0,45% per ottenere una sospensione batterica corrispondente ad una torbidità McFarland di 0,6 e 0,8. Misurare la torbidità utilizzando una macchina densitometro. NOTA: Il volume del pellet batterico coltura sangue varia da 50 a 200 microlitri per ottenere una torbidità McFarland di 0,6 e 0,8. </li></ol></li><li> Inoculare i Gram-positivi (GP) o Gram-negativi (GN) schede automatizzate per l&#39;identificazione e le schede AST automatizzati per i test di sensibilità antimicrobica di cocchi Gram-positivi e Gram-negativi batteri come descritto dal produttore. NOTA: IDENTIFICAZIONEn con il medico di famiglia o carte GN non si applica se il MALDI-TOF MS valore punteggio di identificazione è&gt; 2. Controllare la purezza della sospensione batterica subcoltura la sospensione batterica su agar sangue (GP e GN) e MacConkey agar (GN) piatti. </li></ol> 4. antibiotici test di suscettibilità da Disk Diffusion Assay Il test di diffusione del disco è descritto dal Comitato europeo sui test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST, versione 3.0, aprile 2013, www.eucast.org). <ol><li> Preparazione di una sospensione batterica di eseguire il test di sensibilità antimicrobica mediante saggio disco-diffusione. <ol><li> Preparare un tubo di vetro contenente 3 ml di soluzione di NaCl allo 0,9% sterile. </li><li> Aggiungere un volume sufficiente di pellet cultura sangue nella soluzione di NaCl allo 0,9% per ottenere una sospensione batterica corrispondente ad una torbidità McFarland 0,5. Misurare la torbidità utilizzando una macchina densitometro. NOTA: Il volume della coltura sanguepellet batterico varia da 50 a 200 microlitri per ottenere una torbidità McFarland di 0,6 e 0,8. </li><li> Agitare la sospensione batterica. </li></ol></li><li> Inoculazione di sospensione batterica su agar Mueller-Hinton (MH) o Mueller-Hinton agar-agar esigenti organismi (MHF) (MH integrato con 5% di sangue defibrinato di cavallo e 20 mg / L di β-nicotinamide adenina dinucleotide). <ol><li> Immergere un tampone di cotone sterile nella sospensione batterica e rimuovere delicatamente il liquido in eccesso ruotando il tampone sulla parete interna del tubo di vetro. </li><li> Distribuire la sospensione batterica in modo uniforme su tutta la superficie della piastra di agar MH / MHF tamponando in tre direzioni o utilizzando una piastra rotatore automatizzato. </li></ol></li><li> Applicazione di dischi antimicrobici su piastre di agar inoculate. <ol><li> Applicare da vicino i dischi sulla superficie delle piastre di agar inoculate secchi manualmente o utilizzando un dispenser disco di suscettibilità. </li><li> Incubare la piastra a tempe appropriatoratura e l&#39;atmosfera come descritto nel metodo di diffusione su disco EUCAST test di suscettibilità antimicrobica (Versione 3.0, aprile 2013, www.eucast.org). </li></ol></li></ol> 5. Automated PCR-based Test diagnostico per la rilevazione di MRSA <ol><li> Usando una micropipetta, trasferire 50 ml di pellet cultura di sangue nel flacone di reagente esempio fornito con l&#39;MRSA automatizzato kit diagnostico basato su PCR e vortex per 20 sec. </li><li> Usando una micropipetta 1 ml, dispensare il campione nella porta campione della cartuccia. Inserire la cartuccia nel sistema PCR automatico e avviare il test come descritto dal produttore. </li></ol>

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<li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Rispetto a emocoltura positiva approcci diagnostici convenzionali, la rapida acquisizione di un pellet batterico utilizzando il cloruro di lisi approccio centrifugazione ammonio ridurre il tempo di segnalare l&#39;identificazione da 16 a 24 ore e il tempo di riferire AST per 24 per 48 ore (figure 1 e 3). Rapida introduzione di un&#39;appropriata terapia antibiotica è fondamentale per migliorare la prognosi dei pazienti affetti da infezioni del sangue. Così, l&#39;identificaz...

Infezioni del sangue e sepsi nei pazienti ospedalizzati sono una delle principali cause di morbilità e mortalità. Così, la mortalità correlata al flusso sanguigno infezioni si osserva in circa il 14% al 37% dei pazienti ricoverati in ospedale e può aumentare fino al 35% in unità di terapia intensiva dei pazienti 1-3. La rapida identificazione dell&#39;agente infettivo è fondamentale per guidare il trattamento antimicrobico ottimale e di aumentare il buon esito della terapia antimicrobica 4,5. La rapida analisi delle macchie di Gram da emocoltura positiva ha già un impatto significativo sull&#39;adattamento della terapia antimicrobica 6,7 ma accurata identificazione dell&#39;agente infettivo è tenuto a fornire il trattamento antibiotico più adatto ai pazienti. Per esempio, diversi regimi di trattamento antibiotico deve essere attuato a seguito batteriemia con enterococchi e streptococchi che sono difficili da distinguere da colorazione di Gram. Allo stesso modo, l&#39;identificazione alle specie Level è tenuto a rilevare enterobatteri Gram negativi che codifica per una cromosomico AMPC gene che conferisce una maggiore resistenza ai β-lattamici 8. Con una emocoltura positiva, l&#39;approccio diagnostico convenzionale è di sottocultura l&#39;agente infettivo su diverse piastre di agar, che richiede diverse ore di incubazione supplementare prima identificazione con vari metodi tra cui i test biochimici, la crescita su diversi terreni selettivi e di sistemi di identificazione microbica automatizzati. Il tempo per i risultati di un approccio diagnostico convenzionale è di circa 1 a 3 giorni. L&#39;emergere della tecnologia matrix-assisted laser desorbimento / spettrometria di massa a ionizzazione a tempo di volo (MALDI-TOF) per una rapida identificazione dei microrganismi ha fornito un nuovo strumento per identificare rapidamente microrganismi da colonie cresciute su piastre di agar, ma anche direttamente dal sangue positivo culture (Figura 1) 9-12. The l&#39;uso di MALDI-TOF per identificare un agente infettivo da colture di sangue ha ridotto significativamente il tempo di risultati per alcuni minuti invece delle ore e dei giorni richiesti dai metodi tradizionali. Come discusso da Croxatto et al. 13, l&#39;efficienza di identificazione MALDI-TOF si basa su diversi parametri compresa la purezza e la quantità del microrganismo. Questi due criteri sono facilmente ottenuti da colonie discrete cresciute su piastre di agar, ma richiedevano un trattamento pre-analitico per l&#39;arricchimento batterica e purificazione da campioni complessi come la cultura del sangue, che contengono più componenti cellulari e proteine ​​che possono interferire con l&#39;identificazione MALDI-TOF. Metodi di isolamento vari microrganismi &#39;di coltura sangue sono stati utilizzati in un certo numero di studi inclusi saponina o altro metodo detergenti delicati per l&#39;estrazione batterica 9,14, siero metodo separatore 10, lisi metodi di centrifugazione 12 </sup&gt; e soluzioni commercialmente, come il kit sepsityper. Il nostro laboratorio diagnostico batteriologico ha sviluppato un semplice sangue-coltura preparazione pellet batterico base di cloruro di ammonio eritrociti-lisi che consentono rapida identificazione di batteri e lieviti mediante MALDI-TOF e sistemi di identificazione automatizzati (Figura 2) 15. Questa preparazione sangue-cultura pellet anche fornire un campione per altre applicazioni a valle diretti come colorazione di Gram, test automatizzati basati sulla PCR diagnostici come POCT-PCR per il rilevamento rapido di meticillino-resistente Staphyloccocus aureus (MRSA), e test di sensibilità agli antibiotici con sistemi automatizzati di AST e / o mediante saggi di diffusione del disco su piastre di agar (Figura 3). In questo lavoro, descriviamo le fasi per la preparazione del pellet batterico sangue-cultura come spiegato da Prod&#39;hom et al. 15 (Figura 4). Ci sarà anche descrivano i protocolli per tre delle principali applicazioni che possono essere eseguite sul pellet cultura del sangue: Identificazione mediante MALDI-TOF 15, di identificazione (ID) e test di sensibilità agli antibiotici (AST) con i sistemi automatizzati 16 per Enterobacteriaceae e stafilococchi e PCR-automatizzato test diagnostico basato per la rilevazione di MRSA 17.

<table><tbody><tr><td>Ago da 20 G</td><td>Terumo, Leuven, Belgio</td><td>NN-2038R</td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 50 ml</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352070</td><td>Provette da centrifuga da 50 ml</td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>101145</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato acido di potassio</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>60340</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>F0507</td><td>Infiammabile, corrosivo&</td></tr><tr><td>#945;-Acido ciano-4-idrossicinnamico</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>70990</td><td>Tossicità acuta</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>271004</td><td>Infiammabile, tossicità acuta Acido</td></tr><tr><td>trifluoroacetico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>T6508</td><td>Corrosivo, tossicità acuta</td></tr><tr><td>Vitek 2 60 strumento</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>27202</td><td>strumento automatizzato per il sistema microbico</td></tr><tr><td>Vitek 2 Scheda Gram-positiva (GP)</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>21342</td><td>carta d'identità GP&nbsp; automatizzata</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-P580 carta</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>22233</td><td>sistema AST microbico automatizzato</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram-negativi (GN) card</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>21341</td><td>carta d'identità GN&nbsp; automatizzata</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-N242 carta</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>413391</td><td>sistema AST microbico automatizzato</td></tr><tr><td>Xpert MRSA</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA&</td><td>nbsp; GXMRSA-100N-10</td><td>tecnologia di amplificazione degli acidi nucleici MRSA</td></tr><tr><td>GeneXpert IV strumento</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td><td>GXIV-4-D</td> strumento per la <td>tecnologia di amplificazione degli acidi nucleici</td></tr><tr><td>Microflex LT MALDI-TOF MS strumento</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Germania</td><td>BDAL microflex LT/SH</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 target steel BC</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Germania</td><td>280799</td><td>MALDI target plate</td></tr><tr><td>Densitometro Densicheck instrument</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>27208</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Sepsityper kit 50</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Germania</td><td>8270170</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey agar</td><td>Biolife, Milano, Italia</td><td>4016702</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton agar</td><td>Oxoid, Hampshire, Inghilterra</td><td>CM0337</td><td>Mueller-Hinton agar (MH)&nbsp;</td></tr><tr><td>MHF agar</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Francia</td><td>43901</td><td>Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)</td></tr><tr><td>BD columbia III agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254071</td><td>sangue agar</td></tr><tr><td>BD cioccolato agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254089</td><td>cioccolato agar</td></tr><tr><td>BD schaedler agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254084</td><td>Schaedler agar</td></tr></tbody></table>

preparazione di un sangue cultura pellet per il rapid batterica identificazione e test di sensibilità agli antibiotici

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Infezioni del sangue e sepsi sono una delle principali cause di morbilità e mortalità. Il buon esito dei pazienti affetti da batteriemia dipende da una rapida identificazione dell&#39;agente infettivo per guidare il trattamento antibiotico ottimale. L&#39;analisi delle macchie di Gram da emocoltura positiva può essere rapidamente condotto e già un impatto significativamente il regime antibiotico. Tuttavia, l&#39;accurata identificazione dell&#39;agente infettivo è ancora necessaria per stabilire il trattamento ottimale mirato. Presentiamo qui una preparazione pellet batterico semplice e veloce da una cultura del sangue positivo che può essere utilizzato come campione per diverse applicazioni a valle essenziali quali l&#39;identificazione mediante MALDI-TOF MS, test di sensibilità agli antibiotici (AST) mediante saggio di diffusione del disco o sistemi automatizzati AST e automatizzato PCR-based test diagnostici. Le prestazioni di questi diversi sistemi di identificazione e AST applicati direttamente sulle emocolture pellet batterico è molto SImilar alla performance, normalmente ottenuto da colonie isolate cresciute su piastre di agar. Rispetto ai metodi tradizionali, la rapida acquisizione di un pellet batterico riduce notevolmente il tempo di segnalare sia l&#39;identificazione e AST. Così, seguendo la cultura positività del sangue, l&#39;identificazione mediante MALDI-TOF può essere segnalato in meno di 1 ora, mentre i risultati di AST da sistemi automatizzati o AST test di diffusione del disco entro 8 a 18 ore, rispettivamente. Allo stesso modo, i risultati di un test rapido basato su PCR possono essere comunicati ai medici meno di 2 ore a seguito della relazione di una batteriemia. Insieme, questi risultati dimostrano che la rapida preparazione di un pellet batterico cultura del sangue ha un impatto significativo sulla identificazione e AST turnaround tempo e quindi sul buon esito dei pazienti affetti da infezioni del sangue.

Nello studio effettuato da Prod'hom et al. 15, pellet batterici ottenuti da cloruro di ammonio lisi centrifugazione di 122 emocoltura positiva da 78 pazienti sono stati analizzati mediante MALDI-TOF MS. Su 122 emocoltura positiva, 95 (77,9%) sono stati correttamente identificati a livello di specie e uno (0,8%) a livello di genere. I restanti 26 (21,3%) Pellets emocoltura non hanno dato un'identificazione affidabile mediante MALDI-TOF. Tra questi, 21 sono stati i batteri Gram-positivi, tra cui 13 str...

Una rapida preparazione pellet batterico da una emocoltura positiva può essere utilizzato come campione per le applicazioni quali l&#39;identificazione mediante MALDI-TOF, colorazione di Gram, test di sensibilità agli antibiotici e test di PCR-based. I risultati possono essere tempestivamente ai medici di migliorare la prognosi dei pazienti affetti da infezioni del sangue.

Preparazione di un Sangue cultura pellet per il Rapid batterica identificazione e test di sensibilità agli antibiotici

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare un pellet batterico da una coltura di sangue positiva che può essere utilizzato come campione per varie applicazioni. Ciò si ottiene mescolando prima un'emocoltura positiva con acqua sterile dopo la centrifugazione. Il pellet viene risospeso in cloruro di ammonio per eliminare i globuli rossi dopo un secondo ciclo di centrifugazione.Il pellet viene risospeso in acqua. Il passaggio finale consiste nell'utilizzare il pellet ottenuto per l'identificazione batterica mediante ionizzazione a desorbimento laser assistito da matrice, tempo di volo, colorazione di Gram, test di suscettibilità agli antibiotici e/o test basati sulla PCR. In definitiva, i risultati acquisiti possono essere rapidamente comunicati ai medici per migliorare l'esito dei pazienti affetti da infezioni del flusso sanguigno.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la sottocoltura batterica di emocolture positive, è quello di ridurre l'identificazione batterica di circa 6-24 ore e di ridurre il tempo necessario per ottenere i risultati della resistenza agli antibiotici di circa 24 ore. Questo metodo può aiutare ad adattare rapidamente il trattamento antibiotico e a migliorare l'esito dei pazienti affetti da infezioni del flusso sanguigno. Sebbene questo metodo possa essere applicato a metodi di identificazione di routine come l'OV e agli approcci convenzionali di test di sostenibilità antimicrobica, può anche essere applicato a nuove tecnologie che mirano alla determinazione dei fattori VUL e/o di meccanismi resistenti come le attività di ESBL e CARBAPENEMASI.La dimostrazione visiva di questo metodo è importante poiché la preparazione del PAL batterico è fondamentale per ottenere materiale microbico sufficiente per le applicazioni a valle, a dimostrare la procedura saranno Christian Durel, Maria Cortesi, Maria Ti e Kim Giza, tutti tecnici di laboratorio del mio laboratorio per preparare un'emocoltura positiva per la successiva centrifugazione. Sterilizzare il tappo dell'emocoltura aggiungendo il 70% di etanolo sul tappo della bottiglia e bruciandolo. Quindi spostare la bottiglia in una cappa a flusso laminare.Raccogliere cinque millilitri di emocoltura con una siringa ad ago calibro 20. Quindi, aggiungere i cinque millilitri di emocoltura a una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente 45 millilitri di acqua sterile e mescolare il campione. Centrifugare il campione a 1000 Gs per 10 minuti.A temperatura ambiente, rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto da laboratorio. Quindi risospendere il pellet in un millilitro di cloruro di ammonio fatto in casa. Soluzione lisizzante.Scomporre il pellet raschiando e agitando prima della centrifusione il campione a 140 g per 10 minuti A temperatura ambiente dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, che contiene principalmente detriti di globuli rossi. Se il pellet rimaneva emorragico Resus, sospendere il pellet in due millilitri di acqua sterile e distillata per ulteriori pidocchi globuli rossi residui e per lavare il pellet dopo aver centrifugato il campione come prima, scartare il surnatante, quindi risospendere il pellet in 200 microlitri di acqua e agitare la provetta per l'identificazione diretta dal pellet di sangue. Per prima cosa, trasferisci un microlitro di pellet su una piastra target MALDI e lascialo asciugare su una piattaforma riscaldante a 42 gradi Celsius.Sovrapporre il campione con un microlitro di acido formico al 70% e lasciarlo asciugare sulla piattaforma riscaldante. Successivamente, sovrapporre il campione con un microlitro di Maldi Matrixx e, di nuovo, lasciarlo asciugare sulla piattaforma riscaldante. Procedere all'analisi maldi TOF MS con un sistema MALDI TOF MS come descritto dai produttori.Se il punteggio di identificazione non è valido a livello di specie, eseguire un'estrazione proteica del campione di pellet di sangue mescolando prima 20 microlitri di pellet con un millilitro di etanolo al 70%. Quindi centrifugare il campione a 13.000 Gs per due minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante e aggiungere 25 microlitri di acido formico al 70% e 25 microlitri di nitrile 100% aceto al vortice del pellet energicamente per risospendere il pellet dopo la centrifugazione a 13.000 Gs per due minuti. A temperatura ambiente, trasferire un microlitro di surnatante su una piastra target MALDI e lasciarlo asciugare su una piattaforma riscaldante a 42 gradi Celsius.Per eseguire prima l'identificazione batterica e il test di sensibilità agli antibiotici o un ST, preparare una provetta di plastica contenente tre millilitri di soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,45% compatibile con il sistema microbico automatizzato. Aggiungere un volume sufficiente di pellet di emocoltura alla soluzione e al vortice per ottenere una sospensione batterica corrispondente a una torbidità di McFarland compresa tra 0,6 e 0,8 misurata utilizzando un densitometro. Quindi, inoculare le carte gram-positive o gram-negative automatizzate per l'identificazione.Inoculare anche le schede automatizzate a ST per i test di suscettibilità antimicrobica di cocchi gram-positivi e batteri gram-negativi, come descritto dal produttore. Per eseguire test di suscettibilità antimicrobica mediante saggio di diffusione del disco. Per prima cosa, prepara una provetta di vetro contenente tre millilitri di soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9%.Quindi aggiungere un volume sufficiente di pellet di emocoltura alla soluzione per ottenere una sospensione batterica corrispondente a una torbidità di McFarland di 0,5 misurata da una macchina densitometrica. Agitare la sospensione batterica per inoculare la sospensione batterica. Per prima cosa, immergi un batuffolo di cotone sterile nella sospensione batterica e rimuovi delicatamente il liquido in eccesso ruotando il tampone sulla parete interna del tubo di vetro.Quindi distribuire uniformemente la sospensione batterica su tutta la superficie di Mueller. Suggerimento e coclea o suggerimento e coclea Mueller per organismi esigenti tamponando in tre direzioni o utilizzando un rotatore di piastre automatizzato per l'applicazione di dischi antimicrobici su piastre a coclea inoculate. Innanzitutto, applicare strettamente i dischi sulla superficie delle piastre della coclea inoculate essiccate manualmente o utilizzando un erogatore di dischi di suscettibilità.Quindi incubare la piastra alla temperatura e all'atmosfera appropriate, come descritto nel metodo di diffusione su disco del comitato europeo per i test di suscettibilità antimicrobica, per eseguire il test diagnostico automatizzato basato sulla PCR. Innanzitutto, utilizzare una micropipetta per trasferire 50 microlitri di pellet di emocoltura nella fiala di reagente del campione fornita con il kit di test diagnostici automatizzati MSA basati sulla PCR. Quindi agitare la fiala per 20 secondi utilizzando una micropipetta da un millilitro.Erogare il campione nella porta del campione della cartuccia. Inserire la cartuccia nel sistema PCR automatizzato e avviare il test come descritto dal produttore nel laboratorio di Losanna. Il risultato viene convalidato e trasmesso direttamente ai medici grazie alla connettività del sistema PCR automatizzato utilizzato con un sistema di interfaccia di laboratorio o LIS.Se un risultato non è valido, si consiglia di ripetere il test dopo una diluizione di dieci volte del pellet batterico. Poiché ciò è spesso dovuto agli inibitori della PCR, l'emolisi del cloruro di ammonio ha prodotto un pellet di emocoltura di altissima qualità con pochi detriti eritrocitari rispetto al controllo negativo senza cloruro di ammonio. La colorazione di Gram dell'emocoltura positiva di Escher Coli coagulasi negativa stafilococco capita e streptococco del disco AE è stata eseguita prima e dopo la preparazione dell'emocoltura.La preparazione del pellet batterico del pellet utilizzando questo approccio consente di concentrare il microrganismo di circa 100-1000 volte. Nel complesso, ci sono diverse applicazioni a valle che possono essere eseguite a partire dal pellet di emocoltura, che beneficiano tutte di un tempo ridotto per ottenere risultati senza ridotta sensibilità e specificità rispetto ai saggi eseguiti su colonie isolate. Una volta padroneggiato il patè, la preparazione può essere eseguita in circa 30 minuti se eseguita correttamente.Non dimenticare che lavorare con l'emocoltura può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere precauzioni come lavorare con i guanti e sotto il cappuccio di flusso laina.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un protocollo rapido per l'identificazione diretta di Enterococcus faecalis ed Enterococcus altre specie da una emocoltura positiva con un Peptide Nucleic Acid test di ibridizzazione fluorescente in situ (FISH PNA).

Una procedura 1,5 ore per l&#39;identificazione di Enterococcus Specie Direttamente da emocolture

La progettazione di un semplice schema di un giorno di workflow per la diagnostica dei patogeni batterici permette il rapido riconoscimento di infezioni del sangue. L'inclusione di otto obiettivi clinicamente rilevanti batteriche ed i loro profili di resistenza agli antibiotici offre al medico una prima idea il giorno stesso, che può portare ad una terapia più adeguata.

Un giorno Scheme flusso di lavoro per batterica Rilevazione dei patogeni e test di resistenza antimicrobica dalle emocolture

Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Fonte: Koeth, L. M., et. al., Un metodo di microdiluizione del brodo di riferimento per i test di suscettibilità  in vitro della dalbavancina dei batteri che crescono aerobicamente. J. Vis. Exp. (2015).Questo video mostra il metodo di microdiluizione in brodo per determinare la concentrazione inibitoria minima (MIC) di un antibiotico lipoglicopeptidico contro i batteri Gram-positivi. Copre l'isolamento delle colonie batteriche, la diluizione, l'inoculazione di pozzetti per micropiastre con...

Un metodo di microdiluizione in brodo per i test di suscettibilità agli antibiotici dei batteri Gram-positivi

L'applicazione di desorbimento laser assistita da matrice tempo / ionizzazione di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa (MS) direttamente emocoltura brodo velocizza l'identificazione dei batteri. Il metodo proposto è un metodo rapido e affidabile per l'identificazione dei batteri Gram negativi direttamente dalla cultura sangue brodo.

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

Antimicrobica sinergia test viene utilizzato per valutare l'effetto di due o più antibiotici usati in combinazione e viene in genere eseguita da uno dei due metodi: la matrice della scacchiera o il dosaggio di time-kill. Qui, presentiamo un automatizzato, a getto d'inchiostro stampante-assistita scacchiera matrice sinergia tecnica e uno studio classico tempo-kill sinergia.

Antimicrobica sinergia test di stampante a getto d'inchiostro-assistita Checkerboard automatizzato matrice e il metodo di Time-kill manuale

Gli antibiotici fluorescenti etichettati con fluorescente sono potenti strumenti che possono essere utilizzati per studiare molteplici aspetti della resistenza agli antimicrobici. Questo articolo descrive la preparazione di antibiotici fluorescenti con tag e la loro applicazione allo studio della resistenza agli antibiotici nei batteri. Le sonde possono essere utilizzate per studiare i meccanismi di resistenza batterica (ad esempio, l'efflusso) mediante spettrofotometria, citometria di flusso e...

Visualizzazione della resistenza batterica utilizzando sonde antibiotici fluorescenti

Questo protocollo presenta test rapidi di suscettibilità antimicrobica (AST) entro 2,5 ore mediante imaging Raman scattering stimolato da singole cellule del metabolismo di D2O. Questo metodo si applica ai batteri nelle urine o nell'ambiente del sangue intero, che è trasformativo per l'AST fenotipico a singola cellula rapida nella clinica.

Test rapidi di sensibilità antimicrobica mediante imaging Raman scattering stimolato dell'incorporazione del deuterio in un singolo batterio

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di batteri resistenti agli antibiotici dall'acqua e la caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici (ARG). L'uso di tecniche basate su colture e non basate su colture (analisi metagenomica) fornisce informazioni complete sulla diversità batterica totale e sul pool totale di diversi ARG presenti nelle acque dolci di Mumbai, in India.

Isolamento e identificazione di batteri resistenti agli antibiotici trasportati dall'acqua e caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici

EUCAST ha sviluppato un protocollo di test di suscettibilità antimicrobica (AST) diretto per le emocolture automatizzate. Tuttavia, la sua dipendenza dall'identificazione microbica basata sulla spettrometria di massa può essere ovviata utilizzando un protocollo di preparazione diretta dell'inoculo in un sistema automatizzato di identificazione microbica. Questo approccio può fornire rapporti AST entro 24 ore dalla raccolta del campione.

Identificazione microbica diretta utilizzando un sistema automatizzato di identificazione microbica per facilitare il metodo RAST EUCAST senza spettrometria di massa

Impara a preparare un pellet batterico da emocolture positive per l'identificazione rapida con MALDI-TOF e i test di sensibilità agli antibiotici. Questo metodo riduce i tempi diagnostici migliorando la gestione clinica delle infezioni del sangue.

Preparazione di un Sangue cultura pellet per il Rapid batterica identificazione e test di sensibilità agli antibiotici

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