Singolo Aereo Illuminazione Module e approccio micro-capillare per un microscopio a largo campo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire la microscopia con illuminazione su un singolo piano utilizzando un modulo di eccitazione a foglio luminoso per microscopi invertiti e applicarlo a sferoidi cellulari tridimensionali. Ciò si ottiene utilizzando prima una pipetta per trasferire uno sferoide cellulare dal pozzetto di una piastra per microtitolazione a un secondo pozzetto per incubare dopo il lavaggio. Lo sferoide S viene quindi introdotto in un capillare rettangolare.

Il secondo passo consiste nel montare il modulo di illuminazione del foglio luminoso sulla piastra di base del tavolo di posizionamento del microscopio invertito. Successivamente, il capillare contenente lo steroide viene posto in uno speciale portacampioni per microscopia. Il passaggio finale consiste nell'impostare la corrispondenza tra il foglio luminoso e il piano focale della lente dell'obiettivo del microscopio nel percorso di rilevamento.

In definitiva, le misure di fluorescenza tridimensionale possono essere eseguite variando il piano focale all'interno dello sferoide cellulare per ottenere informazioni da singole immagini o Zacks riguardanti l'assorbimento di farmaci o la struttura dello sferoide S. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai microscopi a foglio ottico esistenti è che è economica e altamente versatile in quanto consiste in un modulo che può essere adattato a un microscopio esistente e offre un ampio grado di libertà per la ricerca. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla ricerca di farmaci e agenti utilizzati per la terapia e la diagnosi, in particolare, poiché l'adattamento del sistema microfluidico consente lo studio di processi rapidi in condizioni di flusso.

Ora questo metodo di eccitazione, in combinazione con qualsiasi tecnica di rilevamento, può fornire informazioni sugli steroidi a cellule vive a basse dosi di luce. Può essere applicato anche ad altri sistemi viventi come il pesce cipro, gli embrioni di artila e i campioni di tessuto ottico CLE. Per iniziare, aggiungere 50 microlitri di 1,5 aeros riscaldato in terreno di coltura in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e lasciarlo solidificare per una o due ore.

Quindi seminare circa 150 MCF sette cellule di cancro al seno in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti preparata S lordo per cinque o sette giorni, fino a un diametro di circa 200-300 micrometri in un incubatore al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius. Successivamente, incubare gli steroidi cellulari con l'antibiotico antraciclina doxorubicina cloridrato per sei ore a una concentrazione compresa tra due micromolari e otto micromolari in coltura. Terreno Dopo l'incubazione, lavare le cellule OID con una soluzione di coltura, terreno o sale di Earl's balance prima della microscopia.

Utilizzare un microscopio invertito e montare la microscopia a illuminazione su piano singolo o il modulo di eccitazione SPM sulla piastra di base del tavolo di posizionamento. Dotare il microscopio di una lente dell'obiettivo del microscopio con ingrandimento 10 o 20 volte e di un filtro passa-lungo appropriato nel percorso di rilevamento del microscopio. Quindi montare una telecamera integrata sulla porta di rilevamento del microscopio.

Utilizzare un raggio a fascio fascicolato parallelo di un laser o di un diodo laser con una lunghezza d'onda di eccitazione preferenzialmente di 470 nanometri e applicarlo al modulo di rotazione. Quindi, ruotare la lente cilindrica di 90 gradi, che trasferisce il foglio luminoso in posizione verticale per una regolazione assiale della vita del fascio luminoso. Posizionare un capillare contenente un liquido con un colorante fluorescente nel portacampioni.

Fissare il portacampioni con il capillare al tavolo di posizionamento del microscopio. Allineare la posizione del capillare in modo che sia centrato e che la vita del fascio luminoso del foglio luminoso sia a fuoco. Regolare la vita del fascio variando la posizione assiale della lente cilindrica stessa.

Ruotare indietro l'obiettivo dopo la regolazione. Posizionare lo steroide cellulare separatamente o in gruppi all'interno di capillari rettangolari in vetro silicato bo con una sezione trasversale interna di 600 per 600 micrometri e uno spessore della parete di 120 micrometri. Per ottenere ciò, prendere il capillare vuoto in posizione verticale con il pollice e il medio e sigillare l'apertura superiore con l'indice.

Avvicinare l'apertura inferiore allo sferoide cellulare nel liquido circostante, rilasciare l'indice dal liquido di apertura superiore con lo steroide dentro. Sarà immediatamente assorbito da forze capillari. Regolare la posizione dello sferoide S all'interno del capillare riempito per gravitazione.

In alternativa, applicare lo steroide sul capillare tramite pipettaggio. Fare attenzione che l'apertura della punta della pipetta sia da un lato sufficientemente grande per la dimensione dello sferoide S e, dall'altro, di dimensioni inferiori o uguali al diametro interno del capillare. Quindi posizionare il capillare contenente lo sferoide S in uno speciale portacampioni da microscopia.

Fissare il portacampione con il capillare al tavolo di posizionamento del microscopio e allineare la posizione dello steroide cellulare in modo che sia centrato e focalizzato. Impostare la corrispondenza tra il foglio luminoso e il piano focale della lente dell'obiettivo del microscopio nel percorso di rilevamento regolando la posizione dello specchio riflettente e della lente cilindrica. Riempire il capillare con siero fetale di vitello o FCS per 30 minuti per supportare la successiva adesione cellulare di uno steroide cellulare alla superficie interna del vetro.

Lasciare asciugare il rivestimento FCS rimanente nel capillare impoverito per almeno 12 ore dopo l'introduzione dello steroide cellulare nel capillare rivestito di FCS. Come prima, lasciare il capillare nell'incubatrice per altre due o quattro ore per provocare l'adesione cellulare dello steroide. Quindi, imposta la parte flx del sistema microfluidico, inclusa una trappola per bolle.

Utilizzare una pompa peristaltica per riempire il flusso del tubo con terreno di coltura contenente il colorante fluorescente, il farmaco o l'agente. Fissare prima il capillare privo di bolle al tubo di efflusso, quindi bloccare l'altro lato del capillare al tubo di scarico. Regolare la temperatura del liquido del bagnomaria sul valore desiderato.

Quindi regolare la pompa peristaltica alla velocità della pompa desiderata. Raccogli il liquido pompato in un recipiente con una configurazione a circuito aperto per l'acquisizione e l'analisi dei dati. Impostare la potenza del laser e il tempo di integrazione per l'acquisizione dell'immagine.

Impostare l'incremento per la pila ZS su un valore compreso tra cinque e 10 micrometri, che è preferibile per l'analisi tridimensionale dei dati. Poiché lo spessore del foglio leggero è di circa 10 micrometri, procedere all'esecuzione di misurazioni di singole immagini o Zacks mediante variazione del piano focale all'interno dello steroide cellulare. Viene mostrata una scansione di Zack di uno steroide mc a sette cellule precedentemente incubato con doxorubicina a otto micromolari per sei ore.

Le immagini forniscono informazioni dettagliate sull'assorbimento e la distribuzione cellulare della doxorubicina e la sua degradazione. Il prodotto all'interno dello strato cellulare esterno della doxorubicina fluorescente rossa steroidea è localizzato principalmente nel nucleo, mentre nelle aree interne dello sphe roide, la fluorescenza verde presentata da un prodotto di degradazione diventa dominante nella membrana cellulare. L'assorbimento del farmaco chemioterapico doxorubicina nella cellula S del carcinoma mammario umano nativo mc seven è raffigurato per un singolo strato cellulare selezionato da spm.

Dopo l'applicazione di due micromolari e del terreno di coltura all'interno del sistema di flusso, la fluorescenza rossa e verde della doxorubicina e del suo prodotto di degradazione è aumentata continuamente dopo l'applicazione di due micromolari di doxorubicina nel terreno di coltura all'interno del sistema di flusso, la fluorescenza rossa e verde della doxorubicina e del suo prodotto di degradazione è aumentata continuamente. Una volta masterizzato, bastano pochi minuti dal montaggio del modulo di eliminazione del foglio luminoso fino alla registrazione di immagini fluorescenti di campioni 3D. Quando si misura e si determinano le condizioni di flusso, è molto importante assicurarsi che il campione aderisca alla superficie interna del capillare ed evitare che bolle d'aria raggiungano il campione e possano staccarlo dal capillare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della microscopia a luce illuminata da foglio luminoso con il modulo versatile adattabile a vari microscopi.